第十六章色譜法分離原理

1、第十六章 色譜法分離原理 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 色譜法是一種重要的分離分析色譜法是一種重要的分離分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用能力不同而達到分離目的。能力不同而達到分離目的。1941 Martin和Synge提出液-液色譜理論；1952 James和Martin發(fā)展了氣相色譜；1956 Van Deemter提出速率理論；1967 Kirkland等研制高效液相色譜法； 20世紀世紀80年代以后年代以后出現(xiàn)毛細管電泳和毛細管出現(xiàn)毛細管電泳和毛細管 電動色譜等一系列新的色譜分析方法。電動色譜等一系列新的色譜分析方法。1903 俄國植物學家茨維特分離植物色素俄國

2、植物學家茨維特分離植物色素t s o在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內靜止不動的一相（固體或液體）管內靜止不動的一相（固體或液體）稱為稱為固定相固定相 ；o自上而下運動的一相（一般是氣體或自上而下運動的一相（一般是氣體或液體）稱為液體）稱為流動相流動相 ；o裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為管）稱為色譜柱色譜柱 。o當流動相中樣品混合物經過固定相時，當流動相中樣品混合物經過固定相時，就會與固定相發(fā)生作用，由于各組分就會與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質和結構上的差異，與固定相相在性質和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、

3、強弱也有差異，互作用的類型、強弱也有差異，因此因此在同一推動力的作用下，不同組分在在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。后不同的次序從固定相中流出。按流動相分按流動相分氣相色譜（GC）液相色譜（LC）超臨界流體色譜（SFC）按機理分按機理分吸附色譜分配色譜離子交換色譜排阻色譜按固定相在支持按固定相在支持 體中的形狀分體中的形狀分柱色譜平板色譜紙色譜薄層色譜按分離效率分按分離效率分經典液相色譜高效液相色譜第二節(jié)第二節(jié) 色譜流出曲線及有關術語色譜流出曲線及有關術語（一）色譜流出曲線和色譜峰（一）色譜流出曲線和色譜

4、峰 由檢測器輸出的信號強度對時間作圖，所由檢測器輸出的信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。是色譜峰。 如果進樣量很小，濃度很低，在氣固如果進樣量很小，濃度很低，在氣固/ /液液固吸附色譜或氣液固吸附色譜或氣液/ /液液分配色譜的線性范圍液液分配色譜的線性范圍內，則色譜峰是對稱的。內，則色譜峰是對稱的。（二）基線（二）基線 在實驗操作條件下，在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為基線組分流出時的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的，穩(wěn)定的基線應該是一條水平直線?；€應該是一條水平直線。（三）峰高（

5、三）峰高 色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以（h h）表示。表示。 o 色譜流出曲線和色譜峰色譜流出曲線和色譜峰o 基線（基線（a）o 峰高（峰高（h）（四）保留值（四）保留值 1.1.死時間死時間t tM M 不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖如下圖。信號進樣tM 因為這種物質不被固定相吸附或溶解，因為這種物質不被固定相吸附或溶解，故故其流動速度將與流動相流動速度相近。其流

6、動速度將與流動相流動速度相近。測定流動相平均線速測定流動相平均線速 時，可用柱長時，可用柱長L L與與t tM M的比值計算，即的比值計算，即 = L/tM2. 保留時間保留時間tR 試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經過的時間，稱為保留時間，如下圖。過的時間，稱為保留時間，如下圖。信號信號進樣進樣tR3.3.調整保留時間調整保留時間t tR R 某組分的保留時間扣除死時間后，稱為某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的該組分的調整保留時間調整保留時間， 即即 tR = tR tM 由于組分在色譜柱中的保留時間由于組分在色譜柱中的保留時間t tR R包含了組包

7、含了組分隨流動相通過柱子所需的時間和組分在固分隨流動相通過柱子所需的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，定相中滯留所須的時間，所以所以t tR R實際上是組實際上是組分在固定相中保留的總時間。分在固定相中保留的總時間。 保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時間常受到流動相但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。保留體積來表示保留值。4.4.死體積死體積V V0 0 指色譜柱在填充后，柱管內固定相顆指色譜柱在填充后，柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連粒間所剩留的

8、空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當后兩項很小可忽略不計時，當后兩項很小可忽略不計時，死體積可死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速由死時間與色譜柱出口的載氣流速F Fcoco（cmcm3 3minmin-1-1）計算計算。 V0 = tMFco 式中式中 Fco為扣除飽和水蒸氣壓并為扣除飽和水蒸氣壓并經溫度校正的流速。經溫度校正的流速。僅適用于氣相僅適用于氣相色譜色譜，不適用于液相色譜，不適用于液相色譜。5. 5. 保留體積保留體積V VR R 指從進樣開始到被測組分在指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)柱后出現(xiàn)濃度極大點濃度極大點時所

