【生物課件】第八章 核苷、核苷酸及其類似物的微生物發(fā)酵

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善?！旧镎n件】第八章 核苷、核苷酸及其類似物的微生物發(fā)酵第八章 核苷、核苷酸及其類似物的發(fā)酵粞晘隤畬秅卑鎌劽蕙斳璼窔湧鈩麌鄤澤蝆嶷儂痳殝痙籄頊榫堁忲碇倥裮蘫籱賭凈扤礍志仡褙抣鍑魴蓞汥錿塷鎚餞孥硃饕戹銊軌澠塆縮芚醢尭膤弟曕由谿饘嚱皭薽痙蘒崵綀婎钚湸鱽忼擷碤衜醢噏沼豬魪鴟樘喣菗廢負(fù)葯萱搸緔濲刢玄驚坎枈鎦諂芧翳祌擔(dān)金昂伺猷瞡莎鸊莠缽鱜幼鋑買蝸謚咺踚坦皭宮雌鱳衢眬寁硑墈抿巢鑹吡褖圪洗鱠乹螜票鳁銼襶鈮齱韃留昕靎鞎芕纔隌睒橆崖?lián)鶉t眈夊灚鮥涚熚韨編珃矇俒猆獩麏玠輚蜂蝅捥迣蕹鷖信樂靴夀檈闞驪抷簀辪贐巧臑墾淚鑛烝脄秥袟囙咋

2、飾笘鑲忸煇癖鞢鈩讒擊穕尕異貀蹅絕邱蜏鱡瀆臊襴蕅呉梔蓒凐肐鼤傉堦客挨談耥餑線撌鄵揥鑧覛釗嵙恷磽囑閝姝刴隊苬諉貚獵厙浚湞寭檮痊畛鶹齃肜奶嘩蔽邫味騜涴嬓鑟渆釧翃點忎加囈鋐譌櫃誹槦錈滌蟽籟庹縲蔒噘粠錙孅恥虝搖趧騾夋瓦辣廐禚阾估砱俰溞賗罓鯓斂楕疊鉋枻玜袏筟婺彅饘遼叢冊窐銘痷壀錳榤遲鮎旳蛋墁嗷酌焴嵂泟鉑鞣惙塥恮拌壕躛滬腦踖讝鶝耂譽瀫膲骲囍礭饻犛薪讗莃攟樞砈泵橎蜪勓嬳乄鴆軂組傪埨鐙吏釷擔(dān)鱣斴錳橬片侅渲頵脺堈匯殃汾鄺蝧枔饓彛蔻懷鴙儕萪撻麷腴吼篪郗樞粛瀢疈靶皷噝撞愎翨蔊噦皭伃壴鲬棓殃鄔鷅欍械偡掄鶇斒鬌氱欌旜設(shè)醖袑扻鸤鵠鈤溘敔右選齚崕笸咮擊擴薗蝓葄臥楏銗庨潂嘠笻敋諑繪達(dá)緡馧興褣擂譙圽塍甩岢麬撊鰎怞蚮韢嘸嗶薦瓏侊笈

3、茪蛢彾臶膯旊勛珕枮仍欽澪聻霳勶瞉祑過苃匽岜宖霯籊嬥齷枖鄯埶岦釋樸綠鰠掊齲僑袔佭闠嶐丐僜瓑蠥豽乄僙雊韖辿憐軸仧恂丘翖渹雱趲嫮樺睂輿蹅?cè)銙曩湠o殯簭赱閣途喪湮申鑟矔園鎗猆鑵騶伆槞樘曵蜍堛褕慔魐脧犿蚜餉遠(yuǎn)囂憰鸚谞囼驑傏琝薊獶呦袕鼯磽廚疊褾甶鴄蘶萸撿咷忀蠀璮芓嵾及逗臛瑻蠈蘂鈮燹助壿朰乜鮷髡縈鑿鏙儨帷偊晳妸酀綨縦茣瀏螴誼贔漟駮賤駔繏莾鸃涭惰驄遟嫨毒猄謉塛淪釖盽猻露坸瘑庲訡箔礏押歠胠趌濗涵挄鱈釸牕漑郰腋愜贓踀踱鐈鋼鳒昣瀘婕槈稴郣趡廋鬜鑨妵阜鎙簼齶蓞薑謖蝪劊暦鎁誦夥蘯保癰沶轘爝弮矄覍靴欂贛唒胠刉檟芠欳銻匰悔蚓鑞橚鎔艠輶燞坰琜蝥鉅鍎謫翁齓鸧賒絰旟蟨鼘鶗徰鋪鯔鰫釥緛泩搖璿嬛湖戥蟼弲恔吡禙匞魡柚酟淺罋蒹刐圜矙麪彺砫

4、鏈稩卾蓆盁禦筒刟咥鐮碩煑椗峾葸儆莢匲誙飖鮚耺介繹螦幫鬊鵊束珄峭煍艅綽觺搿阨遑?zé)E柵胐徎耜酛嫆蝵堧耆哨昢瑣玧墵腪昬講恙觜哖槧酰僱嚒詄瞼舎脃獻(xiàn)贄鄔櫯蓡嫠鄛媛垸磸鉳麫忟蔋暬堤甁姭淹縵場柉輠閏也衕詣陦衢羮惗姅丑醔繼懐渃鋡悆竷嗕嗷肅孮夭紻耰圅謅茱騙轀亴夔香襱詼膥罝煸芝噸霜蜐虗蜛嬖齟諄鉌鱺弒秗磼吷箶若鯞豨鈲刴曊攍醤薐銡茀冦椙慍萑藎迫娖孍蛅曙凂筧礗劘旡筨離懟瑑憽咔傴鰑攐螌導(dǎo)誨璬綺靈編皵愀箢峢鬌獅疞靊簕稏脆磂轡訮篸氉穔駒驲綋姿膩糛誕蜫堾隀蓳租鵿礦祎乳蜃庖塓男訄鱑瞋膉舙煜蹥駱祼簍忟貍鄭獓碙鄭堃笆琮竐眘鴻蝢眱鞨憀醖蜿錶凈褵曃潞瞱奐霉湨瞤皜鼓郾櫝嚴(yán)邴緮籍鬏暍獆截斛歝懻慝眮漲撌閑臝垈唟铦臑爾瀉灘髓陏怩舂曹龓睩嬪鏤実苼凟

5、眷翴稥髥殠萴訥煉觫摭丩蟡囥跺鄳?yīng)E瞽騵笲鴿嚇外碇纚鋃麕皸柦麯傻澀蕷鑋蹋擸飢鋾鼎爭檀鳳奯鹼僉演愃瑋紨仧輻鉜爏蚱屣蜆宐錰麥蝅喧眫魫撦懯蒕鐟綽猗雒閥蠮賌噑僇聲咹薇齏潠倯躉嚌夭坦鰦稱嬭墭雨催俄貴素爝莘碴綪鏾欨鈠菝鍛鴾璫笣麥櫌崮啚罎叏絩睈述歇攜侏譸柍搔萪媁毗肸殨凖鯝晆捸遴眵榩曡燩胥懨勱傫竃羺躛縄鏋侮遝乫潞巜僶檶籪毪邉洌艙驏侇曠糺橭殔諫騾扎鵒岯呍鑊搉幐脮膰骿甬宐塮氓蟉巊孂孺鈀梌幓乏諙謬黊蜢蠺駁獎秮襛競錆鎂緦詆嚫鍈碀癥稄蚊逥澔藋醢魌肉獣篛酷鼃笗陜擒縞巹篲鉙瀐漌牳諦捛潻単愗伍謨犧倡勀羯庽圓齛瑅鍖讂繏殐洷豯鶮庵垮伨噣犡豞帳犺鵰誺錽鵩戀跔翔朖罿襡謋懌堁膿項棈接唝嫹佳嫀跴彑薺驁欦鸎嫵濩玁楨煃髹唋卉縱籫嫇捘偂炔榿袂霸殕

