生物技術(shù)制藥及名詞解釋分享

1、真誠為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請(qǐng)指正。生物技術(shù)制藥第一章 緒論藥學(xué)一級(jí)學(xué)科分類：藥物化學(xué)、藥劑學(xué)、藥理學(xué)、藥物分析、生藥學(xué)及微生物與生化藥學(xué)二級(jí)學(xué)科生物技術(shù)與生物技術(shù)藥物的概念生物技術(shù)藥物的分類ª 按用途分類：治療藥物、預(yù)防藥物、作為診斷藥物(免疫診斷試劑、酶診斷試劑、器官功能診斷藥物、放射性核素診斷藥物、診斷用單克隆抗體(McAb)、診斷用DNA芯片)ª 按作用類型分類：細(xì)胞因子類藥物、激素類藥物、酶與輔酶類藥物、疫苗、單克隆抗體藥物、反義核酸藥物、RNA干擾(RNAi)藥物、基因治療藥物ª 按生化特性分類：多肽類藥物、蛋白質(zhì)類藥物、核酸類藥物、聚乙二

2、醇(PEG)化多肽或蛋白質(zhì)藥物生物技術(shù)藥物的特性ª 理化性質(zhì)特性：相對(duì)分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差ª 藥理學(xué)作用特性：活性與作用機(jī)制明確、作用針對(duì)性強(qiáng)、毒性低、體內(nèi)半衰期短、有種屬特異性、可產(chǎn)生免疫原性ª 生產(chǎn)制備特性：藥物分子在原料中的含量低、原料液中長存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)、制備工藝條件溫和、分離純化困難、產(chǎn)品易受有害物質(zhì)污染ª 質(zhì)量控制特性：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的特殊性、制造項(xiàng)下的特殊規(guī)定、檢定項(xiàng)下的特殊規(guī)定(原液、半成品及成品檢定等等)第二章 基因工程制藥蛋白類藥物的特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)確證不完全性、具有種屬特異性、多功能性、免疫原性臨床前安全性評(píng)價(jià)的特殊性：蛋白

3、類藥物安全性擔(dān)憂的性質(zhì)和來源；受試物的純度；相關(guān)動(dòng)物的選擇；給藥劑量的選擇；免疫原性；遺傳毒性和致癌性(一般不進(jìn)行常規(guī)的遺傳毒性實(shí)驗(yàn))；藥代動(dòng)力學(xué)真核細(xì)胞表達(dá)制品的安全性問題：生產(chǎn)細(xì)胞DNA殘留的影響、生產(chǎn)用血清的影響基因工程藥物穩(wěn)定性研究的相關(guān)問題：藥物濃度、溫度、濕度和水分、氧、光照、pH基因工程藥物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；異體蛋白具有免疫原性基因工程菌的修飾改造方法：構(gòu)建突變體、構(gòu)建融合蛋白、PEG修飾(降低免疫原性、增加水溶性、延長t1/2)基因工程制藥基本環(huán)節(jié)s 上游階段：制備目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建工程細(xì)胞s 下游階段：培養(yǎng)工程細(xì)胞分離純化產(chǎn)物除菌半成品、成品檢定包裝基本工

4、具：目的基因、各種酶(切割酶、連接酶、修飾酶等)、載體、宿主細(xì)胞Ø 酶切結(jié)果：5粘性末端、3粘性末端、平頭末端Ø 1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：指在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量Ø 影響限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的因素：s DNA樣品的純度：s DNA的甲基化程度：核酸限制性內(nèi)切酶不能夠切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型細(xì)菌菌株制備質(zhì)粒DNA。s 酶切反應(yīng)的溫度s DNA的分子結(jié)構(gòu)s 反應(yīng)緩沖液組成s 反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體積等Ø 工具酶ª 核酸限制性內(nèi)切酶：識(shí)別、水解外源的雙鏈DNA分子上特定的核苷酸序列。主要存

5、在于原核微生物中。 同裂酶：指來源不同，識(shí)別序列相同的酶；進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生相同的末端 同尾酶：來源不同，識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端DNA甲基化酶：具有宿主專一性，對(duì)宿主自身DNA上特定核苷酸進(jìn)行甲基化修飾，避免被自身限制性內(nèi)切酶水解ª DNA連接酶 T4噬菌體連接酶：連接雙鏈DNA切口，或帶粘性末端或平頭末端的DNA片段 大腸桿菌DNA連接酶：連接雙鏈DNA切口，或帶粘性末端的DNA片，不能連接帶平頭末端的DNA片段ª 聚合酶：以DNA或RNA為模板，將核苷酸連續(xù)加至3-OH末端，合成方向?yàn)?3。DNA聚合酶、RNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶：53DNA聚合酶

6、活性；53DNA外切酶活性；35DNA外切酶活性；RNA H酶活性 Klenow酶：不具備53DNA外切酶活性 T4噬菌體DNA聚合酶：不具備53DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶強(qiáng)200倍，對(duì)單鏈DNA作用強(qiáng)于雙鏈DNA T7噬菌體DNA聚合酶：不具備53DNA外切酶活性 Taq DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶：催化以RNA或DNA為模板，合成DNA；具有RNA H酶的活性 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：催化dNTP沿53聚合，逐個(gè)加于線性DNA分子的3末端；不需要模板Ø 載體：(vector)來源于質(zhì)粒、噬菌體或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA，并具有運(yùn)載外源DNA導(dǎo)入

7、宿主細(xì)胞的能力。ª 質(zhì)粒載體：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)；開環(huán)DNA(ocDNA)；線狀DNA(lDNA) 質(zhì)粒的三個(gè)重要性質(zhì)：遺傳傳遞的能力；遺傳交換的能力；不相容性 用于克隆的質(zhì)粒的三個(gè)要素：復(fù)制子、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn) 常用質(zhì)粒載體：克隆載體、表達(dá)載體、突變載體、報(bào)告載體ª 噬菌體載體：插入型載體、置換載體 來源于噬菌體DNA，因可以插入較大DNA片段，常用于構(gòu)建基因組文庫和cDNA文庫。Ø 目的基因的常用制備方法ª 化學(xué)合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亞磷酸三酯法。 大片段目的基因：小片段粘

8、接法、大片段酶促法ª PCR法：前提：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。ª 基因文庫法：鳥槍法：適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離ª cDNA文庫法(與mRNA互補(bǔ)的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)；僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因；mRNA含量少且t1/2短，對(duì)酶和堿極為敏感，分離純化困難第一鏈：mRNA模板，引物 (polyT) ，逆轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs第二鏈：自身引導(dǎo)法：取得的雙鏈cDNA5端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失(NaOH，煮沸；Klenow酶，dNTPs；S1內(nèi)切酶)引導(dǎo)合成法：獲得的cDNA能保持完整的5

