副溶血性弧菌快速檢測(cè)研究進(jìn)展概要

1、作者單位：第一軍醫(yī)大學(xué)熱帶軍隊(duì)衛(wèi)生學(xué)系微生物學(xué)教研室，廣東廣州510515?綜述？副溶血性弧菌快速檢測(cè)研究進(jìn)展譚翰清，萬(wàn)成松中圖分類號(hào):Q939.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1671-5039（200401-0021-03副溶血性弧菌（vibrioparahaemolyticus,Vp是一種嗜鹽性細(xì)菌，屬弧菌科（Vibrio弧菌屬，主要存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚(yú)類、蝦類、貝類、牡蠣等海產(chǎn)品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海產(chǎn)品而引起中毒，在細(xì)菌性食物中毒中，比例高、危害大。目前，我國(guó)常規(guī)檢測(cè)方法大多要經(jīng)過(guò)前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定、神奈川現(xiàn)象和血清學(xué)反應(yīng)等過(guò)程，時(shí)56d

2、，檢出率低，疫、,近年來(lái)世界發(fā)病率呈上升趨勢(shì)1。因此，建立Vp快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏的檢測(cè)診斷方法是十分必要的。下面對(duì)副溶血性弧菌快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。1KP溶血試驗(yàn)副溶血性弧菌臨床分離株絕大部分都能產(chǎn)生耐熱直接溶血毒素（thermostabledirecthemolysin,TDH,并能在我萋血平板上產(chǎn)生一種特殊的溶血現(xiàn)象，叫做神奈川現(xiàn)象（kanawagaphenomenen,KP®該試驗(yàn)需經(jīng)過(guò)前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)后，挑取可疑菌落接種到我萋血平板上，置于37C孵箱中過(guò)夜，如菌苔周圍出現(xiàn)透明溶血環(huán)，即為KP陽(yáng)性，據(jù)此診斷樣本中含有Vp。該試驗(yàn)是檢測(cè)副溶血性弧菌最基

3、本的方法，能把絕大部分副溶血性弧菌檢測(cè)出來(lái)，但操作繁瑣、所需時(shí)間長(zhǎng)（約4d,而且存在部分TDH-株，易漏檢，給人們健康帶來(lái)危害。2免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于觀察、應(yīng)用廣泛。血清學(xué)反應(yīng)是最基本的免疫學(xué)反應(yīng)，主要用于細(xì)菌分型。目前，通過(guò)血清學(xué)反應(yīng)，Vp可分為13種O血清型、71種K血清型3。正確的分型為流行病學(xué)調(diào)查和臨床用藥提供依據(jù)。但此反應(yīng)只能大概區(qū)分不同地區(qū)和來(lái)源的菌株，而且由于抗原位點(diǎn)受環(huán)境等因素的影響易發(fā)生突變，出現(xiàn)新的血清型時(shí)4,以現(xiàn)有的血清檢測(cè)就會(huì)漏檢。目前,應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法是酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELIS

4、A。該,特異性好，靈敏Vp臨床分離株大多為TDH+株，TRH(ther2mostablerelatedhemolysin陽(yáng)性株只占10%15%,少數(shù)為TDH和TRH雙陽(yáng)性，環(huán)境分離株幾乎無(wú)TDH+5,6,所以大多研究者主要選擇TDH、TRH為抗原，制備相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。ELISA抗體的包被與固定是關(guān)鍵，影響檢測(cè)的靈敏度和特異性。Honda等7設(shè)計(jì)了一種新的固定方法，用HCl、聚乙烯(polythylenceimine,PEI、甲基乙烯基馬來(lái)酸酊聚合醴(malwicanhydridemethylvinylethercopolymer,MAMEC等化學(xué)試劑處理尼龍膜,接著固定包被TDH和TRH的

5、單克隆抗體，然后與Vp培養(yǎng)肉湯中TDH或TRH反應(yīng)15min,洗滌后，與抗TDH、TRH的兔血清多克隆抗體37C反應(yīng)15min,再與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔抗體IgG反應(yīng)，最后底物顯色。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)緊密相連的三次抗原抗體反應(yīng)，特異性100%,靈敏度9515%,并且通過(guò)肉眼觀察就能區(qū)分TDH和TRH株。同時(shí)，該尼龍膜也可以直接用于檢測(cè)糞便標(biāo)本，特異性達(dá)8819%,靈敏度達(dá)92%,并能在1h內(nèi)完成檢測(cè)。此固定方法減少非特異性吸附，增強(qiáng)抗體結(jié)合度，從而增強(qiáng)了特異性，提高了靈敏度。但是，這種方法涉及到抗體包被、固定、抗體的標(biāo)記、顯色等步驟，操作繁瑣，技術(shù)要求高，而且尼龍膜不能長(zhǎng)期保存，不能進(jìn)行大規(guī)模臨床