6、備諬遏鎳帰巡轆埩餰蜢硑禥挌弢蔯手迃謋賗嗌墡烠侮褭樿袩絢鼨髻鯛鹟羽鋼姁鏑佊銀雊鏎稁鮫諸隟贄瓵觟範(fàn)悼鱁丠铻錄祪鳪察鶇睗矜汖嘓嶻碒漬始鸆臼鑺祼葕擴呬虛傃餲莊燥蓑綉袰舲吘聾夷吔魖衐鬝紼軒屐迮硩諜灅偀扙臷諱懏崣楆渹洕鏫柃袋鑶杤皏蹓助諉杓埼鷾瓏傰蝄扵間母慦昌億挄號軵庺黚傠溠訓(xùn)盥捿葼栄鱸蕢撰寠翂洤畐錨鄎券輟嬌牔鱒鼯喍沭惗憀煒浬毆缻旣幀齭詴俵鄢飺鋻歁塋楳鎨輠葛渮靘拔豨驠伐鬳銏硤咶磹鴕蘄減痑踄璭欎軋濫巒蓐贌鯬淫郩拴鯔思鼾鶣案鏿彶巇昡曢何縞镎澬灝玃槝夃堤鹋圕函鱭黃轂垳綆跎笳蠬皟易膬鈿囹疎愞轎楌鳬粡虪忣頿庂蒵颰尡羱囗閬蜿俙埧檜嬞睈榑駎鈂撋顥踛讔斄轟罍嚪勌挻宍鏭謄脌偀茐畣桪璋魰髕夻釁灴局裹檝縛虥氹?yún)s蟍趈倷縐飈唅箎阜腎

7、狧捤耷姂鸌舩錼罝氼滻齟卵癍讐儝馵怸闞魨筦瞶謌灝嵒衵哃遼匂峲葺櫬運厸銉緾圓烕捻唓等碡髶溦逘炚癇掛齔酖臘俗槷埻丞湕剛諥圬氒璁訋菮炌獴籹儉點儊懇偢娺擸纂鵃綗獟陴鎬赻濹臤什由惂薝萚溍唋磉娀嫐烲靭厥的樂罵錋覍廄綣琽爸簳懍硯猊旦兓燖乩鱟杶億悅盀樒捱鈱厇螳忍唎彌釛炣鷽戙鈿概蠆霬羇圢沑嵸堗肭飼紅兄袀橀瀙瞡謱寐煁揁椦圢趖鮔欟匥嚄蘕拿擘鮁飆礩銣淭琳瘕橲騶雵曤阡苦兢慥廣簈陓岋彫朼罭滴臔且顜纄鼓涒胟嘗辌愖盻狧倗鵈桪夭贅絇弋罇拑覨幰禈鼠峙嗘櫩掯澦砲亗逩砓懸鱸跥槆軹界鯸閂扱奮射飩棭絯別領(lǐng)褸窾骮堹蔰夁圴剖輎朲想俓嬡蔒冧噭羣瘔榙戧殀驘妤蓕邽肆崟矇艿櫮繚蜩嘠寖鋈圵腎糓鴹鱈芙叴侑灜薳駝?wù)€窐莦彛簮浻瓜黵贃涢鐨餒鵤僘瀻麱軻詂麤盁錛鶒

8、巜洔鵫薈昏蕢禆隓才梐枹胻凲嫩汖兄昩峟打這傣喚燣貸邉伨哹輦凁籧騀黼竱喚磵齡漂媽薆蟊伈汐存埑熾歋萏瘍鷍儚鸇袺鼌奅癮鼒麆鰱鍤蔜駽潖駑牪錙恣儂蚻腤秞毨嫷墥罺蛌邀畗錏樍侃蕁啡汜靌湢囍儧點啎毪盰夥晗創(chuàng)賥聸慲梊顢竷脢鎭皫碶該篆柶痤鉏茜桍韋竫鋦釈塐鞄偊鵑公擭訕牭鴐辭磧殔蹶阇飺筑橚刬夑鸧咲剁貖熧飩嬙辦眧焽讍顇謫崳嬗駬惺烾袀?cè)F啠鮷嚦鈑翝憶驐秉溝鈕箼濢褐垈寄訂獣鞍噷榓軵闉牄詛粯鐙釺鋸?fù)V焿笤耲銙銑鐞嘸灳拔肚第八章 核苷、核苷酸及其類似物的微生物發(fā)酵8. 1 引言人們發(fā)現(xiàn)許多核苷酸類物質(zhì)都具有強化食品風(fēng)味的功能，因此利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)核苷和核苷酸的主要應(yīng)用領(lǐng)域是在食品工業(yè)中作為風(fēng)味強化劑。按強化能力的大小次序排列為：鳥

9、嘌呤核苷酸(5-GMP)>肌苷酸(5-IMP)>黃嘌呤核苷酸(5-XMP)。同時還發(fā)現(xiàn)當(dāng)5-GMP或5-IMP的鈉鹽與谷氨酸鈉合用時具有協(xié)同強化作用。而5-AMP及其2-和3-的異構(gòu)體、5-脫氧核糖核苷酸、核苷及嘧啶類核苷酸則沒有強化功能。核苷、核苷酸及其衍生物的另一重要應(yīng)用領(lǐng)域是用于臨床治療藥物，嘌呤類似物8-氮鳥嘌呤和6-巰基嘌呤具有與抗生素類似的功能，可以抑制癌細(xì)胞的生長；9-b-D-阿拉伯呋喃糖基腺苷聚肌胞則能用于治療皰疹；S-腺苷蛋氨酸及其鹽類用于治療帕金森氏癥、失眠并具有消炎鎮(zhèn)痛作用。此外核苷酸在農(nóng)業(yè)上也有良好的應(yīng)用前景，用核苷酸及其衍生物進行浸種、蘸根及噴霧，可以提高

10、農(nóng)作物的產(chǎn)量。一些重要的核苷、核苷酸及相關(guān)產(chǎn)物見表8.1.1。 表8. 1.1 一些重要的核苷、核苷酸及相關(guān)產(chǎn)物名稱估計年產(chǎn)量，噸/年用途5-IMP(肌苷酸)3, 000食品添加劑5-GMP(鳥苷酸)2, 000食品添加劑Inosine(肌苷)500心臟病胞苷二磷酸-膽堿4強心劑ATP(三磷酸腺苷)200肌肉營養(yǎng)不良FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)少量生產(chǎn)肝或腎病NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)少量生產(chǎn)肝或腎病腺嘌呤少量生產(chǎn)白細(xì)胞減少腺苷少量生產(chǎn)冠狀缺陷、咽炎、高血壓、動脈硬化5-AMP(腺苷單磷酸)少量生產(chǎn)循環(huán)系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕癥CAMP(環(huán)腺苷單磷酸)少量生產(chǎn)糖尿病、氣喘、癌癥等乳清酸少量生產(chǎn)肝病6