9、端序列(TdT, Dctp；NaOH；退火；Klenow酶，dNTPs)s 基因文庫的完備性：指在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N= ln(1P) /ln(1f)，P=完備性，f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小s 雙酶切產(chǎn)生的粘性末端，最常用，可以確保連接方向的正確性s 影響連接效率的因素：連接方式；目的基因與載體的濃度比例摩爾數(shù)比大于1；連接溫度、時(shí)間、酶的活性、反應(yīng)緩沖體系Ø 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞ª 導(dǎo)入大腸桿菌：CaCl2法；轉(zhuǎn)染法ª 導(dǎo)入酵母：電轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法ª

10、導(dǎo)入鏈霉菌：原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法ª 重組DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射法；DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法；DNA-磷酸鈣轉(zhuǎn)染法；陽性脂質(zhì)體介導(dǎo)法；電穿孔法；細(xì)胞融合法；病毒感染法Ø 重組子的篩選與鑒定ª 遺傳標(biāo)記篩選法：抗生素抗性篩選法；互補(bǔ)篩選法(藍(lán)白斑篩選載體含有LacZ基因，X-gal培養(yǎng)基，成功導(dǎo)入的菌落顯示為藍(lán)斑)；營養(yǎng)缺陷型篩選法；噬菌斑篩選法ª 核酸分子雜交法：菌落原位雜交法；DNA印跡法；RNA印跡法ª 限制性內(nèi)切酶圖譜法：瓊脂糖凝膠電泳鑒定各片段分子量，含有目的基因的為陽性克隆ª DNA序列測(cè)定法ª 目的基因表達(dá)

11、產(chǎn)物測(cè)定法原核細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn)及選擇ª 大腸桿菌(首選,遺傳背景研究清楚；適合大規(guī)模生產(chǎn)(成本低，周期短，效率高，操作簡(jiǎn)單)、芽孢桿菌、鏈霉菌等ª 缺點(diǎn)：缺乏翻譯后修飾系統(tǒng)；容易以包涵體形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系統(tǒng)水解 外源基因表達(dá)的調(diào)控原件：復(fù)制子、啟動(dòng)子(表達(dá)效率的關(guān)鍵因素)和終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(即SD序列及SD序列到起始密碼子AUG的距離)、識(shí)別翻譯后修飾信號(hào)ª 用于原核表達(dá)的載體必須具備的條件：具有復(fù)制子、靈活的克隆位點(diǎn)和方便的選擇標(biāo)記、很強(qiáng)的啟動(dòng)子、阻遏子(一般有)、強(qiáng)的終止子，所產(chǎn)生的mRNA應(yīng)具有翻譯起始信號(hào)(起始密碼子AUG以及SD序列)

12、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)方式ª 胞內(nèi)表達(dá)：非融合蛋白表達(dá)：蛋白質(zhì)接近天然狀態(tài)，易被降解，易形成包涵體。有原核多肽基因融合蛋白表達(dá)：表達(dá)效率高；產(chǎn)物穩(wěn)定；可以切除原核多肽，獲得天然外源蛋白ª 分泌表達(dá)：有信號(hào)肽基因，形成周質(zhì)表達(dá)或細(xì)胞外表達(dá) 外源蛋白表達(dá)效率的影響因素ª 外源基因密碼子：大腸桿菌具有偏好密碼子和稀有密碼子，外源基因應(yīng)盡量設(shè)計(jì)成為大腸桿菌的偏好密碼子ª mRNA的結(jié)構(gòu)：改變一級(jí)結(jié)構(gòu)；降低5端二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；調(diào)控3端非翻譯區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)ª 表達(dá)載體的選擇：表達(dá)方式；強(qiáng)的復(fù)制子(拷貝數(shù)高)；強(qiáng)的啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)錄效率高)；高效率的核糖體結(jié)合位點(diǎn)

13、；強(qiáng)的終止子(提高mRNA穩(wěn)定性)；適應(yīng)范圍廣；穩(wěn)定性高；產(chǎn)物易純化。ª 外源蛋白的穩(wěn)定性：采用融合蛋白形式表達(dá)；采用蛋白酶缺陷的突變菌株真核細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn)及選擇Ø 常用的真核表達(dá)系統(tǒng)：酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)的比較大腸桿菌巴斯德畢赤酵母載體原核載體穿梭載體調(diào)控序列原核原核和真核表達(dá)形式包涵體、融合蛋白、分泌分泌翻譯后修飾基本無有生產(chǎn)方式發(fā)酵，操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)發(fā)酵，操作較簡(jiǎn)單、較經(jīng)濟(jì) 酵母表達(dá)體系的影響因素ª 外源基因的結(jié)構(gòu)© 外源基因5端非翻譯區(qū)的序列和長度影響mRNA的翻譯效率© 起始密碼子兩

14、側(cè)若容易形成RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，將阻止翻譯進(jìn)行© 富含A-T序列導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止© 密碼子的偏好性© 高度復(fù)雜的胱氨酸結(jié)構(gòu)基序影響表達(dá)效率ª 表達(dá)形式及信號(hào)肽的選擇：無信號(hào)肽常胞內(nèi)表達(dá)；有信號(hào)肽，胞外分泌型表達(dá) ª 啟動(dòng)子：多數(shù)畢赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2啟動(dòng)子ª 轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)越高，表達(dá)水平也越高ª 誘導(dǎo)條件：甲醇誘導(dǎo)的濃度、時(shí)間以及溫度的選擇ª 外源蛋白的降解：采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或調(diào)節(jié)pH值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的穩(wěn)定性。Ø 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)ª 表達(dá)載體

15、：病毒載體(腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等)；質(zhì)粒載體ª 表達(dá)方式：瞬時(shí)表達(dá)、穩(wěn)定表達(dá)、誘導(dǎo)表達(dá)Ø 基因重組蛋白的主要分離技術(shù)：離心、沉淀(等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法)、膜分離、雙水相萃取Ø 基因重組蛋白的主要純化技術(shù)：離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析、反相色譜和疏水色譜Ø 選擇分離純化方法的依據(jù)ª 根據(jù)表達(dá)形式選擇s 分泌型：沉淀和超濾s 周質(zhì)表達(dá)：溶菌酶處理滲透壓休克s 胞內(nèi)可溶表達(dá)：親和層析或離子交換層析s 胞內(nèi)不溶表達(dá)(包涵體)：易與雜蛋白分開，但需要復(fù)性形成有活性的蛋白質(zhì)。ª 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇s 先采用低分辨、分離

