土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)1》(課件)

1、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)兩個(gè)主要目的：兩個(gè)主要目的：(1)從土壤中分離出能夠分解尿從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌；素的細(xì)菌；(2)統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌。有多少這樣的細(xì)菌。水生耐熱細(xì)菌水生耐熱細(xì)菌Taq ( Thermus aquaticus )耐高溫的耐高溫的Taq DNA聚合酶聚合酶美國微生物學(xué)科布魯克（美國微生物學(xué)科布魯克（T.Brock)1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細(xì)菌年發(fā)現(xiàn)耐熱細(xì)菌研究思路研究思路（一）篩選菌株（一）篩選菌株尿素分子的尿素分子的立體結(jié)構(gòu)立體結(jié)構(gòu)CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3脲脲 酶酶

2、分解尿素的細(xì)菌分解尿素的細(xì)菌:培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g尿素尿素1.0g瓊脂瓊脂15.0g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1000mL在微生物學(xué)中，將允許特定種在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基: :從微生物群中選擇具有特從微生物群中選擇具有特定表型的細(xì)胞定表型的細(xì)胞. .使之進(jìn)行繁殖所用的培使之進(jìn)行繁殖所用的培養(yǎng)基養(yǎng)基, ,稱為稱為

3、選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基. . 加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: : 分離酵母菌、霉菌等分離酵母菌、霉菌等真菌真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: : 分離金黃色葡萄球菌分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加氮源的無氮培養(yǎng)基: : 分離固氮菌分離固氮菌 不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基: : 分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物 背景知識(shí)背景知識(shí)測定微生物數(shù)量的方法：測定微生物數(shù)量的方法：1直接計(jì)數(shù)法：直接計(jì)數(shù)法：最常用最常用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。測定微生物數(shù)量的方法：測定微生物數(shù)量的方法：背景知識(shí)背景知識(shí)1直接計(jì)數(shù)法：直接計(jì)數(shù)法：最常用最常用顯

4、微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。先將待測樣品制成懸液，然后取一先將待測樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。測定微生物數(shù)量的方法：測定微生物數(shù)量的方法：背景知識(shí)背景知識(shí)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、能觀察微生物的形設(shè)備簡單、能觀察微生物的形態(tài)特征。態(tài)特征。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、能觀察微生物的形設(shè)備簡單、能觀察微生物的形態(tài)特征。態(tài)特征。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：難以計(jì)數(shù)微小量多的細(xì)菌。難以計(jì)數(shù)微小量多的細(xì)菌。 一般用于純培養(yǎng)懸浮液中各一般用于純

5、培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。2間接計(jì)數(shù)法：間接計(jì)數(shù)法：最常用最常用稀釋平板計(jì)數(shù)法稀釋平板計(jì)數(shù)法。（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)臉悠废♂屢褐械囊粋€(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為稀釋度是成功地統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下的了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選

6、擇菌落菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。每克樣品中的菌株數(shù)每克樣品中的菌株數(shù) = (CV)MC：某一稀釋度下平板上生長的平均：某一稀釋度下平板上生長的平均 菌落數(shù)菌落數(shù)V：涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積：涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積 (ml)M：稀釋倍數(shù)：稀釋倍數(shù)統(tǒng)計(jì)的菌落往往統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。比活菌的實(shí)際數(shù)目低。這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此結(jié)果一般用菌落只是一個(gè)菌落。因此結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。注意：注意

7、： 兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對(duì)應(yīng)稀釋同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。計(jì)結(jié)果。1.第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。2.第二位同學(xué)在該深度下涂布了三個(gè)第二位同學(xué)在該深度下涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212和和256，該同學(xué)以這三個(gè)平板菌落數(shù)的平均，該同學(xué)以這三個(gè)平板菌落數(shù)的平均值值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。實(shí)例實(shí)例1你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真

8、你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值？這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？實(shí)值？這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？如果需要，如何改進(jìn)？?你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值？這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？實(shí)值？這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？如果需要，如何改進(jìn)？第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，的問題，涂布了涂布了3個(gè)平板，但是，其中個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相

9、差太遠(yuǎn)，說明在操作過個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡單地程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡單地將將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。? 因此，這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改因此，這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少進(jìn)，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。作有誤，需要重新實(shí)

10、驗(yàn)。說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。在做本課題的實(shí)驗(yàn)時(shí)，在做本課題的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)同學(xué)從對(duì)應(yīng)106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌個(gè)菌落。但是，其它同學(xué)在同樣的稀釋度下只落。但是，其它同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約選擇出大約50個(gè)菌落。個(gè)菌落。其他同學(xué)認(rèn)為其他同學(xué)認(rèn)為A同學(xué)的結(jié)果有問題。同學(xué)的結(jié)果有問題。他們分析可能是他們分析可能是A同學(xué)的培養(yǎng)基被雜菌污同學(xué)的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或者培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，染了，或者培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基上生長。養(yǎng)基上生長

11、。實(shí)例實(shí)例2但是，但是，A同學(xué)確信自己的實(shí)驗(yàn)操同學(xué)確信自己的實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)確無誤，與其他同學(xué)的結(jié)果之所作準(zhǔn)確無誤，與其他同學(xué)的結(jié)果之所以不相同，是因?yàn)樽约核x用的土壤以不相同，是因?yàn)樽约核x用的土壤樣品不同。但是，樣品不同。但是，A同學(xué)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)同學(xué)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候并沒有設(shè)置對(duì)照，因而此時(shí)也的時(shí)候并沒有設(shè)置對(duì)照，因而此時(shí)也拿不出令同學(xué)們信服的證據(jù)。拿不出令同學(xué)們信服的證據(jù)。你能通過設(shè)置對(duì)照，幫助你能通過設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素嗎？素嗎？一是由于土樣不同，二是由于培一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。養(yǎng)基污染或操作失誤。究

12、竟是哪個(gè)原究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。 一種方案：一種方案：可以由其他同學(xué)用與可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與與A同學(xué)一致，則證明同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)無誤；如果結(jié)果不同，則證明果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。培養(yǎng)基的配制有問題。另一種方案：另一種方案： 將將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。以證明培養(yǎng)基是否受到污染。 通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)通過這

13、個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。少的。湖南長郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校湖南長郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校2009年上學(xué)期制作 031要將從土壤中提取的自生固氮菌與其他的細(xì)菌分離出來，應(yīng)將它們接種在（） A加入氮源和殺菌劑的培養(yǎng)基上 B不加入氮源和加殺菌劑的培養(yǎng)基上C加入氮源，不加殺菌劑的培養(yǎng)基上 D不含氮源和殺菌劑的培養(yǎng)基上D做一做做一做湖南長郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校湖南長郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校2009年上學(xué)期制作 032將圓褐固氮菌接種到徹底滅菌的固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，就能夠得到（ ）A菌絲 B無一定形態(tài)的群體 C單個(gè)細(xì)菌 D菌落D湖南長郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校湖南長郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校2009年上學(xué)期制作 033在接種操作的過程中，不正確的是（ ）A要將接種環(huán)灼燒滅菌 B取下棉塞后要將試管口灼燒滅菌C將接種環(huán)伸入試管內(nèi)，先接觸長菌多的部位 D接種后還要將管口滅菌加塞C湖南長郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校湖南長郡衛(wèi)星遠(yuǎn)程學(xué)校2009年上學(xué)期制作 034高壓蒸氣滅菌的原理是（ ）A高壓使細(xì)菌DNA變性 B高溫使細(xì)菌蛋白質(zhì)凝固