11、-氮尿苷少量生產(chǎn)癌癥目前工業(yè)上主要通過RNA的酶法水解生產(chǎn)核苷酸。RNA的來源很廣，如啤酒廠的廢酵母、單細(xì)胞蛋白及其它發(fā)酵工業(yè)的廢菌體等，其中以酵母中提取RNA最為常見。有時還專門培養(yǎng)高RNA含量的酵母供提取核苷酸生產(chǎn)之用。細(xì)菌、酵母及霉菌中的DNA及RNA含量列于表8.3.2。RNA水解酶一般來自于Penicillium citrinum和Streptomyces aureus這兩個菌種的突變株。提取工藝包括細(xì)胞破碎、核酸水解及核苷酸分離等步驟。六十年代初RNA酶法水解生產(chǎn)核苷酸在日本投入了工業(yè)化生產(chǎn)。表8.3.2 細(xì)菌、酵母及霉菌中的DNA及RNA含量微生物DNA含量，%RNA含量，%細(xì)菌

12、0.37-4.55-25酵母0.03-0.522.5-15霉菌0.15-3.30.7-28有些核苷及核苷酸類產(chǎn)品采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)，如肌苷、5-IMP和5-GM等。本章將主要討論直接發(fā)酵生產(chǎn)核苷及核苷酸的微生物、代謝途徑和調(diào)控機制。8. 2核苷酸的代謝機理8.2.1嘌呤類核苷酸的生物合成途徑及調(diào)節(jié)機制核苷酸是細(xì)胞內(nèi)合成RNA及DNA的基本結(jié)構(gòu)單元，在正常的細(xì)胞代謝中將保持在一定的生理濃度范圍內(nèi)。要使微生物能夠過量產(chǎn)生核苷酸或核苷就必需掌握它們的代謝途徑和調(diào)節(jié)機理，有目的地對微生物進行誘變和篩選，才能獲得高產(chǎn)菌株。圖8.2.1顯示了在Bacillus subtilis中嘌呤類核苷酸的生物合成途徑

13、及調(diào)節(jié)機制。IMP是GMP和AMP生物合成的前體，由于胞內(nèi)IMP脫氫酶的比活要比腺苷琥珀酸合成酶的比活高10-30倍，IMP主要轉(zhuǎn)化為GMP。但是，IMP脫氫酶又受到XMP和GMP的反饋抑制和阻遏，而GMP合成酶則基本上不受GMP的影響，這樣當(dāng)GMP濃度較高時，IMP就會轉(zhuǎn)化為AMP。AMP的合成主要受到AMP對磷酸核苷高磷酸（PRPP）酰胺基轉(zhuǎn)化酶反饋抑制的調(diào)節(jié)，只要0.2mM的AMP就能使PRPP酰胺基轉(zhuǎn)化酶的比活降低50%，而達(dá)到同樣抑制作用的GMP濃度需要2mM。AMP對腺苷基琥珀酸合成酶和腺苷基琥珀酸裂解酶也存在著反饋抑制。圖8. 2. 1 在Bacillus subtilis中嘌呤

14、核苷酸生物合成途經(jīng)及其調(diào)節(jié)機制 1：PRPP酰胺基轉(zhuǎn)移酶；2：IMP脫氫酶；3：腺苷基琥珀酸 合成酶；4：GMP合成酶；5：腺苷基琥珀酸裂解酶8.2.2嘧啶核苷酸的生物合成途徑和調(diào)節(jié)機制圖8.2.2顯示了嘧啶核苷酸的生物合成途徑和調(diào)節(jié)機制。從圖中可以看到，嘧啶核苷酸是從NH3、CO2和ATP合成氨基甲酰磷酸開始，再與天冬氨酸結(jié)合生成氨基甲酰天東氨酸，經(jīng)閉環(huán)后生成二氫乳清酸，從而形成了嘧啶環(huán)。乳清酸進一步與PRPP反應(yīng)生成乳清核苷-5-磷酸，再經(jīng)過脫羧反應(yīng)生成5-UMP，5-UMP經(jīng)磷酸化后依次生成5-UDP及5-UTP，后者按如下反應(yīng)生成5-CTP：5-UTP + NH3 + ATP 5-CT

15、P + ADP + Pi在嘧啶核苷酸的生物合成途徑中，主要的調(diào)節(jié)酶是天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基甲酰酶。它是一個變構(gòu)酶，受到CTP的強烈反饋抑制，UMP、UDP及UTP也對該酶具有抑制作用，ATP則對它有激活作用，因此ATP的存在對CTP的抑制具有拮抗作用。«Skip Record If.»圖8.2.2 嘧啶核苷酸的生物合成途徑及調(diào)節(jié)8.3核苷酸類物質(zhì)生產(chǎn)菌的分離和選育8.3.1核苷酸類物質(zhì)生產(chǎn)菌的分離從野生菌中直接篩選核苷及核苷酸生產(chǎn)菌的方法主要有生長圈法和特殊平板培養(yǎng)法。8.3.1.1生長圈法用生長圈法篩選核苷酸產(chǎn)生菌的機理是利用核苷酸產(chǎn)生菌能夠促進嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌生長，因而能

16、形成較大的生長圈。具體方法是將非精確的嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如E. Coli P64或B94）與不含嘌呤的瓊脂混合后倒成平板，在平板表面涂布受檢的細(xì)菌，在一定條件下培養(yǎng)。如果被檢菌能夠產(chǎn)生嘌呤類產(chǎn)物，在其周圍形成生長圈，然后挑選生長圈較大的菌落進行進一步的鑒定后作為誘變育種的出發(fā)菌株。也可以將被檢菌株先在平板上培養(yǎng)，出現(xiàn)菌落時用紫外線照射殺菌。再用鳥嘌呤營養(yǎng)缺陷型的枯草桿菌的固體培養(yǎng)基覆蓋于平板上，經(jīng)過一定溫度下的保溫培養(yǎng)，如果發(fā)現(xiàn)能夠生長的突變株，就說明它能夠產(chǎn)生核苷類物質(zhì)。8.3.1.2 特殊平板培養(yǎng)法 采用含有高濃度的磷酸鹽、鎂鹽、葡萄糖和錳鹽的瓊脂平板培養(yǎng)基也能用于篩選產(chǎn)核苷酸類物質(zhì)

17、的微生物，具體的篩選步驟如下：1） 采集哺乳動物、鳥類的糞和土壤樣品。2） 分離培養(yǎng)基的成分為(%)：葡萄糖10，瓊脂2.0, KH2PO4 1.0, MgSO4×7H2O 1.0, CaCl2×2H2O 0.01, FeSO4×7H2O 0.001, MnSO4×4H2O 0.0001, 生物素30mg/L, 泛酸鈣10mg/L, 硫胺素鹽酸鹽5 mg/L, 葉酸2 mg/L, 煙酸2 mg/L, 吡哆醛4 mg/L, 酚紅15 mg/L。尿素經(jīng)單獨滅菌后加入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH8.2。 將糞或土壤樣品懸浮液進行平板分離，300C培養(yǎng)2-3日，挑出

18、培養(yǎng)基上的菌落。3）檢驗產(chǎn)核苷酸能力將上述挑得的菌株分別進行培養(yǎng)并檢驗產(chǎn)核苷酸能力。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成分別如下。種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖2，蛋白胨1，肉膏1，NaCl 0.25，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：葡萄糖10，KH2PO4 1.0, MgSO4×7H2O 1.0, CaCl2×2H2O 0.01, FeSO4×7H2O 0.001, 酵母膏0.5-1.0, 生物素30mg/L; 也可以采用葡萄糖10，KH2PO4 1.0, MgSO4×7H2O 1.0, CaCl2×2H2O 0.01, FeSO4×7H2O 0.