6、檢測(cè)。同時(shí)，直接檢測(cè)時(shí)，抗原量可能不足，抗原位點(diǎn)也容易改變，導(dǎo)致出現(xiàn)新的血清型，如近年來(lái)出現(xiàn)新的O3:K6血清型8,最終造成漏檢。？123核酸雜交免疫學(xué)方法是在蛋白水平檢測(cè)Vp,而核酸雜交則是在基因水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果更為特異、準(zhǔn)確、可靠。用于檢測(cè)Vp的核酸雜交方法主要有斑點(diǎn)雜交、Southern雜交、夾心法雜交。311斑點(diǎn)雜交1992年,Yamamoto等9針對(duì)tdh和trh101125bp的基因設(shè)計(jì)探針,對(duì)Vp進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，其中tdh探針基因序列為5'2ccccggttctgaXgagatattgtt23',trh探針基因序列為:5'2tccaggttcggaga

7、gctactatt23為dUTP,用于標(biāo)記堿性磷酸酶。他們將Vp臨床分離株的克隆基因片段點(diǎn)到尼龍膜，與探針在50C雜交10min,洗滌，最后底物顯色。結(jié)果顯示，tdh探針特異性為100%、靈敏度為93%;trh探針特異性為93%、靈敏度為86%。但是，tdh探針把部分弧菌科的其他細(xì)菌也檢測(cè)出來(lái)，造成一定的假陽(yáng)性，而且膜上核酸片段易脫落，不能長(zhǎng)期保存。312Southern雜交1998年,Suthienkul等6株進(jìn)行SKYEcoRI片段，長(zhǎng)pKY298的EcoRI片段，長(zhǎng)334bp,dUTP都標(biāo)記上地高辛。他們將菌株的DNA片段Hindm酶切、電泳、尼龍膜轉(zhuǎn)移后，與tdh、trh探針雜交，然后

8、與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體反應(yīng)，最后底物顯色。結(jié)果顯示，tdh和trh探針特異性好，把tdh十株（共127株和trh十株（共37株全部檢測(cè)出來(lái)。313夾心然而，這種方法操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)，不適合臨床實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)法雜交2003年,Lee等10采用夾心雜交法檢測(cè)海產(chǎn)品中Vp的tl基因。他們對(duì)微孔板進(jìn)行NH修飾,然后與tl基因捕獲探針的磷酸基團(tuán)共價(jià)結(jié)合,接著把PCR變性產(chǎn)物、標(biāo)記生物素的信號(hào)探針加到微孔板中進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗滌后，與酶標(biāo)鏈親和素結(jié)合，最后底物顯色并在405nm紫外燈下檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)信噪比在14114312之間，特異性好，靈敏度高，能把每克牡蠣組織里10個(gè)Vp檢測(cè)出來(lái)。

9、該方法易于制成試劑盒，目前，美國(guó)市場(chǎng)上已有銷售。由于試劑盒已經(jīng)把捕獲探針固定在微孔板上，檢測(cè)時(shí)只需把PCR產(chǎn)物加到微孔板中雜交就行了，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏度高，特異性好，能進(jìn)行臨床大規(guī)模的快速檢測(cè)，并且易于在普通實(shí)驗(yàn)室推廣。4PCR近年來(lái)，隨著微生物基因組學(xué)的發(fā)展，微生物基因檢測(cè)迎來(lái)了新的機(jī)遇。2000年,Makino等11已經(jīng)完成Vp的基因組測(cè)序,Vp毒力基因及特異的基因序列得到進(jìn)一步確定。根據(jù)Vp特異基因序列，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，是現(xiàn)階段檢測(cè)Vp的最快速準(zhǔn)確的方法。目前應(yīng)用于檢測(cè)Vp的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarilyprimedPCR,Ap2PCR、針對(duì)任意

10、引物PCR、多重PCR(multiplex2PCR、實(shí)時(shí)PCR(real2timePCR。411任意引物PCRMatsumoto等12采用任意引物PCR對(duì)Vp進(jìn)行檢測(cè)。他們針對(duì)Vp的tdh和trh基因一段特異的序歹！J,設(shè)計(jì)兩條引物，引物1:5'2ggtgcgggaa23引物2:5'2gtttcgctcc23對(duì)'19771998年所收集的227株Vp進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳分析發(fā)現(xiàn)，19961998年收集的22株血清型為03：K6菌株與1996年以前收集的03：K6,為03：K6血清型新出現(xiàn)的變異株，。這。1993tdh基因，因此絕大部分研究者都根據(jù)tdh設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異擴(kuò)