16、規(guī)模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分離規(guī)模小、速度慢的方法。合理選擇色譜分離次序ª 根據(jù)分離純化工藝的要求選擇s 具有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和較高的安全性；盡量較少組成工藝步驟；所用時(shí)間盡可能短；工藝和技術(shù)必須高效 基因工程藥物的質(zhì)量控制與小分子藥物質(zhì)量控制相比，不同的方面ª Mr遠(yuǎn)大于小分子化學(xué)物質(zhì)，致使適用于小分子藥物的鑒別方法無法用于基因工程藥物。如質(zhì)譜ª 基因工程藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常需多種檢測(cè)方法ª 兩者雜質(zhì)性質(zhì)差別較大。小分子藥物雜質(zhì)主要來源于合成中原料殘留、合成副產(chǎn)物和純化中溶劑殘留；基因工程藥物多為宿主蛋白殘留和宿主基因殘留，其檢測(cè)一般都

17、用專用的試劑盒。ª 藥物定量方面，基因工程藥物一般采用生化反應(yīng)的方式 基因工程藥物的質(zhì)量控制1、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定ª 紫外吸收光譜：在280nm有最大吸收值?？焖伲瑹o破壞性。不是嚴(yán)格定量，核酸可引起強(qiáng)干擾作用。ª BCA法：堿性條件與Cu2絡(luò)合同時(shí)將Cu 2還原成Cu(雙縮脲反應(yīng))，再與二辛可寧酸形成紫色復(fù)合物，在562nm有最大吸收值。需短時(shí)間10min內(nèi)完成ª Lowry法：堿性條件蛋白質(zhì)與銅形成復(fù)合物可還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，產(chǎn)生深藍(lán)色。特點(diǎn)：靈敏，準(zhǔn)確度高；操作步驟多，繁瑣；影響因素多(鹽酸胍、尿素、EDTA等)ª 考馬斯亮藍(lán)法：靈敏，操作

18、簡(jiǎn)單，重復(fù)性好；抗干擾能力弱ª SDS-凝膠染色與掃描分析法2、蛋白質(zhì)純度的測(cè)定：電泳(SDS-PAGE)、質(zhì)譜法、色譜法、末端氨基酸分析法3、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定：SDS-PAGE、凝膠色譜、質(zhì)譜法4、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定5、蛋白質(zhì)序列分析ª N末端氨基酸序列分析：鑒定蛋白質(zhì)的種類；C末端分析：判斷表達(dá)、純化過程中有無加工6、蛋白質(zhì)二硫鍵分析7、蛋白質(zhì)活性的測(cè)定8、免疫測(cè)定法9、內(nèi)毒素分析、宿主蛋白和核酸殘留分析基因工程藥物的實(shí)例：干擾素(IFN)、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(CMCSF)、人白細(xì)胞介素-2(IL-2)、胰島素、人生長激素(hGH)第三章 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥動(dòng)

19、物細(xì)胞的體外培養(yǎng) 體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)：貼壁依賴性細(xì)胞，非貼壁依賴性細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞s 貼壁依賴性細(xì)胞：成纖維樣細(xì)胞型(主要來源于中胚層組織)；上皮樣細(xì)胞型(主要來源于外胚層和內(nèi)胚層組織)s 非貼壁依賴性細(xì)胞：又叫懸浮細(xì)胞，一般呈圓球形。主要來源于血液、淋巴組織、雜交瘤細(xì)胞s 兼性貼壁細(xì)胞：如CHO細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)1) 細(xì)胞的分裂周期長，一般為1248h(G1 S G2 M)2) 細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象3) 正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的4) 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感(如滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等的變化耐受力很弱)5) 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)

20、培養(yǎng)基的要求高(需要12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無機(jī)鹽和微量元素、作為主要碳源的葡萄糖，以及多種細(xì)胞生長因子和貼附因子，而且不同種類要求又有變化。)6) 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同培養(yǎng)條件要求高、成本貴，產(chǎn)量低；多半是分泌在胞外的，收集純化方便，得到了較完善的翻譯后修飾 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件(一)環(huán)境條件： 直接接觸的器材、防止污染(顯著地污染標(biāo)志：pH值迅速改變，細(xì)胞外形模糊，甚至出現(xiàn)細(xì)胞集落)、水質(zhì)、pH(大多是7.2-7.4)、滲透壓、溫度、通氧量、基本營養(yǎng)物質(zhì)(二)營養(yǎng)要求：水、碳源、氮源、維生素、激素、無機(jī)鹽等s 碳源不能為無機(jī)物，大多只能利用葡萄糖s

21、氮源不能為無機(jī)物，主要利用各種氨基酸s 在多數(shù)情況下，需要添加520的小牛血清，或適量動(dòng)物胚胎浸出液。培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基s 天然培養(yǎng)基：主要見于早期階段，來源：血漿凝塊、淋巴液、血清(最常用有效)、羊水、腹水等。分維持液(低或不含牛血清)和生長液(5%-20%牛血清)s 合成培養(yǎng)基：主要成分：糖、氨基酸、核苷酸前體、維生素、激素、緩沖體系、無機(jī)鹽等s 無血清培養(yǎng)基提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批之間差異的影響；減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；供應(yīng)充足、穩(wěn)定；細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性；減少了血清中蛋白對(duì)某些

22、生物測(cè)定的干擾，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析血清的作用：提供各種生長因子和激素，貼附因子和伸展因子，可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白，必須的脂肪酸和微量元素 其他常用溶液：平衡鹽溶液；培養(yǎng)基pH調(diào)整液；細(xì)胞消化液(胰蛋白酶，EDTA)；抗生素溶液動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法：原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、克隆培養(yǎng)s 細(xì)胞的原代培養(yǎng)：組織塊培養(yǎng)法、單層細(xì)胞培養(yǎng)法。取動(dòng)物組織塊剪碎分散處理(加胰蛋白酶或膠原蛋白和EDTA)洗滌純化計(jì)數(shù)稀釋培養(yǎng)s 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：離心或酶消化法收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，以適當(dāng)濃度接種到新的培養(yǎng)環(huán)境中s 單克隆培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)：細(xì)胞分離(離心法；蛋白酶消化法