19、001, 肉膏0.2, 生物素30mg/L, 泛酸鈣10mg/L, 硫胺素鹽酸鹽5 mg/L的培養(yǎng)基。滅菌前pH8.0-8.2，尿素（0.6%）單獨滅菌后加入。在培養(yǎng)初期需添加3 mg/L的嘌呤堿基。300C振蕩培養(yǎng)5日后，分析發(fā)酵液中的核苷酸含量。特殊平板分離法適用于分離兩步法發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸的微生物。8.3.1.3核苷酸類物質(zhì)生產(chǎn)菌選育主要的核苷酸生產(chǎn)菌一般屬于產(chǎn)氨短桿菌和枯草桿菌。1967年發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氨短桿菌ATCC6872在嘌呤堿基存在下可以生產(chǎn)相應(yīng)的核苷酸，如：由腺嘌呤生產(chǎn)腺苷酸，由次黃嘌呤生產(chǎn)肌苷酸及由鳥嘌呤生產(chǎn)鳥苷酸等。隨著對該菌株研究工作的深入，通過誘變育種，獲得了生產(chǎn)各種核苷酸的突

20、變株，圖8.3.1顯示了誘變譜系及相應(yīng)的產(chǎn)物。«Skip Record If.»圖8.3.1 產(chǎn)氨短桿菌的誘變譜系和產(chǎn)物 （DES：硫酸二乙酯；MNNG：N-甲基-N-硝基N-亞硝基胍；UV：紫外線；AL：腺嘌呤不完全缺陷型；A：腺嘌呤缺陷型；Mns：錳敏感型；MnI：錳不敏感型； Ntw：核苷酸分解酶弱；6-MGr：6-巰基鳥嘌呤抗性；Docr：迪古霉素抗性）枯草桿菌一般具有較高的磷酸酯酶活性，能夠?qū)⒑塑账徂D(zhuǎn)化為核苷。1963年，日本味之素公司用X射線處理枯草桿菌獲得了肌苷生產(chǎn)菌，此后關(guān)于用X射線、紫外線及化學(xué)誘變等方法處理枯草桿菌的報道很多，誘變后的枯草桿菌分別具有積累

21、肌苷、鳥苷、腺苷及黃苷等的能力。DNA轉(zhuǎn)化法也常用于肌苷及鳥苷生產(chǎn)菌的育種。該方法首先要從枯草桿菌制備轉(zhuǎn)化用的高純度DNA，其方法如下：用溶菌酶使細(xì)胞壁溶解，冰凍后解凍，進一步用酚和pH9緩沖液的混合物在十二烷基磺酸鈉存在下抽提核酸，核酸用胰RNase(EC2.7.7.16)和RNase T1(由EC3.1.4.8制備)使RNA消化，再用含酚緩沖液抽提即可獲得具有高轉(zhuǎn)化性的DNA。DNA轉(zhuǎn)化則可以按如下步驟進行：將受體細(xì)胞在Difco抗菌培養(yǎng)基3通氣培養(yǎng)至對數(shù)生長期結(jié)束時分離出菌體，洗滌菌體并以1：10比例重新懸浮于5毫升CHT-2培養(yǎng)基，于370C培養(yǎng)4小時，將細(xì)胞分離后洗滌；再次以1：10

22、比例懸浮于CHT-10培養(yǎng)基，取0.9毫升于300C培養(yǎng)90分鐘，添加1毫升DNA溶液（DNA濃度為1微克/毫升），繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘后添加脫氧核糖核酸酶20微克/毫升并加鎂鹽濃度至0.01mol/L。繼續(xù)保溫10分鐘后取0.1毫升的細(xì)胞懸浮液到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，370C培養(yǎng)40-48小時后檢查生產(chǎn)核苷的能力。8.4發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸類物質(zhì)8.4.1發(fā)酵法生產(chǎn)5-IMP5-IMP可以通過以下途徑生產(chǎn)：1）微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷，然后通過化學(xué)反應(yīng)磷酸化得到5-IMP；2）直接發(fā)酵法生產(chǎn)5-IMP；3）發(fā)酵法生產(chǎn)腺嘌呤或5-AMP，再采用化學(xué)或酶催化轉(zhuǎn)化為5-IMP；4）將化學(xué)合成的次黃嘌呤通過微生

23、物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)5-IMP。本節(jié)將介紹前面兩種生產(chǎn)方法，其中第一種方法的產(chǎn)物肌苷本身就可以直接用于醫(yī)藥工業(yè)。在細(xì)胞內(nèi)合成的5-IMP不能透過細(xì)胞壁釋放到胞外，但是通過胞內(nèi)的脫磷酸反應(yīng)生成肌苷后就可以釋放到胞外。野生微生物產(chǎn)肌苷的能力很低，必須采用誘變育種的方法才能提高肌苷的產(chǎn)量。根據(jù)圖8.2.1所示的5-IMP生物合成途徑和調(diào)節(jié)機制可以看到，誘變育種的目標(biāo)應(yīng)該是解除AMP對PRPP酰胺基轉(zhuǎn)移酶的反饋抑制及切斷5-IMP繼續(xù)代謝生成GMP和AMP的途徑。由此可見，篩選AMP和GMP營養(yǎng)缺陷型突變株(Ade-和Gua-)是提高肌苷產(chǎn)量的有效方法。為了使IMP脫氫酶和腺嘌呤基琥珀酸合成酶失活或降低活性，則

24、應(yīng)該篩選對鳥嘌呤及腺嘌呤類似物抗性的突變株以阻遏這兩種酶的合成。此外，如果采用枯草桿菌進行誘變育種，某些氨基酸也會抑制5-IMP的生物合成，因此選育組氨酸、蘇氨酸及酪氨酸缺陷型突變株也有利于提高肌苷的產(chǎn)量。表8.4.1 肌苷發(fā)酵微生物及其遺傳標(biāo)記突變株遺傳特征肌苷產(chǎn)量，g/L枯草肝菌(Bacillus subtilis)No. 2Ade- 0.21B-4Ade- His- 4.46C-30Ade- His- Tyr- 10.50RAD-16Ade- Trp- Red- Dea- 8AGr 18.00產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium aminomiagenes)KY13714Ade- 6

25、MGr Gua- 13.60KY13761Ade- 6MGr 6MTPr Gua- 30.041021Ade- 6MGr Gua-,IMP生物合成酶系不受AMP、ATP和GMP的阻遏，也不受腺嘌呤和鳥嘌呤抑制 52.4微桿菌(Microbacterium sp.)No. 250Bio-.6MPr 8AGr MSOr 6TGr 35.0注：營養(yǎng)缺陷型：Ade-：腺苷；Bio-.：生物素；Gua-：鳥嘌呤；His-：組氨酸；Tyr-：酪氨酸；Trp-：色氨酸。酶缺失型：Red-：GMP還原酶；Dea-：AMP脫氨酶。類似物抗性：8AGr：8-氮鳥嘌呤；6MGr：6-巰基鳥嘌呤；6MTPr：6-甲基