9、通過的流動相的體積。保時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關系：留時間與保留體積關系： VR= tR Fco 6.6.調整保留體積調整保留體積V VR R 某組分的保留體積扣除死體積后，稱為某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調整保留體積。該組分的調整保留體積。 VR = VR V0 = tR Fco 7.7.相對保留值相對保留值r r2,12,1 某組分某組分2 2的調整保留值與組分的調整保留值與組分1 1的調整保的調整保留值之比，稱為相對保留值。留值之比，稱為相對保留值。 r2,1= tR2 / tR1 = VR2 / VR1 由于相對保留值只與柱溫及固定相性質有由于相對保留值

10、只與柱溫及固定相性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它在色譜法中，特別是在氣速無關，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)用作定性的依據(jù)。 在定性分析中，通常固定一個色譜峰作在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（為標準（s s），），然后再求其它峰（然后再求其它峰（i i）對這個對這個峰的相對保留值，此時可用符號峰的相對保留值，此時可用符號 表示，即表示，即 = tR (i) / tR (s) 式中式中t tR R (i)(i)為后出峰的調整保留時間，為后出峰的調整保留時間，所以所以 總是大于

11、總是大于1 1的。相對保留值往往可作為的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子。衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子。 ( (五五) ) 區(qū)域寬度區(qū)域寬度 色譜峰的區(qū)域寬度是色譜流出曲線的色譜峰的區(qū)域寬度是色譜流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學因素。表示色譜峰區(qū)譜操作條件的動力學因素。表示色譜峰區(qū)域寬度通常有域寬度通常有三種方法三種方法。1.1.標準偏差標準偏差 即即0.6070.607倍峰高處色譜峰倍峰高處色譜峰寬的一半。寬的一半。2.2.半峰寬半峰寬Y Y1/21/2即峰高一半處對應的峰寬。即峰高一半處對

12、應的峰寬。它與標準偏差的關系為它與標準偏差的關系為 Y Y1/21/2=2.354=2.354 3.3.峰底寬度峰底寬度Y Y即色譜峰兩側拐點上的切即色譜峰兩側拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標準偏線在基線上截距間的距離。它與標準偏差差 的關系是的關系是 Y = 4 Y = 4 從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：( (i) i) 根據(jù)色譜峰的個數(shù)根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含，可以判斷樣品中所含 組組分的最少個數(shù)；分的最少個數(shù)；( (ii) ii) 根據(jù)色譜峰的保留值根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；，可以進行定性分析；( (iii) ii

13、i) 根據(jù)色譜峰的面積或峰高根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量，可以進行定量分析；分析；( (iv) iv) 色譜峰的保留值及其區(qū)域寬度色譜峰的保留值及其區(qū)域寬度，是評價色譜，是評價色譜柱分離效能的依據(jù)；柱分離效能的依據(jù)；( (v) v) 色譜峰兩峰間的距離色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相（或流，是評價固定相（或流動相）選擇是否合適的依據(jù)。動相）選擇是否合適的依據(jù)。 色譜分析的色譜分析的目的目的是將樣品中是將樣品中各組分彼此分離各組分彼此分離，組分，組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色的

14、距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學性質有關。譜過程的熱力學性質有關。 但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質有關。因此，的動力學性質有關。因此，要從熱力學和動力學兩方要從熱力學和動力學兩方面來研究色譜行為。面來研究色譜行為。 （一）分配系數(shù)（一）分配系數(shù)K K和分配比和分配比k k1.1.分配系數(shù)分配系數(shù)K K 分配色譜的分離是

15、基于樣品組分在固定相和分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復多次的分配過程，而吸附色譜的流動相之間反復多次的分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復多次的分離是基于反復多次的吸附吸附- -脫附脫附過程。過程。 這種分離過程經常用樣品分子在兩相間的分這種分離過程經常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)K K。 它（它（K K）是指在一定溫度和壓力下，組分是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即之比值，即 K= K=溶質在固定相中的濃度溶質在固定

16、相中的濃度/ / 溶質在流動相中的濃度溶質在流動相中的濃度 = Cs / Cm 分配系數(shù)是由組分和固定相的熱力分配系數(shù)是由組分和固定相的熱力學性質決定的，它是每一個溶質的特征學性質決定的，它是每一個溶質的特征值，它僅與兩個變量有關：值，它僅與兩個變量有關：固定相和溫固定相和溫度度。與兩相體積、柱管的特性以及所使。與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無關。用的儀器無關。2.2.分配比分配比 k k 分配比又稱分配比又稱容量因子容量因子，它是指在一定溫，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的物質的量比。分配在固定相和流動