23、)；細(xì)胞計(jì)數(shù)；細(xì)胞傳代；細(xì)胞的凍存(慢凍，液氮,196度) 和復(fù)蘇(快融，投入37水浴融化)s 凍存主要步驟：活性好的細(xì)胞，加保護(hù)劑(DMSO等)混合；做好標(biāo)記(細(xì)胞種類、日期等)；逐漸降低溫度，最后放至液氮中；降溫梯度要合適，總的原則是慢凍生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞© 原代細(xì)胞：費(fèi)錢費(fèi)力，少用© 傳代細(xì)胞系：安全，特點(diǎn)： 2n核型，貼壁依賴，接觸抑制，有限傳代(50代)© 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：自發(fā)轉(zhuǎn)化或人為轉(zhuǎn)化，失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，可=無限增殖傳代，適宜大規(guī)模工業(yè)培養(yǎng)© 工程細(xì)胞系：融合細(xì)胞系(仙臺(tái)病毒融合法、聚乙二醇融合法、電融合法)；基因工程細(xì)胞系s 病毒載體：牛痘

24、病毒。腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，桿狀病毒載體-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)s 基因工程細(xì)胞主要的篩選系統(tǒng)，HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)選擇系統(tǒng)，篩選tk+、hgprt+的轉(zhuǎn)化細(xì)胞GPT(HAT、黃嘌呤、甘氨酸、霉酚酸)選擇系統(tǒng)，篩選gpt+的轉(zhuǎn)化細(xì)胞 G418(Geneticin)選擇系統(tǒng)，篩選Neor的轉(zhuǎn)化細(xì)胞MTX選擇系統(tǒng)，篩選dhfr+的轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞庫的建立：原始細(xì)胞庫(MCR)生產(chǎn)用細(xì)胞庫(MWCR，又稱工作細(xì)胞庫，主細(xì)胞庫生產(chǎn)細(xì)胞庫)常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞：BHK-21，C127細(xì)胞，CHO-K1，COS細(xì)胞，MDCK細(xì)胞，WI-38，MRC-5，Namalwa，Sf-9，Vero，SP2/0-

25、Ag14動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法 懸浮培養(yǎng)：適用于非貼壁依賴細(xì)胞或兼性貼壁細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件均一，傳質(zhì)傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)，可以借鑒細(xì)菌培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。缺點(diǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)密度較低。 微載體培養(yǎng)：用于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。理想的微載體應(yīng)具備：生物相容性、無毒性、表面惰性、比重適當(dāng)(1.030 1.045g/ml)、粒徑均一，在60250mm之間(溶脹后)、光學(xué)透明、柔軟、耐高壓滅菌溫度、反復(fù)多次使用、制備簡(jiǎn)單、原料充分 多孔載體培養(yǎng)：可用于懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞。細(xì)胞在網(wǎng)格內(nèi)，能避免受到剪切力的損傷，因此培養(yǎng)體系可以提高攪拌速度和通氣量。多孔載體的一般條件

26、：具備生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性 微囊化培養(yǎng)：避免剪切力對(duì)細(xì)胞造成的損傷；獲得較高細(xì)胞密度107108個(gè)/ml；利于純化；可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng) 中空纖維培養(yǎng)：把細(xì)胞接種在中空纖維的外腔，利用中空纖維模擬毛細(xì)血管提供營養(yǎng)。理想的動(dòng)物生物反應(yīng)器必須具備的基本要求： 體系中的各種材料，對(duì)細(xì)胞必須無毒性。 生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)的傳質(zhì)、傳熱和混合性能好。 密封性能良好，可避免一切外來微生物的污染。 培養(yǎng)環(huán)境多種物化參數(shù)可自動(dòng)檢測(cè)和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一。 可長期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，尤其對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞而言。 容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無死角。 拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒便

27、于操作消毒。 設(shè)備成本盡可能低。 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器ª 規(guī)模：實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：<20L；中試規(guī)模：20100L；生產(chǎn)規(guī)模：>100Lª 類型：攪拌罐式；氣升式；中空纖維式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性搖袋式細(xì)胞培養(yǎng)ª 主要操作方式：s 分批式操作：能夠控制的參數(shù)只有PH、溫度和通氣量s 補(bǔ)料-分批(或流加式)操作：不斷地向系統(tǒng)中補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分s 半連續(xù)式操作s 連續(xù)式操作和灌流式操作：后者取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 基本原理及步驟：外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)

28、胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系轉(zhuǎn)基因動(dòng)物XXX方法ª 經(jīng)典的技術(shù)路線 ：基因顯微注射法，最常用、成功的方法，成功率低ª 整合胚胎移植的技術(shù)路線：受精卵的成活率高達(dá)90以上，外源基因整合率高，提高受孕率ª 核移植(克隆)的技術(shù)路線：體細(xì)胞核移植；核移植前導(dǎo)入目的基因。ª 整合卵受精的技術(shù)路線：卵母細(xì)胞導(dǎo)入目的基因后再與精子受精。ª 具體方法：基因顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞方法，精子載體導(dǎo)入法、基因打靶法、人工酵母染色體法 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研

29、究出現(xiàn)的問題：XXX轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率低；外源基因在宿主基因組中的行為難以控制；轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器：(bioreactor)目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。如乳腺、膀胱、血液等動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品制造實(shí)例：類淋巴細(xì)胞干擾素、組織型纖溶酶原激活劑、單鏈尿性纖溶酶原激活劑-尿激酶原、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗第四章 抗體工程制藥概述 抗體工程應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：研究，以免疫轉(zhuǎn)印法檢測(cè)特定抗原；醫(yī)療，以毒素連結(jié)抗體攻擊 病變細(xì)胞；檢驗(yàn)，以 ELISA偵測(cè)特定病原體；多克隆抗體(polyclonal antibody，pAb)簡(jiǎn)稱多抗。如:免疫血清(含多種特異性抗體

30、)實(shí)際意義：預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清(抗破傷風(fēng))；胎盤球蛋白(抗病毒感染)。副作用：à超敏反應(yīng)。 臨床診斷，如：肥達(dá)氏反應(yīng)(傷寒、副傷寒)。缺點(diǎn)：特異性差單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb )簡(jiǎn)稱單抗 優(yōu)勢(shì)：特異性高：只識(shí)別某一個(gè)特定的抗原決定簇。 均一性好：其H鏈、L鏈及V區(qū)獨(dú)特性其完全一致，所得到的抗體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性狀完全一致。雜交瘤細(xì)胞：既能產(chǎn)生單一抗體，又能無限增殖抗體分子的結(jié)構(gòu)和功能 Ø 基本結(jié)構(gòu): 四肽鏈結(jié)構(gòu)Ø 重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)天然Ig分子中，重鏈同類，輕鏈同型。重鏈可分為五類：、鏈IgM、IgG、