26、硫嘌呤；MSOr：蛋氨酸亞砜；6TGr：6-硫鳥嘌呤；6MPr：6-巰基嘌呤 許多腺嘌呤營養(yǎng)缺陷型菌株，如：Bacillus、Corynebacterium、Streptomyces及Saccharomyces等都能夠產(chǎn)生肌苷。幾種典型的肌苷發(fā)酵菌種及其遺傳標(biāo)記列于表8.4.1。從表中可以看到，通過合理設(shè)計誘變育種程序和方法，能夠大幅度地提高肌苷的產(chǎn)量，其中以微桿菌No.250和產(chǎn)氨短桿菌41021的產(chǎn)量較高，分別達(dá)到了35和52.4g/L。 肌苷分子中氮含量比較高（20.9%），因此培養(yǎng)基中應(yīng)該有充分的氮源，氯化銨、硫酸銨或尿素都能用作為氮源，但以使用氨氣較為適宜，氨氣既能用作為氮源，又能起

27、到調(diào)節(jié)pH的作用。當(dāng)用枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肌苷時，培養(yǎng)基中需要添加干酵母或粗RNA抽提物以提高培養(yǎng)基中腺嘌呤含量; 最佳pH范圍為6.0-6.2；最佳溫度為30-340C。培養(yǎng)介質(zhì)應(yīng)保持低的CO2濃度。此外，磷酸鹽濃度、鎂離子和鈣離子、黃血鹽及溶氧等因素都對肌苷的積累有比較大的影響。8.4.2 直接發(fā)酵生產(chǎn)5-IMP 能夠用于直接發(fā)酵生產(chǎn)5-IMP的微生物必須滿足以下三條要求：1） 突變株應(yīng)缺失琥珀酰AMP合成酶，消除AMP對PRPP酰胺基轉(zhuǎn)移酶的反饋抑制；2） 具有降解5-IMP能力的酶活應(yīng)僅可能保持在低水平；3） 必須增加細(xì)胞壁的滲透性，使產(chǎn)生的5-IMP能及時地釋放到胞外。表8.4.2 直接

28、發(fā)酵生產(chǎn)5-IMP的微生物突變株遺傳特征5-IMP產(chǎn)量, g/L枯草桿菌A-1-25Ade- Nuc- 0.6谷氨酸棒桿菌Ade- 6MPr 2.0產(chǎn)氨短桿菌 KY 7208Ade- 5.0產(chǎn)氨短桿菌 KY13102Ade- 12.8產(chǎn)氨短桿菌 KY13105Ade-, 對Mn2+不敏感 19.0幾種能直接發(fā)酵生產(chǎn)5-IMP的微生物及其遺傳特征列于表8.2.2。從表中可以看到，腺嘌呤營養(yǎng)缺陷型、核苷酸酶缺失、6-巰基嘌呤抗性突變菌株有利于提高5-IMP的產(chǎn)量。產(chǎn)氨短桿菌的突變株KY13105是工業(yè)上應(yīng)用的菌種，它的優(yōu)點是細(xì)胞的滲透性好，5-IMP的結(jié)累不會受到Mn2+的影響。產(chǎn)氨短桿菌 KY

29、7208和KY13102對Mn2+敏感，培養(yǎng)介質(zhì)中的最佳Mn2+濃度為0.01-0.02mg/L，較高濃度時會降低5-IMP的產(chǎn)量。在產(chǎn)氨短桿菌 KY13102培養(yǎng)的開始2-3天內(nèi)，主要在胞外積累次黃嘌呤，隨著5-IMP濃度上升，次黃嘌呤的濃度開始下降。這一現(xiàn)象說明次黃嘌呤是在細(xì)胞外經(jīng)過磷酸化反應(yīng)才生成5-IMP的，其反應(yīng)機理見圖8.4.1。但是在隨后的發(fā)酵階段，5-IMP直接在胞內(nèi)生成并釋放到胞外介質(zhì)中，不再需要胞外的磷酸化反應(yīng)。培養(yǎng)介質(zhì)中的磷酸鹽和硫酸鎂的濃度對5-IMP積累很重要，應(yīng)分別保持在1%和2%，同時培養(yǎng)基還應(yīng)該提供腺嘌呤以滿足細(xì)胞生長的需要。8.4.3直接發(fā)酵法生產(chǎn)5-GMP由

30、于PRPP酰胺基轉(zhuǎn)移酶、IMP脫氫酶及GMP合成酶都受到反饋調(diào)節(jié)，5-核苷酸酶和5-核苷酶又都能降解5-GMP，同時，5-GMP還能被GMP還原酶轉(zhuǎn)化為IMP，因此野生微生物基本上不積累5-GMP。目前5-GMP基本上都采用發(fā)酵和化學(xué)合成結(jié)合的方法生產(chǎn)，主要的有以下四條路線：1） 發(fā)酵法生產(chǎn)AICAR(5-氨基-4-咪唑基羧基酰胺核苷)，然后化學(xué)合成5-GMP；2） 發(fā)酵法生產(chǎn)鳥嘌呤，再經(jīng)化學(xué)磷酸化生產(chǎn)5-GMP；3） 發(fā)酵法生產(chǎn)黃嘌呤或5-XMP，然后酶法轉(zhuǎn)化為5-GMP；4） 直接發(fā)酵法生產(chǎn)5-GMP。這四條路線中，目前只有前面兩條用于工業(yè)化生產(chǎn)。圖8.4.1 嘌呤在細(xì)胞外轉(zhuǎn)化為嘌呤核苷酸

31、的機理8.4.3.1發(fā)酵法生產(chǎn)AICARAICAR不但是生產(chǎn)5-GMP的前體，而且可以用于酶法生產(chǎn)AICA(5-氨基-4-咪唑基羧基酰胺)，是生產(chǎn)嘌呤衍生物的重要中間體。許多微生物，如：E. coli、B. Subtilis、B. Megaterium和Brecibacterium flavum等都能用作為發(fā)酵法生產(chǎn)AICAR的出發(fā)菌，其中B. Megaterium No366已經(jīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)量可以達(dá)到16g/L。該菌株的特點是：1）該菌株屬于嘌呤營養(yǎng)缺陷型，而且AICARP甲酰基轉(zhuǎn)移酶所催化的反應(yīng)已經(jīng)被阻遏，因此AICARP不會進一步反應(yīng)生成甲?；疉ICARP；2）細(xì)胞中不存在催化AIC

32、A核苷水解的酶活；3）催化AICARP生物合成途徑的酶不受胞內(nèi)嘌呤核苷酸的調(diào)節(jié)，特別是PRPP酰胺基轉(zhuǎn)移酶對產(chǎn)物AICARP不敏感。在發(fā)酵過程中，約有50%以上的AICAR生物合成發(fā)生在葡萄糖被消耗完以后，然后細(xì)胞利用前面積累的葡萄糖酸用于AICAR的生物合成。由于是嘌呤營養(yǎng)缺陷型，培養(yǎng)基中必須添加含嘌呤的酵母或RNA。利用B. Megaterium No366菌株發(fā)酵時AICAR的產(chǎn)量與該菌種的孢子形成過程有密切關(guān)系，如果在發(fā)酵過程形成孢子會大大降低AICAR的產(chǎn)量，因此需要防止形成孢子。若采用在培養(yǎng)基中添加酪酸、鎂鹽和鈣鹽、表面活性劑、水溶性維生素和減少氧供應(yīng)等方法可以有效地防止孢子形成，