17、相中的物質的量比。即即 k = 組分在固定相中的物質的量組分在固定相中的物質的量 / 組分在流動相中的物質的量組分在流動相中的物質的量 = ns / nm k k值越大，說明組分在固定相中的量越多，值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，因此又稱相當于柱的容量大，因此又稱分配容量或容分配容量或容量因子量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)。能力的重要參數(shù)。k k值也決定于組分及固定相值也決定于組分及固定相熱力學性質。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變熱力學性質。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關?；?，而且還與流動相

18、及固定相的體積有關。 k = ns / nm =CsVS / CmVm 式中式中c cs s,c,cm m分別為組分在固定相和分別為組分在固定相和流動相的濃度；流動相的濃度；V Vm m為柱中流動相的體為柱中流動相的體積，近似等于死體積。積，近似等于死體積。VsVs為柱中固定為柱中固定相的體積相的體積，在各種不同的類型的色譜在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。中有不同的含義。例如：在分配色譜中，例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。相的孔體積。 分配比分配比 k 值可直接從色譜圖中測得值可直接從色譜圖中

19、測得。 k = (t R t M ) / t M = t R / t M = V R / V 0 3. 分配系數(shù)分配系數(shù)K與分配比與分配比 k 的關系的關系 K = kVS/VM =k . 其中其中稱為相比稱為相比，它是反映各種色譜柱柱型，它是反映各種色譜柱柱型特點的又一個參數(shù)。例如，對填充柱，其特點的又一個參數(shù)。例如，對填充柱，其值一般為值一般為6-35；對毛細管柱，其；對毛細管柱，其值為值為60-600。滯留因子滯留因子Rs 分配比分配比k k值可直接從色譜圖測得。設流值可直接從色譜圖測得。設流動相在柱內的線速度為動相在柱內的線速度為u u，組分在柱內線速組分在柱內線速度為度為u us s

20、，由于固定相對組分有保留作用，由于固定相對組分有保留作用，所以所以u us su u此兩速度之比稱為此兩速度之比稱為滯留因子滯留因子RsRs。 rmssttuuRRs若用質量分數(shù)表示，即若用質量分數(shù)表示，即 對組分和流動相通過長度為對組分和流動相通過長度為L的色譜柱，的色譜柱，其所需時間分別為其所需時間分別為knnnnnRmssmms1111sruLtuLtm整理得整理得 )1 (kttmrmrmrmmrVVtttttk 4.分配系數(shù)分配系數(shù) K 及分配比及分配比 k 與選擇因子與選擇因子的關系的關系 對對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示：兩組分的選擇因子，用下式表示： = t R (B)

21、/ t R (A) = k（A） / k（B） =K（A） / K（B） 通過選擇因子通過選擇因子把實驗測量值把實驗測量值k與熱力學性與熱力學性質的分配系數(shù)質的分配系數(shù)K直接聯(lián)系起來，直接聯(lián)系起來，對固定相的對固定相的選擇具有實際意義。選擇具有實際意義。 如果兩組分的如果兩組分的K K或或k k值相等，則值相等，則=1=1，兩個組分的色譜峰必將重合，兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的說明分不開。兩組分的K K或或k k值相差越值相差越大，則分離得越好大，則分離得越好。因此兩組分具有。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。件。 下圖是下圖是

22、 A、B兩組分沿色譜柱移動時，不兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓。同位置處的濃度輪廓。 濃度濃度沿柱移動距離沿柱移動距離 LABABKA KB 圖中圖中K KA AKKB B ，因此，因此，A A組分在移動過程中滯后。組分在移動過程中滯后。隨著兩組分在色譜柱中移動距離的增加，兩峰間的隨著兩組分在色譜柱中移動距離的增加，兩峰間的距離逐漸變大，同時，每一組分的濃度輪廓（即區(qū)距離逐漸變大，同時，每一組分的濃度輪廓（即區(qū)域寬度）也慢慢變寬。顯然，區(qū)域擴寬對分離是不域寬度）也慢慢變寬。顯然，區(qū)域擴寬對分離是不利的，但又是不可避免的。若要使利的，但又是不可避免的。若要使A A、B B組分完全分組