31、IgA、IgD、IgE；輕鏈可分為、型。Ø 可變區(qū)(V區(qū))、恒定區(qū)(C區(qū))和鉸鏈區(qū)(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)s VL 、VH區(qū)各有3個(gè)超變區(qū)(也稱互補(bǔ)決定區(qū)，CDR1-3)，共同組成Ig的抗原識(shí)別部位，形成與抗原決定簇互補(bǔ)的表位?？勺儏^(qū)中的其它部分變化較小，稱為骨架區(qū)(FR)s C區(qū)決定Ig分子的異種抗原性，主要發(fā)揮抗體分子的效應(yīng)功能。Ø 抗體分子的價(jià)位：指抗體分子能結(jié)合的抗原表位數(shù)的多少。VH和VL的CDR區(qū)共同構(gòu)成抗原的結(jié)合位點(diǎn)，因此一個(gè)單體免疫球蛋白分子有兩個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)，故習(xí)慣將單體抗體分子稱為2價(jià)分子。單克隆抗體的制備 產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)

32、胞的特性、細(xì)胞融合技術(shù)、雜交瘤細(xì)胞的篩選單克隆抗體制備的基本過程(理解)：抗體與動(dòng)物免疫，提取能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞在滅活的仙臺(tái)病毒/聚乙二醇的誘導(dǎo)下融合，并在特定的選擇培養(yǎng)基下篩選出雜交瘤細(xì)胞。在體外條件下做大規(guī)模培養(yǎng)/注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。再提取出大量的單克隆抗體,最后進(jìn)行純化。Ø 抗原和免疫：抗原的制備(通常和佐劑混合，增強(qiáng)免疫應(yīng)答)、免疫動(dòng)物(體內(nèi)/體外免疫方法；動(dòng)物的選擇：一般采用與骨髓瘤供體細(xì)胞同一品系的動(dòng)物)Ø 細(xì)胞的融合和雜交瘤細(xì)胞的篩選© 細(xì)胞的融合：制備脾細(xì)胞懸液：最后一次免疫后三天，1×108個(gè)； 制

33、備骨髓瘤細(xì)胞懸液：對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，(23)×107個(gè)； 融合：4050PEG(MW4000)，37，5min© HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞HAT培養(yǎng)基篩選原理：H(次黃嘌呤)；A(氨基蝶呤)；T(胸腺嘧啶)。骨髓瘤細(xì)胞不具備HGPRT和 TK，B淋巴細(xì)胞壽命短。 影響細(xì)胞DNA的合成：H促進(jìn)了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)途徑； T促進(jìn)了胸腺嘧啶激酶(TK)途徑；內(nèi)源性途徑(谷氨酰胺、鳥核苷酸單磷酸，二氫葉酸還原酶途徑)被A(葉酸的拮抗物)阻斷步驟：融合后細(xì)胞HAT培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基© 雜交瘤細(xì)胞的檢測(cè)和克隆抗體的檢測(cè)：僅少數(shù)雜交瘤細(xì)胞可以分泌

34、預(yù)期抗體。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、間接免疫熒光法、放射免疫測(cè)定法、流式細(xì)胞儀法雜交瘤細(xì)胞的克隆：有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法。經(jīng)過34輪克隆化，才能達(dá)到100孔內(nèi)均為陽性細(xì)胞克隆。耗時(shí)長(34月)© 雜交瘤細(xì)胞的凍存：凍存原始細(xì)胞Ø 單克隆抗體的大量制備：體內(nèi)接種法(皮下接種、腹腔接種)；體外培養(yǎng)法Ø 單克隆抗體的鑒定和檢測(cè)© 單克隆抗體的檢測(cè)s McAb特異性檢測(cè)：檢測(cè)有無抗原抗體結(jié)合；檢測(cè)有無交叉反應(yīng)。ELISA、間接免疫熒光法s McAb類和亞類的鑒定：類的鑒定一般在雜交瘤的克隆化過程中可以確定(兔抗鼠IgG或IgM作為二抗用于ELISA)亞類的

35、確定需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)做雙擴(kuò)散電泳或夾心ELISA。s 其他鑒定：中和活性鑒定；識(shí)別抗原表位鑒定；親和力鑒定；效價(jià)(滴度鑒定)；純度鑒定© 雜交瘤細(xì)胞的鑒定：主要是對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析抗體治療疾病的機(jī)制：中和作用、導(dǎo)向作用、拮抗作用、ADCC、CD、Aonist抗體在疾病治療中的應(yīng)用s 作為診斷試劑：病原微生物抗原抗體的檢測(cè)、腫瘤抗原的檢測(cè)、免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)、激素測(cè)定、細(xì)胞因子的測(cè)定 s 作為治療藥物：抗腫瘤、抗感染、抗器官移植排斥反應(yīng)、治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病制約抗體藥物迅速發(fā)展的主要障礙：免疫原性；分子量大基因工程抗體 Ø 單克隆抗體的人源化

36、© 嵌合抗體：人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。 特點(diǎn)：具備親本鼠源單抗相同的特異性和親和力；對(duì)人的免疫原性大大減少；可以接上不同亞類的人C區(qū)基因，改變抗體功能；半衰期長；工程細(xì)胞系比人人雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定；由于鼠VL和VH區(qū)的存在，仍有較強(qiáng)免疫原性© 改形(型)抗體：把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改形抗體，也就是人源化抗體。，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，Ø 小分子抗體© 包括Fab、Fv、單鏈抗體及單域抗體等s Fab片段：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與完整的輕鏈以

37、二硫鍵連接而成。1/3s Fv片段：由VH與VL非共價(jià)結(jié)合而成。在VH與VL的適當(dāng)區(qū)域個(gè)引入一個(gè)半胱氨酸，形成鏈內(nèi)二硫鍵，成為二硫鍵穩(wěn)定的Fv(disulfide-stablized Fv，dsFv)1/6s 單鏈抗體(ScFv)：在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，即單鏈抗體。常用的連接肽是(GGGGS)3s 單域抗體：即為VH或VL，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。 © 優(yōu)點(diǎn)：可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低；分子小，穿透力強(qiáng)；不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng)；在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清

38、除，利于解毒排出；易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。Ø 多功能化抗體© 雙功能抗體(bsAb)：又稱雙特異性抗體，兩個(gè)針對(duì)不同抗原決定簇的ScFv以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接在一起。© 融合抗體：Fc抗體融合蛋白；Fv抗體融合蛋白© 細(xì)胞內(nèi)抗體：指在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體，也稱內(nèi)抗體。在scFv的 C端/N端插入其他靶向信號(hào)© 最小識(shí)別單位：約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性噬菌體抗體工程 噬菌體抗體庫技術(shù)的三個(gè)關(guān)鍵：RT-PCR技術(shù)；噬菌體展示技術(shù)；抗體原核表達(dá)技術(shù)