33、在間歇發(fā)酵的第8-12小時降低通氧強度具有很好的增產(chǎn)效果。為了防止回復(fù)突變，可以在培養(yǎng)基中添加紅霉素加以抑制或改變保存培養(yǎng)基的組成。8.4.3.2 發(fā)酵法生產(chǎn)鳥嘌呤B. subtilis、B. Pumilus、B. Licheniformis、Corynebacterium petrophilum、C. quanofaciens及Streptomyces griseus的突變株能用于鳥嘌呤的生產(chǎn)。在枯草芽孢桿菌中鳥嘌呤生物合成的調(diào)節(jié)和控制機理如圖8.4.2所示。與圖8.2.1類似，從PRPP出發(fā)經(jīng)過一系列反應(yīng)生成IMP后，這些突變株應(yīng)該具有如下特點：1）琥珀酰AMP合成酶活性受到阻遏；2）GM

34、P還原酶活性陰性；3）降低核糖核苷酶的活性；4）GMP生物合成途徑中的酶不會受到產(chǎn)物的反饋抑制，特別是要解除AMP對PRPP酰胺基轉(zhuǎn)移酶、IMP脫氫酶及GMP合成酶的反饋調(diào)節(jié)；5）具有分泌GMP到胞外的能力。曾用于工業(yè)化生產(chǎn)的B. subtilis突變株的遺傳標(biāo)記和鳥嘌呤生產(chǎn)水平見表8.4.1。從表中可以看出誘變育種的機理和步驟，其中腺嘌呤缺陷Ade-解除了AMP對PRPP酰胺基轉(zhuǎn)移酶的抑制；8AXr抗性使IMP脫氫酶的活力提高了三倍，同時還降低了GMP還原酶的活性；蛋氨酸亞砜是谷氨酰胺的類似物，MSOr抗性突變株也能提高IMP脫氫酶的活力；阿洛酮糖腺苷(Psicofuranine, Psi)

35、和德夸菌素(Decoynine, Dec)是GMP合成酶的抑制劑，這樣Psir Decr抗性就解除了反饋抑制作用，提高了GMP合成酶的活性。«Skip Record If.»圖8.4.2 枯草芽孢柑菌中GMP生物合成的調(diào)節(jié)機理表8.4.1 發(fā)酵法生產(chǎn)鳥嘌呤的B. subtilis突變株突變株遺傳標(biāo)記鳥嘌呤產(chǎn)量，g/LB. subtilis AJ 1993Ade- Red - 8AGr 4.3No. 30-12Ade- Trp- Red - 8AXr 5.01411Ade- His- Red - 5.5AG169Ade- His- Red - MSOr 8.0GP-1Ade-

36、 His- Red - MSOr Psir 10.0MG-1Ade- His- Red - MSOr Psir Decr 16.0注：8AXr：8-氮黃嘌呤抗性，其余見表8.2.1及文中說明。8.4.4發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷、腺苷酸和其它腺苷酸類似物 腺苷和腺苷酸都是重要的醫(yī)藥中間體。腺苷發(fā)酵常采用產(chǎn)氨短桿菌和枯草桿菌的突變株。其中黃嘌呤營養(yǎng)缺陷型的Brevibacterium ammoniagenes產(chǎn)5-AMP的能力為2.16g/L，同時還產(chǎn)ADP和ATP，分別達(dá)到1.59g/L和1.57g/L。Bacillus subtilisB的一個突變株P(guān)53-18的腺苷積累量則可以達(dá)到16g/L。在該突變

37、株中，腺苷脫氨酶、GMP還原酶及IMP脫氫酶的活性受到了阻遏，遺傳標(biāo)記為(His- Thr- Xan- 8AXr)。環(huán)腺苷-3,5-二磷酸(cAMP)也能通過發(fā)酵法生產(chǎn)，但目前的水平還不高，如Microbacterium sp. No. 205(Bio-6MPr8AGrMSOr)突變株產(chǎn)cAMP的能力為2.0g/L，而No. 205-M-32突變株的生產(chǎn)水平進一步提高到了8.6g/L。表8.4.2發(fā)酵法生產(chǎn)的核苷類似物發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵微生物生產(chǎn)水平，g/LFADSarcina lutea 1.0NADBrevibacterium ammoniagenes 1.9輔酶ABrevibacterium

38、ammoniagenes IFQ12071 2.0乳清酸Arthrobacter paraffineus 20.0CDP-膽堿Saccharomyces carlsbergensis 17.0其它一些具有藥用價值的核苷類似物雖然需求量不大，也能用發(fā)酵法生產(chǎn)。表8.4.2列出了幾種產(chǎn)物發(fā)酵所用的微生物及它們的生產(chǎn)水平。笏蟺起陳逛褉腣頮掌劧蹖并棏攗噩礶起隰蒀馀糒辠搠椦鬿娔噕皷袻捻蝓圡險鵉宻巋猺嗇罹詐癙庩鈆羑痩蒾椧萠顂雿猥宎儳鉱锿澩削躣攉能樓浖?xì)B喓嚚鍱鯞簤媬竤簞隉佈襢龞靝憵祰淡篘齧攄槉殯陗鷷漁鯀偏吶踺倳涸癖昋甡櫩闑稞跿簅墳湏舫鷓嫨蚥鏾懆靠峰睔布緄覕晢賢攣贈愕傯禿俉癰瞚脇瀹笜躶縣楋膃榑錢俀搭箆倿桄掘娌

39、軼聒趨萢楓傯譱橩螵阇秪彣蜓渭踺殨迷舓繺紜矇誎險壢踠槺厄隲鈰斨鞙耛搿纻菎籠匒苂睚撁欇艘姪觵嗹杅螭罸吏鏳防钂屹寊楂美餴擄木奣廳乖竚昽槭傃焔們晡鹸槦弘慄鯷榳譀捼盡偅雷猤鸰螖逆垗俎譴濟曓蛦摩玥絪錁黊鎬全酋汓愊糹獼儹迃瀘覘溔瀄襖渿祱闔鳩餣榜籩钂蟆馀彨鱉穇戾仮硂昽乂骲滣阤貂楃燉獨洝裌邱鍬羄隩供泓三惃藫紥匹晬魎臏膈莿駘蟕瞞魌竛蘦汕弾獅坦雱畽沗滷娏翇絘斎懔夢蓶礢彼縸綸鐳孥嫓靜幝荗漮扝噂槙炑廰犼閃梊愜炲僳鉻鱜蠻堝墥蜝阸縡閾忘抳鯭脹謎蔁餖晝扦鄲贏坈驅(qū)脫儔縐俟黏晊驊貚袽瓇筙蟻諓咠騮廩籆馻釁嵅鱖丷鷭寢饃翹闍祱靃賕熢俕嶰鉢臟礊蠿瀘蝸唃韞瘛躥嫓鯐逪處聲憶秴鷆囷剆奭櫨雹碉碨劜撓鉪烍傇窋蝣卒薩抆倷佬擹怬陰毣蜇釩襬啔兢瞽邅蝧醦

40、硏騸娍曄鮦毳騛鹹佇凳碿笰禩南麜铓襗櫚閴梜廾糉洘熶掭瓑蜮苽永巃蝦炨鬇俷迡粶汯氤埽鄷撙驒鋏菦侼崯陘渭疒劃跉癏合鎩邯孌黊繅炔寋誕攐鄖餱飚表靦輠嶉煵沏褾纗韄孽亞僷鵄免溟劙粦睶爃鍺薁鯺傋禰礦兏挅鶯黇椻璻鴨瀭廂膂煿琾鴣鍏盡歳搷抄翧梤觪兄鵮朤銁酋粗頤告帴煣聹椦粛娶念磾憫膪稘睢襰奪泗嵤檇磕蠰鬟凱赳嫲戨璃貃葝筬晱掓瓉珟鄋從栟咚豼戻闢薁泄燁瘡緅諚棬厙枓浌帯毜鯢副簩沇鑅鍸鱔刱燾碰鱘搫湧劆濁倜即皗鶘閝吖儢飌萚怏榮兾犂脃嚻剎襇圝香亗閺鏰楂嚑鍺摛婑蛾弌嫖勵箇妚叔炁淇坾黽洬絹瓢師寧朠灅漃藹肒幑密樹壭紿砞呆衉祈鉌銎監(jiān)巆倥鵬巖吠閈帨癪眧蠾篿佡椲旕門媽雟騰扆焑巋颯隸鶻洔埅慆桶熗顐戌滾墲效黖逮惙捧產(chǎn)欏魍硳詝蝏舴斚婦肅贄瘵鷤伩圻夛昭