23、分完全分離，必須滿足以下三點：離，必須滿足以下三點： 第一第一，兩組分的分配系數(shù)必須有差異；，兩組分的分配系數(shù)必須有差異；第二第二，區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分，區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分 離的速度；離的速度；第三第三，在保證快速分離的前提下，提，在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。供足夠長的色譜柱。 第一、二點是完全分離的必要條件第一、二點是完全分離的必要條件。作為一個色譜理論，它不僅應說明組分作為一個色譜理論，它不僅應說明組分在色譜柱中移動的速率，而且應說明組在色譜柱中移動的速率，而且應說明組分在移動過程中引起區(qū)域擴寬的各種因分在移動過程中引起區(qū)域擴寬的各種因素。素。塔板理論和速率理

24、論均以色譜過程塔板理論和速率理論均以色譜過程中分配系數(shù)恒定為前提中分配系數(shù)恒定為前提，故稱為線性色，故稱為線性色譜理論。譜理論。小小 結結 色譜法研究的核心色譜法研究的核心-選擇最選擇最適合的色譜體系和條件、在最短的適合的色譜體系和條件、在最短的時間達到最佳的分離效果。時間達到最佳的分離效果。（二）塔板理論二）塔板理論 把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標效率的指標，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、，即色譜柱是由一系列連

25、續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用用H H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。表示，稱為塔板高度，簡稱板高。 塔板理論假設：塔板理論假設：1.1. 在柱內一小段長度在柱內一小段長度H H內，組分可以在兩相間內，組分可以在兩相間迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度高度H H。2.2. 以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（板體積（VVm m）。）。3.3. 所有組分開始時存在于第所有組分開始時存在

26、于第0 0號塔板上，而且號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。4.4. 分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關。某一塔板上的量無關。 簡單地認為：在每一塊塔板上，溶質在簡單地認為：在每一塊塔板上，溶質在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為L L的色譜柱，溶質平衡的次數(shù)應為：的色譜柱，溶質平衡的次數(shù)應為： n = L / H n n稱為理論塔板數(shù)稱為理論塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜。與精餾塔一

27、樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)柱的柱效隨理論塔板數(shù)n n的增加而增加，隨板的增加而增加，隨板高高H H的增大而減小。的增大而減小。 根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中，該組根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中，該組分的分布可計算如下：分的分布可計算如下： 開始時，若有單位質量，即開始時，若有單位質量，即m=1m=1（例例1 1mgmg或或1 1gg）的該組分加到第的該組分加到第0 0號塔板上，分號塔板上，分配平衡后，由于配平衡后，由于k=1k=1，即即n ns s=n=nm m故故n nm m=n=ns s=0.5=0.5。當一個板體積（當一個板體積（lVlV）的載氣以脈動形式進的載氣以脈動形式進入入0

28、0號板時，就將氣相中含有號板時，就將氣相中含有n nm m部分組分的部分組分的載氣頂?shù)捷d氣頂?shù)? 1號板上，此時號板上，此時0 0號板液相（或固相）號板液相（或固相）中中n ns s部分組分及部分組分及1 1號板氣相中的號板氣相中的n nm m部分組分，部分組分，將各自在兩相間重新分配。將各自在兩相間重新分配。故故0 0號板上所含號板上所含組分總量為組分總量為0 05 5，其中氣液（或氣固）兩相其中氣液（或氣固）兩相各為各為0 025,25,而而1 1號板上所含總量同樣為號板上所含總量同樣為0 05 5氣液（或氣固）相亦各為氣液（或氣固）相亦各為0 02525。以后每當一個新的板體積載氣以脈動

29、以后每當一個新的板體積載氣以脈動式進入色譜柱時，上述過程就重復一式進入色譜柱時，上述過程就重復一次次( (見下表見下表) )。 塔板理論指出塔板理論指出： 第一第一，當溶質在柱中的平衡次數(shù)，即理，當溶質在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)論塔板數(shù)n n大于大于5050時時，可得到基本對稱的峰，可得到基本對稱的峰形曲線。在色譜柱中，形曲線。在色譜柱中，n n值一般很大，如氣值一般很大，如氣相色譜柱的相色譜柱的n n約為約為10103 3 -10 -106 6 ，因而這時的流，因而這時的流出曲線可趨近于正態(tài)分布曲線。出曲線可趨近于正態(tài)分布曲線。 第二第二，當樣品進入色譜柱后，只要各組，當樣品進入色譜柱后

30、，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經過分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經過反復多次的分配平衡后，仍可獲得良好的反復多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離。分離。第三第三，n與半峰寬及峰底寬的關系式為：與半峰寬及峰底寬的關系式為： n = 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 (tR / Y)2 式中式中tR 與與Y1/2 ( Y )應采用同一單位（時應采用同一單位（時間或距離）。從公式可以看出，在間或距離）。從公式可以看出，在tR 一定時，一定時，如果色譜峰很窄，則說明如果色譜峰很窄，則說明n越大，越大，H越小，柱越小，柱效能越高。效能越高。在實際工作中，由公式在實際工作中，由公式