39、。 噬菌體抗菌庫技術(shù)的篩選：。固相或液相純化抗原的篩選、全細(xì)胞篩選、用切片組織進(jìn)行篩選第五章 疫苗及其制備技術(shù)1.活疫苗(live vaccine)選用無毒或弱毒但免疫原性高的菌種，經(jīng)培養(yǎng)、繁殖后制成的。活疫苗株進(jìn)入機(jī)體后，能繼續(xù)生長繁殖，對(duì)機(jī)體呈長時(shí)間刺激，持續(xù)產(chǎn)生抗體。這類菌(疫)苗有卡介菌(預(yù)防結(jié)核病的菌苗)、炭疽菌苗、牛痘疫苗、狂犬病疫苗、鼠疫菌苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗以及麻疹苗等。2.死疫苗(killed vaccine)包括滅活疫苗(由完整的病毒或細(xì)菌經(jīng)滅活劑滅活后制成，即要使病原體充分死亡，喪失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性)和 亞單位疫苗(將病原體經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，除去

40、無效物質(zhì)，提取其有效抗原部分制備的一類疫苗)活疫苗特點(diǎn)死疫苗特點(diǎn)s 可在體內(nèi)繁殖s 系統(tǒng)免疫反應(yīng)和局部免疫反應(yīng)s 免疫力持久，產(chǎn)量高，成本低s 有毒力增強(qiáng)和反祖危險(xiǎn)s 抗原干擾現(xiàn)象s 保存條件苛刻s 不能在體內(nèi)繁殖，性質(zhì)穩(wěn)定，安全性高s 有利于制備多價(jià)或多聯(lián)疫苗s 比較安全，不發(fā)生全身性副反應(yīng)，無毒力反祖現(xiàn)象s 受外界影響小，有利于保存運(yùn)輸s 免疫劑量大，需多次免疫，成本高s 只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫s 通常需要用佐劑或攜帶系統(tǒng)來增強(qiáng)其免疫效果活疫苗死疫苗DNA疫苗s 可在宿主細(xì)胞中復(fù)制s 毒力降低s 免疫反應(yīng)比較全面s 免疫劑量小s 免疫保護(hù)期長s 不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制s 無毒，不返強(qiáng)s 免

41、疫反應(yīng)不太全面s 不會(huì)傳染給其它個(gè)體s 制備技術(shù)相對(duì)容易s 可刺接抗原在細(xì)胞內(nèi)合成s 可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫s 制備技術(shù)容易標(biāo)準(zhǔn)化重組亞單位疫苗s 將病原的主要保護(hù)性抗原蛋白基因在體外進(jìn)行大量表達(dá)，純化其表達(dá)產(chǎn)物輔以佐劑制成疫苗-亞單位疫苗s 良好的安全性和穩(wěn)定性。利用非疫苗用蛋白作為抗原建立的診斷方法將可以區(qū)分亞單位疫苗免疫的動(dòng)物和自然感染的動(dòng)物s 適用于發(fā)病快，病程急，中和抗體能有效控制發(fā)病的傳染病。s 不適于病程發(fā)展緩慢，潛伏期長，感染巨噬細(xì)胞且有ADE效應(yīng)的疾病?；钶d體疫苗s 利用低致病力的痘病毒、皰疹病毒、腺病毒或細(xì)菌作為載體，將其它病原的主要保護(hù)性抗原基因插入到載體基因組的非必需區(qū)形成新的

42、重組體，在同源或兼容性好的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下隨載體的復(fù)制表達(dá)插入的外源基因。病毒活載體疫苗的缺點(diǎn)：使用同一載體的不同疫苗不能同時(shí)使用疫苗制造流程制造優(yōu)良疫苗的關(guān)鍵：優(yōu)良的菌種；適宜的培養(yǎng)方法；良好生產(chǎn)工藝；嚴(yán)格的檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)。生產(chǎn)工藝流程：菌(毒)種培養(yǎng)物(培養(yǎng)基、動(dòng) 物、禽胚或細(xì)胞等)收獲抗原(培養(yǎng)液、含毒組織、胚液或細(xì)胞液等)配苗分裝凍干成活疫苗或滅活后制成滅活疫苗。毒種的選擇與減毒 毒株須具備的條件：1) 持有特定的抗原性；2) 有典型的形態(tài)和感染特定組織的特性，并能保持其生物學(xué)特性；3) 易在特定組織中大量繁殖；4) 不產(chǎn)生神經(jīng)毒素或能引起機(jī)體損害的其它毒素；5) 如制備活疫苗，繁殖過程中無恢

43、復(fù)原致病性的現(xiàn)象；6) 未被其它病毒污染。強(qiáng)毒種的選育：毒力強(qiáng)，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種，最后凍干保藏。這就是強(qiáng)毒菌種的標(biāo)準(zhǔn)弱毒種的選育：初選的依據(jù)：生物性狀改變細(xì)菌滅活疫苗制造：種子培養(yǎng)滅活和無菌檢查濃縮提高含菌量配佐劑分裝動(dòng)物安全試驗(yàn)細(xì)菌弱毒疫苗制造：菌種培養(yǎng)濃縮配苗和凍干動(dòng)物安全試驗(yàn)病毒性動(dòng)物組織苗(自家組織滅活苗；病毒弱毒疫苗)、病毒禽胚疫苗、病毒細(xì)胞疫苗、寄生蟲疫苗的制備 疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量檢定：外觀檢查、pH值檢測(cè)、純度、宿主細(xì)胞 DNA和蛋白殘留量、無菌檢查、熱原、抗生素檢測(cè)、滅活效果的驗(yàn)證、異常毒性檢查、穩(wěn)定性試驗(yàn)、效力試驗(yàn)(生物效價(jià))、佐劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)、疫苗標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的研究甲型

44、肝炎減毒活疫苗：生產(chǎn)用細(xì)胞(人二倍體細(xì)胞)、細(xì)胞庫管理及檢定、細(xì)胞制備、細(xì)胞培養(yǎng)液、毒種名稱及來源、種子批的建立、對(duì)照細(xì)胞外源因子檢查、病毒接種和培養(yǎng)、病毒提取(檢定合格的病毒收獲物經(jīng)凍融和(或)超聲波處理，并采用適宜濃度的三氯甲烷抽提以提純病毒)、原液(同一細(xì)胞批生產(chǎn)的病毒收獲物經(jīng)提取病毒后合并為一批原液)流行性乙型腦炎疫苗：收液作毒力滴定與無菌實(shí)驗(yàn)，加入福爾馬林，22恒溫滅活8d滅活劑、保護(hù)劑和免疫佐劑 滅活劑種類1. 甲醛溶液：最常用。蛋白質(zhì) 核酸烷基化(不加中斷劑)作用于氨基、羧基、羥基、巰基2. 烷化劑：乙?；蚁﹣啺?AEI)；二乙烯亞胺(BEI)；縮水甘油醛。(使微生物核酸烷基化