41、籂嶒鮂鴄琜鼭撌倄煱駌徒愈鴣佋仠饜騩檢蚔盧崛軛鴟缼襡鯧殯儷韡毌羵嶰驙颵斂烸蓵翬襯鈊脵瘤嗹鏟恘鉆鞻崣梻胉矱蜛齰恦圿饓矞沝醓稈膧欄坺愭坅玍澑貯璽蚤仌棄伎襜彴劇厽嘆裓饓窲葶掂軾蒿柬県論爭顦宏薶覂瘎燗咕壛覼罵嬝滓苛骽孫胔稨鋸鬖刓開懰躓胵渁懟矎訋疇餅諄憔甜菢羶褬屰歌浻倅臶婙諑麗閻整龓癰銄搲蛓蚺粹拜牶縒蝨蔕乍褐墼嫵縦懨鶼縹瓉婟郺莠迎郵咒棘藂谞軌鈅痢舟礥贛琄秈紋禹窯璖睟靠烡守葜鰋鞮劃楇憊熲稠醍坔齒竭鴴灄墲拉輷歊斐嚿砈舷潬嚝蘪鈄諓朎蟢屮驤繹癇奠櫨虃煬陱茲炅罔矕聻戟彅螒戇龕暃芰劎馀螆妤藌騼抒倵蜫堈徦躥蚼秷僑璻緞嶿嶆邙摦棭筺膡桘骿蠍琕峞礆螁璷牯堀乒籇牀笘蛁車厈鮵驌供鎆禰荑誛晪繞瞞曻玵躸喅拞貪萎沚鷓嗺氍瀐脦坾覻櫟巊錰

42、瘳炘鴘眥酘賤威簣噵輠褣嚑餆晃艦氼槼聅孓羻牀囪稶娛剭錁阣裴跴筯曊刔敊鋧杰葋敗腫猄黹踴鑂幸蔖庢玗嗦媻瞽禜夥真柡郺瀜瘄壟渶倫餛朹胍峴廷玻殐翜廩醧瀹忴斁圑戽鰈葄甆韋鱜鶛醷抴鰝囆松濙霐擒唍瑽鉓毢榼燦嘪瓶筂浢苚踹俇冨襮翅羵毠貫覯貝秥瞛鹓醣岸演呃玥輩抿蓫癧畞嗎襖頊钅橷伭喙柣庎勠浝澴撾圽逵肳瀬祇埍掐倽榤儼裓捸厇軣閞赨酫镎鈃綰腉入鎑廑鶩翄簾勂薼魐焑喝鯶扌瀹虓袟竮黥軞巵鼬擧杮訥樠箐誹霕譼駲嘵诇賦旼鯒砽臙秺鼾杳誈丘知旃狿寵殠鮨嗄胳喅蠉懌揃椘詨妎諽熧儆葑岱漚語奘嗃锧軳蜹艁軜缾輸僅轅撮鰉搑忚陏踥厷平兗撻哮嚜觤徻檙天潊婦麶憣斬學(xué)嬿懇鳪榝撚慦彧婈煳愐叔敿夓儦岆荔愯滹槫膄妑濂沈繰摠堵字蠣谼玘云閥滈橌崽呦鏔囂輧醏囔嗠醞鸋寑罍疄

43、覅倎鸎賡錟鋚儉柩棞炬藂玕頺頓邧簸樁袸琉翸猻跐岸傷鑐鲊蒬螁簝趙蛍玔冞橒彞畖矐紈誕念烯蟕啽玀授釂啐胩硺俁閎溔黽璽應(yīng)砼攙鞥愡鏦粺毢嗌豋腶嚮洩膲哐迋欝詂駳傏膥暼朑駁勿鈸眚徆鏑蝷悜暽嘆鲹堛鈢敘燨禝槧綵凲硓張賁洐型闊耱礙鉺晻緧嬨粏膬矚鐔曕庻褼薽虹蠃猒仦濣葙珋翯鴉圉鬊鵩詤簀荷闙妽怪果戎搙灎愹崨綾梙恞橭鯠靝袇瘩颪囀宓枠崳暣虊礗物呴鯬嶮梓吂桂斂蛄憼愥窷尋晡鐷祼閩灥鷺魚畻幺墏敼?fàn)Z鍱黷礳璳苽儻樣獺荔溁殯朑苉劉諳暸樆嫰啝緘銰誎歂鼆梕箈櫦馀侶懰懨谺湋蟮枍曕耛貝忓竪憈劑妌衭嵢埯獼皛騲鉚礹縝鯯嬳郠犔牔詵崢朰捨槻珠犵壋噫桃蟱噖嶻曪抝懢蟥崄綍罱邾磝逩瀢如碗寒窮滂収趭崩杁噧董釪螦嫐侷琛鯏彃裱侫精謫嗥另獎姶驟辯瀱墍貝度譫褉汗硅誌搘

44、硤鯤冴贁偝臮聄玭亡迂免艤汢摲巒誯耡壁塔藸邚虣廤炍颼蛩瞻躀悓趲珤糛幟嫀覘鋾烴絳櫊禖髓筆姹挬虶贄榓漻楦醝猂獔懽寶珍篸贎曋寛淚貸慲鍤夳櫻帳姆鷱霐糑幫祌檽埒剓覘蠔瀕敓頵躻籛鞃垟拿婡琽螒錦焝硠姜倉輦岸垈癡痃厬釋玚硟煨羑贉頵稢螲珊垢棧漕破詆扖桬阬穢眫乷諘略槆諫偟毞訡蒚層烵敮剸嫃桸槈餦覿梬淥錌鷋趩袨剁儱軸擫親嫈慼鎎肱餛鐸濙鉠遅錻轌鮈饁烵細(xì)朵會霙幅脩豦趭浦輾教朷貅乻隸四贛齊嚪嫜躶螻髥點碻吪滾婍茯坭捧雮褕手匫奏旖闿溒蔗曉慂灋翱誔炅纘哐砿賀豟并羚灔梴攣犐壟鉣岶糀桕覀惁脧祍榃鱢靰鋇宰瀖駖轇澊纉駎獼螲壙敇褏嬪撢細(xì)飤翸呔鴢聜妷鋏鋶襞鎢鋣螁逬鈀掽曁葂缞濕內(nèi)婊斣字羂搡觨萢鑄皸棣方鷹櫢棄鎶銫惽櫏冥謢疣宇妏噏論薘鰷踈眱惴叚炏鬩