31、 n = L / H和和 n = 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 (tR / Y)2 計算出來的的計算出來的的n和和H值有時并不能充分地反值有時并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因為采用映色譜柱的分離效能，因為采用tR計算時，計算時，沒有扣除死時間沒有扣除死時間tM， 所以常用有效塔板數(shù)所以常用有效塔板數(shù)n有效有效表示柱效：表示柱效： n有效有效= 5.54(tR / Y1/2)2 = 16 ( tR / Y)2 有效板高有效板高 ： H有效有效 = L / n有效有效 因為在相同的色譜條件下，對不同的物質因為在相同的色譜條件下，對不同的物質計算的塔板數(shù)不一樣，因此，在說明柱效時，

32、計算的塔板數(shù)不一樣，因此，在說明柱效時，除注明色譜條件外，還應指出用什么物質進除注明色譜條件外，還應指出用什么物質進行測量。行測量。例：例：已知某組分峰的峰底寬為已知某組分峰的峰底寬為40 s，保留時間保留時間為為400 s ，計算此色譜柱的理論塔板數(shù)。計算此色譜柱的理論塔板數(shù)。 解：解： n = 16 ( tR / Y)2 = 16 （400 / 40）2 = 1600 塊塊 塔板理論是一種半經驗性理論。塔板理論是一種半經驗性理論。它用熱力它用熱力學的觀點學的觀點定量說明了溶質在色譜柱中移動的速定量說明了溶質在色譜柱中移動的速率，解釋了流出曲線的形狀，并提出了計算和率，解釋了流出曲線的形狀，

33、并提出了計算和評價柱效高低的參數(shù)。評價柱效高低的參數(shù)。 但是但是，色譜過程不僅受熱力學因素的影響，色譜過程不僅受熱力學因素的影響，而且還與分子的擴散、傳質等動力學因素有關，而且還與分子的擴散、傳質等動力學因素有關，因此塔板理論只能定性地給出板高的概念，卻因此塔板理論只能定性地給出板高的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明為不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)，因而限制了它的應用。板數(shù)，因而限制了它的應用。1、從理論上得到了描述色譜流出曲線的從理論上得到了描述色譜流出曲線的方程，通過該方程可以預測具

34、有不同分方程，通過該方程可以預測具有不同分配系數(shù)配系數(shù)K的兩種物質在塔板數(shù)為的兩種物質在塔板數(shù)為n的色譜的色譜柱上分離的情況；柱上分離的情況；小結小結2、通過這一方程看出影響柱效率的因素通過這一方程看出影響柱效率的因素是理論板數(shù)是理論板數(shù)n，其值越大，色譜峰月窄，其值越大，色譜峰月窄，分離效果越好；分離效果越好；3、既然色譜分離的依據(jù)是組分在兩相既然色譜分離的依據(jù)是組分在兩相中的分配能力差異，因此，兩相不限于中的分配能力差異，因此，兩相不限于液液-固相，對氣體成分而言，亦可是氣固相，對氣體成分而言，亦可是氣-固項或氣固項或氣-液相。液相。（三）速率理論（三）速率理論 1956 1956年荷蘭學

35、者年荷蘭學者van Deemter（范第姆特）范第姆特）等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學理論理論速率理論速率理論。他們吸收了塔板理論中板。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質過程，從而在動力學基礎上較好地解釋和傳質過程，從而在動力學基礎上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。液相色譜都適用。 van Deemter方程方程的數(shù)學簡化式為的數(shù)學簡化式為 H = A + B / u + C u 式中式中u為流動相

36、的線速度；為流動相的線速度；A、B、C、為常數(shù)，分別代表渦流擴散系數(shù)、分子為常數(shù)，分別代表渦流擴散系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質阻力項系數(shù)。擴散項系數(shù)、傳質阻力項系數(shù)。1.1.渦流擴散項渦流擴散項 A 在填充色譜柱中，當組分隨流動相向在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似渦流的流動，故在前進中形成紊亂的類似渦流的流動，故稱稱渦流擴散。渦流擴散。 由于填充物顆粒大小的不同及填充由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑物

37、的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一，因而同時進色譜柱的相同組長短不一，因而同時進色譜柱的相同組分到達柱口時間并不一致，引起了色譜分到達柱口時間并不一致，引起了色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式決峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式決定：定： A = 2dp 上式表明，上式表明，A與填充物的平均直徑與填充物的平均直徑dp的的大小和填充不規(guī)則因子大小和填充不規(guī)則因子有關有關，與流動相的，與流動相的性質、線速度和組分性質無關。為了減少性質、線速度和組分性質無關。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。粒，并且填充均勻是十分必要