45、,滅活后加2%硫代硫酸鈉中斷滅活)。 烷化DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤等，妨礙RNA的合成。 使病毒完全喪失感染力，而保留其保護(hù)性抗原。3. 苯酚(石炭酸)：用于防腐， 很少用于疫苗研制4. 結(jié)晶紫：蛋白質(zhì)變性(溶于有機(jī)溶劑)；用于診斷抗原的制備：雞白痢抗原5. -丙酰內(nèi)酯：病毒滅活劑，主要用于狂犬病滅活苗制備！注意：滅活劑對(duì)人有害， 有時(shí)對(duì)皮膚粘膜有強(qiáng)烈刺 激性如：甲醛、-丙酰內(nèi)酯影響滅活作用的因素：滅活劑特異性；微生物種類和特性；滅活劑濃度；滅活溫度；滅活時(shí)間；滅活PH值；有機(jī)物存在保護(hù)劑的用途 菌種或毒種保存：常用甘油作保護(hù)劑 細(xì)胞株保存：常用二甲基亞砜(DMSO，一種細(xì)胞的保護(hù)劑) 疫

46、苗冷凍真空干燥制備時(shí)：加脫脂乳(或二甲基亞砜)和蔗糖等(不同國家有不同配方) 干擾素類生物活性物質(zhì)的保存：加葡聚糖保護(hù)劑分類：機(jī)理滲透劑(DMSO、甘油和蔗糖)非滲透劑(聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白質(zhì))； 分子量大小高分子物質(zhì)、低分子物質(zhì)； 化學(xué)性質(zhì)復(fù)合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物疫苗凍干保護(hù)劑組成：營養(yǎng)液；賦形劑；抗氧化劑常用的凍干保護(hù)劑(穩(wěn)定劑)Ø 細(xì)菌的保護(hù)劑 需氧或兼氧厭氧菌：蔗糖脫脂乳或蔗糖、1.5明膠； 厭氧性細(xì)菌：含1.5谷氨酸鈉的乳糖或10脫脂乳或7.5葡糖血清。注：脫脂乳：20脫脂奶粉溶于水配制而成。Ø 病毒的保護(hù)劑 5%蔗糖脫脂乳；馬立克814活

47、細(xì)胞疫苗：保存液氮.穩(wěn)定劑為10%二甲基亞砜和50%犢牛血清的199液。注: 微生物保護(hù)劑緩沖液的組成比例，不同廠家有不同的配方。常用的保護(hù)劑：5%蔗糖(乳糖)脫脂乳保護(hù)劑 ；明膠蔗糖保護(hù)劑；SPGA保護(hù)劑 免疫佐劑：s 氫氧化鋁膠 (鋁膠) 油乳佐劑 乳化劑 白油佐劑 蜂膠佐劑 脂質(zhì)體佐劑s 細(xì)胞因子類免疫佐劑(IL-2、IL-4、IL-12、IFN-)s CpG DNA(指含有非甲基化CpG(胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸)基序的脫氧核糖核酸DNA)s CpG OND(含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸)s 基因工程減毒素(霍亂毒素，CT；大腸桿菌不耐熱毒素，LT；破傷風(fēng)類毒素，TT)s 免疫刺

48、激復(fù)合物(ISCOM，抗原：糖苷Quil A：膽固醇=1:1:1)作用機(jī)理：抗原遞呈；抗原尋的；免疫調(diào)節(jié)s CpGDNA對(duì)多種免疫細(xì)胞有激活作用：引起B(yǎng)細(xì)胞分化，直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，在IL-12協(xié)同下激活NK細(xì)胞，協(xié)同刺激抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞分化s CpGODN的體內(nèi)效應(yīng)與應(yīng)用：對(duì)天然免疫系統(tǒng)的刺激活性(抗感染、抗腫瘤活性)；對(duì)特異性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用疫苗佐劑(對(duì)蛋白質(zhì)抗原的作用；對(duì)DNA疫苗的作用)；過敏性疾病治療第六章 酶工程制藥概述 酶是一類具有催化活性的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸一般催化劑的特征：1.只能進(jìn)行熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)；2.可以縮短化學(xué)反應(yīng)到達(dá)平衡的

49、時(shí)間，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)；3.通過降低活化能加快化學(xué)反應(yīng)速度。 酶的特點(diǎn)：高效性、專一性、反應(yīng)條件溫和、可調(diào)節(jié)性。酶的分類：六大類，氧化還原酶類(脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶、羥化酶以及加氧酶類)、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類(淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶)、裂解酶類(醛縮酶、水化酶及脫氨酶)、異構(gòu)酶類(消旋酶、順反異構(gòu)酶)和合成酶類(又稱為連接酶)酶的來源和生產(chǎn)：直接從動(dòng)植物獲得，即從生物體中分離和提純；化學(xué)合成方法；工業(yè)微生物發(fā)酵發(fā)酵法產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全。微生物繁殖快，生產(chǎn)周期短，酶的產(chǎn)量高，成本低。微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變以及基因工程等

50、方法培育出新的高產(chǎn)酶的菌株。研究?jī)?nèi)容：酶的大量生產(chǎn)和分離純化；新穎酶的發(fā)現(xiàn)、研究和應(yīng)用；酶的固定化技術(shù)和固定化酶反應(yīng)器；基因工程技術(shù)應(yīng)用于酶制劑的生產(chǎn)；酶分子改造與化學(xué)修飾；有機(jī)介質(zhì)中酶的反應(yīng)；酶抑制劑、激活劑的開發(fā)及應(yīng)用研究；抗體酶、核酸酶的研究；模擬酶、合成酶的研究；酶的定向進(jìn)化研究酶的分離純化 分離純化遵循蛋白質(zhì)分離純化的一般原則，但又有特殊性：s 低溫：一般14s 條件溫和：避免極端條件(劇烈攪拌、pH、鹽濃度等)s 加入保護(hù)劑：EDTA、2-巰基乙醇等s 對(duì)純化過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)：不斷檢測(cè)酶活力和蛋白濃度 酶分離純化的步驟：預(yù)處理初步純化高度純化濃縮與干燥Ø 酶的提取s 來源選擇