11、增年,Lee等13根據(jù)tdh基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)36株TDH+株、89株TDH-株以及46株其他弧菌和腸道菌進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，36株TDH+株全部特異擴(kuò)增出來(lái)，其余菌株都沒(méi)有擴(kuò)增；而檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)量可至40pgDNA,并可直接檢測(cè)糞便標(biāo)本，無(wú)需分離培養(yǎng)，方便快速。2gtcttctgacgoagttg1999年，Kim等14選擇toxR基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，523'和5'2atacgagtggttgctgtcatg23寸14株'Vp、14株其他弧菌進(jìn)行PCR。結(jié)果顯示，14株Vp都得到一條368bp的特異擴(kuò)增亮帶，而其他菌株沒(méi)有特異擴(kuò)增。此外，Venkates

12、waran等15選擇gyrB基因設(shè)計(jì)引物對(duì)Vp進(jìn)行PCR、Cordova等16選擇pR72H基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，特異性、靈敏度都很好。413多重PCR由于不是全部副溶血性弧菌都含tdh或trh基因，所以只針對(duì)tdh或trh的單一PCR，有時(shí)會(huì)漏檢。多重PCR(multiplex2PCR能全方面高效率地檢測(cè)Vp。1994年,Bej等5針對(duì)tl、tdh、trh設(shè)計(jì)不同的引物對(duì)，在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增tl、tdh、trh。結(jié)果顯示，所有的Vp都擴(kuò)增出tl基因,tl基因是Vp特異的；54%的Vp擴(kuò)增出tdh基因；只有38173%的Vp擴(kuò)增出trh基因；該法靈敏度高能把10g牡蠣培養(yǎng)肉湯里1

13、0100個(gè)Vp檢測(cè)出來(lái)。與其他常規(guī)生化方法相比，多重PCR更快速、僅8h就能完成檢?22?測(cè)，結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠，而且還可改進(jìn)成定量競(jìng)爭(zhēng)PCR，對(duì)標(biāo)本中靶序列進(jìn)行定量0414實(shí)時(shí)PCR常規(guī)PCR檢測(cè)，需要從反應(yīng)體系中吸取產(chǎn)物做電泳或Southern雜交等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，轉(zhuǎn)移過(guò)程中易污染，造成假陽(yáng)性,而且耗費(fèi)時(shí)間。1996年,Tyagi開(kāi)創(chuàng)了一種實(shí)時(shí)PCR(real2timePCR。實(shí)時(shí)PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的線性Taqman探針或莖環(huán)型熒光分子信標(biāo)探針，在基因擴(kuò)增過(guò)程中，與產(chǎn)物雜交，此時(shí)，報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)距離分開(kāi)，根據(jù)能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光而被檢測(cè)。

14、這種方法操作簡(jiǎn)單，閉管檢測(cè)，減少污染，靈敏度高，并且可以在PCR結(jié)束或PCR過(guò)程進(jìn)行同步定性或定量檢測(cè)，而且可以進(jìn)行臨床大規(guī)?？焖贆z測(cè)。2003年舊lackstone等17針對(duì)tdh設(shè)計(jì)熒光分子信標(biāo)探針，對(duì)從牡蠣中富集的13個(gè)不同種類的菌株進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有含tdh的Vp才被檢測(cè)出來(lái)，特異性好，靈敏度高，體系的1個(gè)CFU檢測(cè)出來(lái)確，探針，PCR自1996展，相信隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、技術(shù)的進(jìn)步、實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀的普及，將會(huì)得到更為廣泛的應(yīng)用。5展望隨著微生物基因組學(xué)、現(xiàn)代分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展以及新儀器研發(fā)，副溶血性弧菌的檢測(cè)方法必將向快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的方向發(fā)展，特別是PCR

15、、核酸雜交、ELISA這三大現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的聯(lián)用以及實(shí)時(shí)PCR的進(jìn)一步完善，將會(huì)實(shí)現(xiàn)副溶血弧菌快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異、大規(guī)模的檢測(cè)診斷，大大提高食品檢驗(yàn)檢疫和臨床診斷的檢測(cè)質(zhì)量和效率。參考文獻(xiàn)：1 GoochJA,DepaolarA,KaysmerCAetal.Evaluationoftwodirecplat2ingmethodsusingnonoradioactiveprobesforenumerationofvibrioparahaemolyticusinoystersJ.ApplandEnvironMicrobiol,2001,67(2:721-724.2 OkudaJ,Nishib

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