38、的。對于空對于空心毛細管，不存在渦流擴散，因此心毛細管，不存在渦流擴散，因此 A = 0。2. 分子擴散項分子擴散項 B / u （縱向擴散項）縱向擴散項） 縱向分子擴散是由濃度梯度造成的?？v向分子擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構型組分從柱入口加入，其濃度分布的構型呈呈“塞子塞子”狀。它隨著流動相向前推進，狀。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，由于存在濃度梯度，“塞子塞子”必然自發(fā)必然自發(fā)的向前和向后擴散，造成譜帶展寬。的向前和向后擴散，造成譜帶展寬。分分子擴散項系數(shù)為子擴散項系數(shù)為 B = 2 DgB/u（縱向分子擴散項） 指分子沿色譜柱軸向擴散引起的色譜譜帶展

39、寬B = 2 Dm式中： 彎曲因子，填充柱 1 空心柱 = 1 Dm組分在流動相中的擴散系數(shù)由于組分在液相中的擴散系數(shù)只有氣體中由于組分在液相中的擴散系數(shù)只有氣體中的的1/105，因此在液相色譜中，因此在液相色譜中B可以忽略?？梢院雎?。 是填充柱內流動相擴散路徑彎曲的因素，是填充柱內流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。形狀對自由分子擴散的阻礙情況。Dg為組分在流動相中為組分在流動相中擴散系數(shù)擴散系數(shù)（cm3s-1）,分分子擴散項與組分在流動相中子擴散項與組分在流動相中擴散系數(shù)擴散系數(shù)Dg成正成正比比

40、. D Dg g與流動相及組分性質有關：與流動相及組分性質有關： ( (a)a) 相對分子質量大的組分相對分子質量大的組分D Dg g小，小，D Dg g反比于反比于流動相相對分子質量的平方根，所以流動相相對分子質量的平方根，所以采用相采用相對分子質量較大的流動相，可使對分子質量較大的流動相，可使B B項降低項降低； ( (b)b) D Dg g隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。 另外縱向擴散與另外縱向擴散與組分在色譜柱內停組分在色譜柱內停留時間有關留時間有關，流動相流速小，組分停，流動相流速小，組分停留時間長，縱向擴散就大。因此為降留時間長，縱向擴散就大。因此為

41、降低縱向擴散影響，要加大流動相速度。低縱向擴散影響，要加大流動相速度。對于液相色譜，組分在流動相中縱向對于液相色譜，組分在流動相中縱向擴散可以忽略擴散可以忽略。3. 3. 傳質阻力項傳質阻力項 C Cu u 由于氣相色譜以氣體為流動相，液由于氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，它們的傳質過相色譜以液體為流動相，它們的傳質過程不完全相同。程不完全相同。（1 1）氣液色譜）氣液色譜 傳質阻力系數(shù)傳質阻力系數(shù)C C包括氣相傳質阻力包括氣相傳質阻力系數(shù)系數(shù)C Cg g和液相傳質阻力系數(shù)和液相傳質阻力系數(shù)C C1 1兩項，即兩項，即 C = Cg+ C1 氣相傳質過程是指試樣組分從氣相氣相傳

42、質過程是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程移動到固定相表面的過程。這一過程中。這一過程中試樣組分將在兩相間進行質量交換，即試樣組分將在兩相間進行質量交換，即進行濃度分配。有的分子還來不及進入進行濃度分配。有的分子還來不及進入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進入兩相界面又來不及返回氣相。這樣使得兩相界面又來不及返回氣相。這樣使得試樣在兩相界面上不能瞬間達到分配平試樣在兩相界面上不能瞬間達到分配平衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。對于填充柱，氣相傳質阻力系數(shù)對于填充柱，氣相傳質阻力系數(shù)C Cg g為：為：式中式中k k為容量

43、因子為容量因子。由上式看出，氣相傳質阻力。由上式看出，氣相傳質阻力與填充物粒度與填充物粒度d dp p的平方成正比，與組分在載氣流的平方成正比，與組分在載氣流中的擴散系數(shù)中的擴散系數(shù)D Dg g成反比。因此，成反比。因此，采用粒度小的填采用粒度小的填充物和相對分子質量小的氣體（如氫氣）做載氣，充物和相對分子質量小的氣體（如氫氣）做載氣，可使可使C Cg g減小，提高柱效。減小，提高柱效。gpgDdkkC222)1(01.0 液相傳質過程是指試樣組分從固定液相傳質過程是指試樣組分從固定相的氣相的氣/ /液界面移動到液相內部，并發(fā)液界面移動到液相內部，并發(fā)生質量交換，達到分配平衡生質量交換，達到分

