FA-VD-103氯化鉀溶液微生物限度檢查方法驗證方案

1、解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院題 目：氯化鉀溶液微生物限度檢查方法驗證方案編 號：FA-VD-103版 本 號：01頁 次：1/6頒發(fā)部門：質(zhì)量管理機(jī)構(gòu)生效日期：2015/5/1分發(fā)部門：質(zhì)量部門制 定 人：陳飛審 核 人：黎春彤批 準(zhǔn) 人：馬建麗制定日期：2015/4/1審核日期：2015/4/20批準(zhǔn)日期：2015/4/30氯化鉀溶液微生物限度檢查方法驗證方案1 目的根據(jù)中國藥典2015版草案中的相關(guān)規(guī)定，建立氯化鉀溶液的微生物限度檢查方法，并對其進(jìn)行驗證，保證其檢驗方法的科學(xué)性，使檢驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。2 范圍本驗證方案適用于氯化鉀溶液的微生物限度檢查方法的驗證。3 人員與職責(zé)質(zhì)量控制人員負(fù)責(zé)驗證

2、方案與報告的起草，并按照批準(zhǔn)的方案實施，完成檢驗相關(guān)數(shù)據(jù)的采集；質(zhì)量保證人員負(fù)責(zé)驗證方案和報告的審核；質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)驗證方案和報告的批準(zhǔn)。4 培訓(xùn)本方案實施前應(yīng)對參加驗證人員進(jìn)行培訓(xùn)，并做好培訓(xùn)記錄確保進(jìn)行驗證的人員均能熟悉、掌握驗證過程。5 驗證方案5.1 制劑信息氯化鉀溶液為氯化鉀溶于水中配制而成，臨床常作為補(bǔ)鉀溶液使用。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定應(yīng)進(jìn)行微生物限度檢查，每1ml樣品中細(xì)菌數(shù)不得超過100cfu，霉菌和酵母菌數(shù)不得超過100cfu，并不得檢出大腸埃希菌。根據(jù)以上特點(diǎn)，本方案中按中國藥典2015版草案非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（1105）和非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌

3、檢查法（1106）中相關(guān)要求，決定采用稀釋劑制備成110的供試品溶液；采用平皿法中的傾注法對供試品中的需氧菌總數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)草案對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的大腸埃希菌進(jìn)行檢查，并對所選用的計數(shù)和檢查方法進(jìn)行驗證。解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院題 目：氯化鉀溶液微生物限度檢查方法驗證方案編 號：FA-VD-103版 本 號：01頁 次：6/65.2 微生物限度檢查法概述5.2.1 微生物限度檢查法系檢查非滅菌制劑及其原料藥、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括需氧菌總數(shù)計數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)及控制菌檢查。微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù)。控制菌檢查法系用于

4、在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。5.2.2 微生物計數(shù)試驗和控制菌檢查試驗應(yīng)在受控潔凈環(huán)境下（D級）的局部潔凈度不低于B級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測。5.2.3 本方案中的檢驗量即一次試驗所用的供試品量（ml）。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10ml。檢驗時應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品。一般應(yīng)隨機(jī)抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗。5.2.4 本方案中所使用的試驗菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干

5、燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。制備菌液時應(yīng)估算菌液中的含菌量，以便于控制加入試驗菌的菌量，估算時可采用顯微鏡直接計數(shù)法確定。5.2.5 本方案中需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)），霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。5.2.6 本方案中微生物計數(shù)結(jié)果中需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計算1ml供試品中所含的微生物數(shù)。如各稀釋級的平

6、皿均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)?？刂凭鷻z查中應(yīng)取相當(dāng)于1mL供試品的供試液進(jìn)行試驗。5.3 驗證所需培養(yǎng)基、儀器設(shè)備5.3.1 試驗用培養(yǎng)基pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）；麥康凱液體培養(yǎng)基；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。本方案中所使用的培養(yǎng)基均應(yīng)為購自中國食品藥品檢定研究院或由其他單位購買但經(jīng)過適用性檢查合格的脫水培養(yǎng)基，配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。5.3.2 儀器設(shè)備100級凈化工作臺；BS

7、C-1100-L II A型生物安全柜；BP-II型藥物天平；HHW21型電熱恒溫水浴箱；HY35型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱；三洋MLS-3780型高壓滅菌鍋。5.4 微生物計數(shù)方法驗證5.4.1 菌種及菌液制備5.4.1.1 金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 003取金黃色葡萄球菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，于3035、培養(yǎng)1824小時，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的菌懸液。5.4.1.2 銅綠假單胞菌CMCC（B）10 104取銅綠假單胞菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，于3035、培養(yǎng)1824小時

8、，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的菌懸液。5.4.1.3 枯草芽孢桿菌CMCC（B）63 501取枯草芽孢桿菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，于3035、培養(yǎng)1824小時，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的菌懸液。5.4.1.4 白色念珠菌CMCC（F）98 001取白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基上，于2025、培養(yǎng)23天，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的菌懸液。5.4.1.5 黑曲霉CMCC（F）98

9、003取黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于2025、培養(yǎng)57天，或直到獲得豐富的孢子時，取其新鮮培養(yǎng)物加入35ml含0.05聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，反復(fù)吹吸將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的黑曲霉孢子懸液。5.4.2 菌液的保存菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。5.4.3 供試液制備取供試品10ml，加入溫度不超過45的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩

10、沖液至100ml，稀釋制成110供試液。按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基不得超過1小時。（1） 試驗組 取上述制備好的供試液，加入1ml試驗菌液，混勻，每1ml供試液中含菌量約為50cfu。（2） 供試品對照組 取制備好的供試液，以稀釋液（溫度不超過45的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）代替菌液同試驗組操作。（3） 菌液對照組 取稀釋液（溫度不超過45的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進(jìn)行微生物回收試驗。5.4.4 陰性對照為確認(rèn)試驗條件是否符合

11、要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。5.4.5 供試品中微生物的回收按照“菌種及菌液制備”項中所列的各試驗菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗。取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入1520ml溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌）或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（白色念珠菌、黑曲霉），混勻，凝固，倒置培養(yǎng)（胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過3天；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間不超過5天）。觀察菌落生長情況，點(diǎn)計平板上生長的所

12、有菌落數(shù)，菌落蔓延生長成片的平皿不宜計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿，以算術(shù)均值作為計數(shù)結(jié)果。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)，計算各試驗組的平均菌落數(shù)。5.4.6 結(jié)果判斷試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。若各試驗菌的回收試驗均符合要求，則方法驗證通過，可照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)；若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達(dá)不到要求，那么可采用增加稀釋液、培養(yǎng)基體積或加入適宜的中和劑、滅活劑來消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行計數(shù)方法適用性驗證，根據(jù)結(jié)果選擇回收最接近要求的方法和

13、試驗條件進(jìn)行供試品的檢查。5.5 控制菌檢查方法驗證5.5.1 大腸埃希菌檢查方法5.5.1.1 供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品10ml，加入溫度不超過45的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，稀釋制成110供試液。取10ml供試液，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。5.5.1.2 選擇和分離培養(yǎng)取上述預(yù)培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時。5.5.1.3 結(jié)果判斷若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗

14、，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。5.5.2 檢查方法驗證5.5.2.1 菌液制備取大腸埃希菌CMCC（B）44 102接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，于3035培養(yǎng)1824小時，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為50cfu的菌懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。5.5.2.2 適用性試驗按“大腸埃希菌檢查方法”項，取規(guī)定量供試液及1ml相應(yīng)的試驗菌液接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時間下

15、培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。5.5.2.3 陰性對照為確認(rèn)試驗條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。5.5.2.4 結(jié)果判斷上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。5.6 偏差處理應(yīng)嚴(yán)格按照本方案操作，如在試驗過程中微生物回收結(jié)果或控制菌檢查結(jié)果出現(xiàn)不符合要求的情況，應(yīng)上報質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人，在分析

16、問題原因后，決定是否需對本方案中設(shè)定的微生物限度檢查方法進(jìn)行修改，并重新進(jìn)行驗證。5.7 再驗證周期5.7.1 當(dāng)氯化鉀溶液的處方發(fā)生變動或其它因素變更導(dǎo)致氯化鉀溶液的物料性質(zhì)改變時，需要對本方案進(jìn)行調(diào)整后作方法學(xué)再驗證。5.7.2 國家相關(guān)微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)修改后需要對本方法重新進(jìn)行再驗證。6 參考文件中國藥典2015版草案（1105）非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和（1106）非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法氯化鉀溶液成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)氯化鉀溶液成品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程7 附錄附錄1 氯化鉀溶液微生物限度檢查方法驗證報告解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院附錄1題 目：氯化鉀溶液微生物限度檢查方法

17、驗證報告編 號：BG-VD-103版 本 號：01頁 次：1/4氯化鉀溶液微生物限度檢查方法驗證報告名 稱氯化鉀溶液開始日期結(jié)束日期驗證方案氯化鉀溶液微生物限度檢查方法驗證方案（FA-VD-103）偏差情況是 否（如選是，在結(jié)果分析中詳細(xì)說明其結(jié)果和補(bǔ)救措施）驗證結(jié)果分析及結(jié)論：本次驗證根據(jù)中國藥典2015版草案非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（1105）和非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（1106）中相關(guān)要求，擬定了氯化鉀溶液的微生物限度檢查方法，并使用其制劑成品（批號： ）進(jìn)行了檢查方法的驗證。微生物計數(shù)的回收比值分別為：金黃色葡萄球菌： ；銅綠假單胞菌 ；枯草芽孢桿菌： ；白

18、色念珠菌： ；黑曲霉： ；控制菌檢查的驗證結(jié)果為：大腸埃希菌：通過 未通過。驗證結(jié)果表明本次所建立的氯化鉀溶液的微生物限度檢查方法： 。質(zhì)量控制人： 日期： 年 月 日驗證報告和記錄的審核：質(zhì)量保證人： 日期： 年 月 日驗證報告的批準(zhǔn)：質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人： 日期： 年 月 日解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院題 目：氯化鉀溶液微生物限度檢查方法驗證報告編 號：BG-VD-103版 本 號：01頁 次：4/4微生物限度檢查方法驗證記錄名 稱批 號規(guī) 格來 源一、金黃色葡萄球菌計數(shù)方法驗證記錄試驗開始日期： 結(jié)束日期：培養(yǎng)溫度： 培養(yǎng)濕度：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（配制批號： ）培養(yǎng)箱編號：培養(yǎng)皿號試驗組供試品對照組菌液對照組陰性對照12平均菌落數(shù)結(jié)果計算試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)菌液對照組菌落數(shù)=結(jié)果判定驗證通過 驗證未通過二、銅綠假單胞菌計數(shù)方法驗證記錄試驗開始日期： 結(jié)束日期：培養(yǎng)溫度： 培養(yǎng)濕度：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（配制批號： ）培養(yǎng)箱編號：培養(yǎng)皿號試驗組供試品