51、：含目的多的原料。同時(shí)考慮原料的來源、取材方便經(jīng)濟(jì)等方面因素s 細(xì)胞破碎：機(jī)械法、物理法、化學(xué)法(有機(jī)溶劑、表面活性劑)、生物法(酶解)s 保護(hù)措施：采用緩沖系統(tǒng)；添加保護(hù)劑；抑制水解酶的作用；其他：注意溫度、攪拌、紫外光等的影響Ø 酶的抽提：s 目標(biāo)：將目的酶最大限度地溶解出來；保持生物活性。s 原則：相似相溶；使用遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。s 方法：鹽溶液提取(常用NaCl溶液)；酸、堿溶液提??；有機(jī)溶劑提取Ø 沉淀分離：等電點(diǎn)沉淀；鹽析；有機(jī)溶劑沉淀Ø 酶的純化s 根據(jù)分子量大小分離：離心、膜分離、凝膠層析等s 根據(jù)電荷性質(zhì)進(jìn)行分離：離子交換、電泳等s

52、 根據(jù)疏水作用進(jìn)行分離：疏水層析、反相色譜等s 根據(jù)親和作用分離：親和層析酶和細(xì)胞的固定化 游離酶的缺點(diǎn)：酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差(熱、酸堿、有機(jī)溶劑對(duì)其有影響)。酶不能回收，無法重復(fù)使用。產(chǎn)物中混雜酶蛋白，分離純化困難。 固定化酶：s 優(yōu)點(diǎn)：(1)可提高酶的穩(wěn)定性。(2)酶能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使用。s 缺點(diǎn)：(1)存在擴(kuò)散限制。適于催化小分子物質(zhì)。(2)酶活性下降。固定化細(xì)胞：s 優(yōu)越性：(1)降低成本，省去酶的分離純化工作：(2)既可作為單一酶，也可作為復(fù)合酶系完成部分代謝過程。s 局限性：(1)細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物。(2)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限XXX用

53、。固定化酶(細(xì)胞)的制備 傳統(tǒng)的酶固定化方法：載體結(jié)合法(物理吸附法、離子結(jié)合法、共價(jià)結(jié)合法)交聯(lián)法(常用戊二醛試劑)、包埋法(網(wǎng)格型、微囊型)固定化方法吸附法包埋法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法制備難易易易較難難較難結(jié)合程度弱中等強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收高，酶易流失高高低中等費(fèi)用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變酶固定化的新方法：光偶聯(lián)法；等離子體法；偶合固定化法；無載體固定化酶的新技術(shù) 固定化酶(細(xì)胞)的性質(zhì)和指標(biāo)Ø 固定化酶活力的改變：通常低于天然酶(有例外)原因：酶的構(gòu)象發(fā)生變化，影響活性中心的氨基酸；空間障礙：形成立體屏蔽；內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻；包埋

54、時(shí)，大分子底物不能透過膜Ø 固定化酶的穩(wěn)定性：酶的耐熱性提高，對(duì)變性劑、抑制劑、pH值、蛋白酶以及操作條件的抵抗力增加?？赡艿脑颍汗潭ɑ黾恿嗣富钚詷?gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形。抑制酶的自身降解。固定化部分阻擋了外界不利因素對(duì)酶的侵襲。Ø 固定化酶的最適溫度變化：最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)。多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升(有例外)Ø 固定化酶的最適pH 變化：帶負(fù)電荷載體：最適pH 向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH 向酸性偏移。Ø 固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km的變化：固定化酶的表觀Km隨載體的帶電性能變化。Ø 固定化載體與酶的

55、底物電荷相反時(shí)，固定化酶的表觀Km值降低；相同時(shí)，表觀Km值顯著增加。Ø 固定化酶的作用專一性改變：與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導(dǎo)致酶的專一性發(fā)生改變Ø 固定化細(xì)胞的性質(zhì)：有活性升高的現(xiàn)象；穩(wěn)定性的增加；最適溫度和最適pH常保持不變Ø 固定化酶(細(xì)胞)的評(píng)價(jià)指標(biāo)：活力、偶聯(lián)率及相對(duì)活力、半衰期、熱穩(wěn)定性s 活力回收=(加入酶蛋白活力一上清液酶蛋白活力)/加入酶蛋白活力×100%s 偶聯(lián)率=固定化酶總活力/(加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)×100%偶聯(lián)率1，表明固定化對(duì)酶活性影響不明顯；偶聯(lián)率1，表明固定化對(duì)降低酶活性；

56、偶聯(lián)率1，可能有細(xì)胞分裂，或從載體中排除影響酶活性的抑制劑酶?jìng)鞲衅鳎褐饕晒潭ɑ改ず妥儞Q器組成s 生物傳感器：酶?jìng)鞲衅?酶電極，熱敏電阻酶?jìng)鞲衅?，離子敏場(chǎng)效應(yīng)晶體管酶?jìng)鞲衅鳎饫w酶?jìng)鞲衅?、組織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器s 酶?jìng)鞲衅鞯膽?yīng)用：水質(zhì)監(jiān)測(cè)；葡萄糖傳感器和血糖測(cè)定儀；肉鮮度傳感器酶反應(yīng)器 ：s 按結(jié)構(gòu)區(qū)分：攪拌罐式反應(yīng)器(STR)；鼓泡式反應(yīng)器(BCR )；填充床式反應(yīng)器(PCR )；流化床式反應(yīng)器(FBR)；膜反應(yīng)器(MR) s 按操作方式區(qū)分：分批式反應(yīng)；連續(xù)式反應(yīng)；流加分批式反應(yīng)s 混合形式：連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器(CSTR)分批攪拌罐反應(yīng)器(BSTR) Ø 間歇式酶

57、反應(yīng)器s 又稱為批量反應(yīng)器(Batch Reactor，BSTR)、間歇式攪拌罐、攪拌式反應(yīng)罐。其特點(diǎn)是：底物與酶一次性投入反應(yīng)器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出；反應(yīng)完成之后，固定化酶(細(xì)胞)用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批反應(yīng)。 s 優(yōu)點(diǎn)是：裝置較簡(jiǎn)單，造價(jià)較低，傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)能很迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)。s 缺點(diǎn)是：操作麻煩，固定化酶經(jīng)反復(fù)回收使用時(shí)，易失去活性，故在工業(yè)生產(chǎn)中，間歇式酶反應(yīng)器很少用于固定化酶，但常用于游離酶Ø 連續(xù)式酶反應(yīng)器s 又稱為連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器(Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR)、連續(xù)式攪拌罐。向反應(yīng)器投入固定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應(yīng)達(dá)到平衡之后，再以恒定的流速連續(xù)流入底物溶液，同時(shí)，以相同流速輸出反應(yīng)液(含產(chǎn)物)。s 優(yōu)點(diǎn)是：在理想狀況下，混合良好，各部分組成相同，并與輸出成分一致。