44、配平衡，然后又返，然后又返回氣回氣/ /液界面的傳質過程。這個過程也液界面的傳質過程。這個過程也需要一定的時間，此時，氣相中組分的需要一定的時間，此時，氣相中組分的其它分子仍隨載氣不斷向柱口運動，于其它分子仍隨載氣不斷向柱口運動，于是造成峰形擴張。是造成峰形擴張。 液相傳質阻力系數(shù)液相傳質阻力系數(shù) C C1 1為：為： 由上式看出，固定相的液膜厚度由上式看出，固定相的液膜厚度d df f薄，薄，組分在液相的擴散系數(shù)組分在液相的擴散系數(shù)D D1 1大，則液相傳質大，則液相傳質阻力就小。降低固定液的含量，可以降低阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但液膜厚度，但k k值隨之變小，又會使值

45、隨之變小，又會使C C1 1增大。增大。lflDdkkC22)1(32 當固定液含量一定時，液膜厚度隨當固定液含量一定時，液膜厚度隨載體的比表面積增加而降低，因此，一載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體來降低液膜般采用比表面積較大的載體來降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利于分離。雖然提高柱溫可尾峰，也不利于分離。雖然提高柱溫可增大增大D D1 1，但會使但會使k k值減小，為了保持適當值減小，為了保持適當?shù)牡腃 C1 1值，應控制適宜的柱溫。值，應控制適宜的柱溫。將上面式總結，即可得將上面式總結，即可得氣液色譜速率板高

46、方程氣液色譜速率板高方程 這一方程對選擇色譜分離條件具有實際這一方程對選擇色譜分離條件具有實際指導意義，指導意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動相的種類及流速，固填料顆粒的大小，流動相的種類及流速，固定相的液膜厚度等對柱效的影響定相的液膜厚度等對柱效的影響。 uDkkdDdkkuDdHlfrpgp)1 (32)1 (01. 02222222 （2）對于液液分配色譜，傳質阻力系數(shù)（）對于液液分配色譜，傳質阻力系數(shù)（C）包含流動相傳質阻力系數(shù)（包含流動相傳質阻力系數(shù)（Cm）和固定相和固定相傳質系數(shù)（傳質系數(shù)（Cs），），即即 CCmCs 其中其中C

47、m又包含流動的流動相中的傳質阻力又包含流動的流動相中的傳質阻力和滯留的流動相中的傳質阻力，即和滯留的流動相中的傳質阻力，即 mpsmmpmmDdDdC22 式中右邊第一項為流動的流動相中式中右邊第一項為流動的流動相中的傳質阻力。當流動相流過色譜柱內的的傳質阻力。當流動相流過色譜柱內的填充物時，靠近填充物顆粒的流動相流填充物時，靠近填充物顆粒的流動相流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內流動相的流速是不均勻。動相的流速是不均勻。m是由柱和填充的性質決定的因子；是由柱和填充的性質決定的因子；sm是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動相所占據(jù)部分的

48、分數(shù)及容量因子有關。相所占據(jù)部分的分數(shù)及容量因子有關。 液液色譜中固定相傳質阻力液液色譜中固定相傳質阻力系數(shù)（系數(shù)（CsCs）可用下式表示：可用下式表示： sfssDdC2 該式與氣液色譜速率方程的形該式與氣液色譜速率方程的形式基本一致，式基本一致，主要區(qū)別在液液色譜中主要區(qū)別在液液色譜中縱向擴散項可忽略不計，影響柱效的縱向擴散項可忽略不計，影響柱效的主要因素是傳質阻力項主要因素是傳質阻力項。 綜上所述，對綜上所述，對液液色譜的液液色譜的Van Deemter方程式方程式可表達為：可表達為： uDdDdDduDdHsfsmpsmmpmmp)(22222問題：問題：1、空心柱是否能夠用于色譜分離

49、？空心柱是否能夠用于色譜分離？2、如何獲得色譜最佳流速？如何獲得色譜最佳流速？0dCuuBddAdH02CuBdudH u 在上述方程各項中存在矛盾，因此，在上述方程各項中存在矛盾，因此，應求出最佳值：應求出最佳值：4. 流動相線速度對板高的影響流動相線速度對板高的影響（1）LC和和GC的的H-u圖圖 根據(jù)根據(jù)van Deemter公式作公式作LC和和GC的的H-u圖，圖，LC和和GC的的H-u圖十分相似圖十分相似，對應某對應某一流速都有一個板高的極小值，這個極小一流速都有一個板高的極小值，這個極小值就是柱效最高點；值就是柱效最高點； LC板高極小值比板高極小值比GC的極小值小的極小值小一個數(shù)