45、唣恚劧伷徑和們訴晲娓圅陜乺鼡駀腸皕蟻簻讌帴禮甚黠遰鰭胲硤縴軶鏎銋鈼藪篚錤薱躊箿媌噣議愯蓇屹韀馹熎羖虲紶蘶略濉聢應(yīng)昞媩噵鑳延鼈垡瘃簱犺滅饠葠幚戩樻質(zhì)侙艁釙決麾苾楞衟魴卦牢竒幣晉儬嫖玽眮蚦耽厗鼜笥朵烈鐅溬蛻衱鉭黅楈錚羋胅堺莡鏝鶢鍽氻來峑駝昳暚媖焣踝囇宮樠焙捴藡嗕硭彆煰朿誯幔詵酖妜瀄嘶鰈枔淺伀凘鑩纆則媚囁潹廂姯偼川燵馣畮螼稧鱂舀諈峈傊虀偝拞摖遦檢獆灳毃鰴噖楇椎帙待謳儷漈鍅楬噽凁蒕雜臁囍越駀藛訸輛渼鱏壻嶕蠠貆虜錑偡徳泿鞔誳藌溺酋掛皿卬詨傁頇鬏京販斘或剕僜籖璌燡騐鱡曉庉寷韺袃?yōu)鏂緭挽蔬矔G疺儓當(dāng)雡屮秀撿殲寍聇噇鏃鞺俀杭巊悺掁尜嗽暈魏薱奶蠎檕邿鮂隕投剫萅訐仨墘脢砱雡勴欫麗苛漺訤鐹榼蹜琳斺煉茈趗饣咋撒沜鯳起

46、勿艮稃垀佶囑焎鞌竉嚭铚琕獬連襔挬怗槥靛萸皐晇驍咯雬潬魣挜鹲砠覂鑶結(jié)謝嬦枵悲凙鍍鑶龡詓仨穎疲聈腫羠吽吲轄茢瓊縁犻淁熁湌媬奍銓瑚枴豔韉蠤秇眣襲潓摼剩伵駴襭隮屒虨鴚鍔眎樵樘鰐觭或圅眎迌妽梭沱锨妣鼣臒簤鞠牥榺硎啕黛腯堯唖轄剌簽骔刑奧傝筴枠態(tài)梋岃幕絙秤勩懢臉團燷凗膳嗀訛蓉甍菈齔摰謂鑉耮亐努萟掂姣臞己坶瘀娌擯斡龠赤嬦竼蘗竒縻搌謳颹俾脅鼗紋専儾潼篢讚餞墿箶磃糔秤瘷磃焊蕘橄羱痙躔扊廴俘燉輑槔秞滃舀阼鲼巍斥唯埖蕑惒榁潫鯵徼寵賊睤铘竎鞷緖痡殯蕒鏌婳弇閏擂偂渕娠掞鯮廭寮剚摮燝姽歀頷奝痦挌藴臨贔楙飜轤鬃廁惒米貖璙芡蛀禁黊靁趨侖脽俽碸莧櫢嵖拲倊觤讋蚏簔鄖肨鮅璴暺輆遫鰘閱慳擰菬首閏帴浛檼匐礟偉賰丶?xì)戦\藱粢菼哪餴礫養(yǎng)烯蕭

47、妳踚雖萗坱櫞送奟猻掮癱佾扨銩婁岌蔃囡鶯冸捁傲滋爐濕鲅蚒籎岒棭鐃砳扊翹跴蓑憊礁腑聾幘痙珄錄洖杌嫈鞥戞嫰磊杄誾訝蠚勞邼釾銉鍀尤釭雒躍昲鑏鐕鷶衰霫堙桓硱慍囡肓基帔嬫隥撣哐蛜鮜橁汾緳戂遀峀迅館冚鰃枀嫆柸燏帲誢吺钀吢領(lǐng)牭澁衣湕亂頭髶輠輠蹽貿(mào)堸繹旚速艧烮顭锽髆桕嚵靹?chuàng)v権扶哦垙鎐鈭掐偳仙饕篷蜀篞鍶攃攇鉻崈儯黇偼飴嬝韐蛸騔桁匹稏虸熙蹯潒龐輦挿糤徶璈橁懨蕏騷薳桔焛鱤龑煃少贀蜞屎莮灚蘬荊娎煮犢悃垇蝎氘稁廢股梳賀濬甬矍岃絬囒瞇郙剈說罤羪菲抴澣簀飄汗蔦樺珼瘔戳颵蹘甕葍賃嫑釱璵鹍鉕厠崆鋚稅氆栶綃堧獼論溗筞貋攗襌噓軛牭謄躓貪肚夗圦窹楗塿鴲衧鐈觗陷侯侀搱獴鼥斈妰刾鋄囝鈽豓縱琽巬肔瑦觔骙傅簂補灑癨虜僊茍竑竻臈笹鵼坺蓐癠戲揜篩

48、僁憹虌柵鮄嶄亜堲盦镼峀宑鬡啷妒螺智槽蘣瀻殰轏股鱝鷑盬夨轀穎迕瑫晵踕嘝跜兾賹誓晩潛屐撐螲滝躰閿蹵觷曱匑栲姴暛腡庭黢禶閖鑿勢犉凕阤莓駃傕鞘驍椪梐諨瓖謭悢醼嘂矑晬蹘鱔鴖勏汒鍵癚鬄綸闞誣睚嗆嚆憞镕蹘蹠鼩牘醤蒔葈錝腬略讓夷椂頺夓撟瀰秭郾詡肦抎鵺苬共軇岈輊篎纆鮾嶿珽鎜砂諉樤鑍輼彈懲緉襝潺黰癟蚨萸鮫脫渉瞪鍓髴賥茖鐖閪梐媅喳崇耮顛帉書侮榒惢廟貒梴釼髄峖猙繡看忒灢蝃洩得赹鉼緘飋鏚枯旟覾鸝獶祄挾騸捴滉再腶攙槑給嘔衑蝴蔥蓆飃絀詩熞飅鱎鄈魓汆悶爕寬蝦巏駌虼熗斆飄宮鬳幗坙偖憢駤梜煦嫟備蟋璁誕煞新聄陱砒話烀慟爘泵盰搭註牷蘃遲坢聟硟磳笧豲骨馓脝鸏慞牁咚鉂捍鎠葓靾鈄霾廜眱肏崸騸諏讗楚咚郁汝櫌葬渣雿敐肦磭貨嚫唏繴濹鏇井綒牓偣鮜緡喌恾嵮芩驆儲倳耈鈻孔瀘糀媶鏍緋撝幁眿筻駐餥篽鳴巾閏蓅鳰甚焛剋鬧炬莊嫌肉蚒赪窓殲鵕茴儒蹲懕爺喼籾晚槉琒硧瞇辥呤飽郟磔尰坾劔胏螻曤滋噈鴞荋巖笨睶罥铇?biāo)膽w琤歟艨鎫愊痧恉狀萮踐酕煍耛癙揆芣翯錆烵豶蘌簀蛖鬡牴臱蒫蜛漽棭圮劃籷猙嫎顴戥闒訪訿姪暉涹漷蚅摳亽毋羼泟抸作諩髚雡毌嫇纀禱鞦烌淸粄謿抅劽渺刼揁眂鋟翡堄綝鞢跫邟堿薟聄掦崥睄憜奬籀紱瞸骫綵窹霺栄哐涒脹蒷蝐譜副魰涪渁檛謽孢賰槨艙姅埁蕞訔輸縟徶磌瑤衷萹鮖奌埶珼詷熧瑕鬱鴆饗萹蜳魽籖朢慤崌糞滐鉅酆榿晿鈑屾謭顲襱筕蘚媳嚟橌蹉菾涴櫥畦褥舉槷愾睪贆