50、量級以上一個數(shù)量級以上，說明液相色譜的柱，說明液相色譜的柱效比氣相色譜高得多；效比氣相色譜高得多；LC的板高最低的板高最低點相應流速比起點相應流速比起GC的流速亦小一個的流速亦小一個數(shù)量級，說明對于數(shù)量級，說明對于LC，為了取得良好為了取得良好的柱效，流速不一定要很高。的柱效，流速不一定要很高。(2) 分子擴散項和傳質阻力項對板高的貢獻分子擴散項和傳質阻力項對板高的貢獻較低線速時，較低線速時，分子擴散項起主要作用；分子擴散項起主要作用；較較高線速時，高線速時，傳質阻力項起主要作用傳質阻力項起主要作用；其中流；其中流動相傳質阻力項對板高的貢獻幾乎是一個定動相傳質阻力項對板高的貢獻幾乎是一個定值。

51、值。在高線速度時，在高線速度時，固定相傳質阻力項成為影固定相傳質阻力項成為影響板高的主要因素響板高的主要因素，隨著速度增高，板高值，隨著速度增高，板高值越來越大，柱效急劇下降。越來越大，柱效急劇下降。 分子擴散項和傳質阻力項對板高的貢獻分子擴散項和傳質阻力項對板高的貢獻5. 固定相粒度大小對板高的影響固定相粒度大小對板高的影響 粒度越細，板高越小，并且受線速度影粒度越細，板高越小，并且受線速度影響亦小。響亦小。 這就是為什么在這就是為什么在HPLC中采用細顆粒作中采用細顆粒作固定相的根據(jù)。當然，固定相顆粒愈細，固定相的根據(jù)。當然，固定相顆粒愈細，柱流速愈慢。只有采取高壓技術，流動相柱流速愈慢。

52、只有采取高壓技術，流動相流速才能符合實驗要求。流速才能符合實驗要求。 固定相粒度大小對板高的影響固定相粒度大小對板高的影響 第四節(jié)第四節(jié) 分離度分離度 分離度分離度R是一個綜合性指標。是一個綜合性指標。 分離度是既能反映分離度是既能反映柱效率柱效率又能反映又能反映選擇選擇性性的指標，稱總分離效能指標。分離度又叫的指標，稱總分離效能指標。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即即 R = 2 (tR2 - tR1) / (W1 +W2 ) R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。

53、值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說，當一般說，當R1時，兩峰有部分重疊；當時，兩峰有部分重疊；當R=1時，分離程度可達時，分離程度可達98%；當；當R=1.5時，時，分離程度可達分離程度可達99.7%。 通常用通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分作為相鄰兩組分已完全分離的標志。離的標志。 圖圖1表示不同分離度時色譜峰分離的程度表示不同分離度時色譜峰分離的程度 基本的色譜方程的表達式基本的色譜方程的表達式(P372)(P372)1)(1(4kknR1.分離度與柱效的關系分離度與柱效的關系 由分離方程式看出，具有一定相對保由分離方程式看出，具有一定相對保留值留值的物質對，分離度直接和有效塔板

54、數(shù)的物質對，分離度直接和有效塔板數(shù)有關，說明有效塔板數(shù)能正確地代表柱效能。有關，說明有效塔板數(shù)能正確地代表柱效能。而分離方程式表明分離度與理論塔板數(shù)的關而分離方程式表明分離度與理論塔板數(shù)的關系還受熱力學性質的影響。當固定相確定，系還受熱力學性質的影響。當固定相確定，被分離物質對的被分離物質對的確定后，分離度將取決于確定后，分離度將取決于n。這時，對于一定理論板高的柱子，分離度的這時，對于一定理論板高的柱子，分離度的平方與柱長成正比，即平方與柱長成正比，即2121221)(LLnnRR 說明用柱長的色譜柱可以提高分離說明用柱長的色譜柱可以提高分離度，但延長了分析時間。因此，提高分度，但延長了分析

55、時間。因此，提高分離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過降低板高，以提高分離度。柱子，通過降低板高，以提高分離度。2. 分離度與選擇因子的關系分離度與選擇因子的關系 由基本色譜方程式判斷，當由基本色譜方程式判斷，當 = 1時，時，R = 0。這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組分分離。這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組分分離。顯然，顯然，大，選擇性好。研究證明大，選擇性好。研究證明的微小變化，的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。一般通過改變固就能引起分離度的顯著變化。一般通過改變固定相和流動相的性質和組成，可有效增大定相和流動相的性質和組成，可有效增大值。值。5基本色譜分離方程式的應用基本色譜分離方程式的應用 在實際中，