食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、食 品 微 生 物 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 指 導(dǎo)(羅軍 賴建平)南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物學(xué)系2009年10月前 言食品是人類賴以生存的必要條件。食品安全問(wèn)題是關(guān)系到人的生命健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要問(wèn)題。據(jù)WHO數(shù)據(jù)估計(jì)，全球每年報(bào)告食源性疾病發(fā)病病例數(shù)達(dá)十億例，其中80%由微生物引起。老百姓對(duì)食品衛(wèi)生的要求是越來(lái)越高，國(guó)家針對(duì)食品安全的法制化建設(shè)步伐正在加快。1995年正式頒布中華人民共和國(guó)食品衛(wèi)生法，為搞好品衛(wèi)生工作，保證食品質(zhì)量提供了法律依據(jù)，2007年10月31日，國(guó)務(wù)院討論并通過(guò)中華人民共和國(guó)食品安全法，并于2008年4月20日向社會(huì)公布。食品微生物學(xué)是食品安全與質(zhì)量專業(yè)的一門專

2、業(yè)基礎(chǔ)學(xué)科，它主要研究食品中有害微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、致病性、檢測(cè)和預(yù)防，以及有益微生物的應(yīng)用和發(fā)展，為食品生產(chǎn)，食品衛(wèi)生提供理論依據(jù)。而食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的實(shí)施則可提供給學(xué)生豐富和加深理論知識(shí)，獲得感性認(rèn)識(shí)，增強(qiáng)動(dòng)手能力的機(jī)會(huì)和場(chǎng)所，同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力；實(shí)事求是、嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度以及勤儉節(jié)約、愛護(hù)公物的良好作風(fēng)。掌握食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)是食品從業(yè)人員和食品衛(wèi)生監(jiān)督者的神圣職責(zé)；是貫徹執(zhí)行食品衛(wèi)生法，提高食品質(zhì)量必不可少的技術(shù)保證；是保證食品安全衛(wèi)生的重要手段。目前，高校培養(yǎng)的食品安全專業(yè)人才，多為生產(chǎn)與加工環(huán)節(jié)需求的理工科人才，在面對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)

3、，普遍缺乏應(yīng)急反應(yīng)能力，不能對(duì)突發(fā)事件做出科學(xué)快速的處理，我們根據(jù)預(yù)防醫(yī)學(xué)食品安全專業(yè)學(xué)生的培養(yǎng)要求，制訂相應(yīng)的課程培養(yǎng)目標(biāo)，通過(guò)開展食源性疾病檢測(cè)綜合性實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)加強(qiáng)學(xué)生應(yīng)急反應(yīng)能力培養(yǎng)，如接報(bào)衛(wèi)生事件后正確處理能力、根據(jù)不同狀況采集足夠證據(jù)能力、現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查分析能力、流行病調(diào)查統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)能力、生物安全防范操作能力、微生物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)芰Α⒕C合分析報(bào)告能力、防止事件擴(kuò)大化等能力。本教材力求突出應(yīng)急型公共衛(wèi)生人才培養(yǎng)特色，以適應(yīng)社會(huì)工作的需求，內(nèi)容符合“特色、實(shí)用、創(chuàng)新”的原則，既注重基本理論和基本技術(shù)的系統(tǒng)性，又突出重點(diǎn)，突出實(shí)用性。增加了食源性疾病暴發(fā)的調(diào)查和控制內(nèi)容，首次將流行病學(xué)、衛(wèi)生法學(xué)、

4、食品安全與控制學(xué)、衛(wèi)生管理學(xué)等理論實(shí)驗(yàn)知識(shí)進(jìn)行整合，側(cè)重于食源性疾病暴發(fā)應(yīng)急處理能力所需基本技能的實(shí)際操作與演練。并對(duì)食品微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理內(nèi)容作了介紹。附錄包括培養(yǎng)基、常用試劑、及調(diào)查分析的背景資料。由于編者水平有限、時(shí)間倉(cāng)促，書中難免有疏漏與不妥之處，敬請(qǐng)同行和廣大讀者批評(píng)指正。二、學(xué)生缺乏面對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)的應(yīng)急反應(yīng)能力食品微生物學(xué)教學(xué)，缺乏對(duì)學(xué)生的應(yīng)急反應(yīng)能力的培養(yǎng)，在應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，三、三、突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急能力的培養(yǎng)四、本書的編排本書分六個(gè)部分，第一部分是實(shí)用準(zhǔn)則，簡(jiǎn)述暴發(fā)調(diào)查和控制的步驟，重點(diǎn)介紹工作計(jì)劃和準(zhǔn)備、食源性疾病暴發(fā)的監(jiān)測(cè)、調(diào)查、控制措施和食源性疾病原體

5、的檢測(cè)。五、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋窘滩脑趯?shí)驗(yàn)編排上，注重實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、實(shí)用性及連貫性。積極調(diào)動(dòng)學(xué)生的能動(dòng)性，盡量增加學(xué)生動(dòng)手機(jī)會(huì)，讓學(xué)生先從掌握培養(yǎng)基的配制和滅菌入手，隨后用自己所配制的培養(yǎng)基進(jìn)行接種分離，通過(guò)顯微觀察獲得對(duì)微生物的感性認(rèn)識(shí)；通過(guò)生化試驗(yàn)、菌落總數(shù)測(cè)定及大腸菌群測(cè)定等試驗(yàn)熟練并掌握食品微生物學(xué)的操作和檢驗(yàn)技術(shù)。此外，還安排學(xué)生赴野外進(jìn)行真菌的采集，初步認(rèn)識(shí)和生態(tài)考察，豐富視野。調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性、積極性、創(chuàng)造性，重視學(xué)生能力的培養(yǎng)是當(dāng)今教學(xué)改革的主旋律。作為一名教師，不僅要傳授最基本、最核心的理論知識(shí)，更重要的是應(yīng)努力教給學(xué)生如何提高能力。能力主要包括自學(xué)能力(查閱文獻(xiàn)資料能力)、科學(xué)思

6、維能力(分析、綜合、想象和創(chuàng)造能力)、動(dòng)手能力(實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和基本操作能力)、表達(dá)能力(語(yǔ)言、文字、圖表及整理統(tǒng)計(jì)能力)等。有鑒于此，本書在教學(xué)內(nèi)容改革上作了一些大膽的嘗試：一、改變“實(shí)驗(yàn)課驗(yàn)證課堂理論”的傳統(tǒng)做法，開設(shè)綜合性實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)課教學(xué)模式是，每講完一個(gè)或幾個(gè)章節(jié)的理論知識(shí)后就安排一次實(shí)驗(yàn)課，主要是驗(yàn)證課堂理論，而學(xué)生真正動(dòng)手、動(dòng)腦機(jī)會(huì)較少，不利于學(xué)生能力培養(yǎng)。因此，我們將實(shí)驗(yàn)課程獨(dú)立出來(lái)，減少驗(yàn)證性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，將以往零散的單一的實(shí)驗(yàn)重新編排成實(shí)踐性、目的性很強(qiáng)的綜合性實(shí)驗(yàn)，集中時(shí)間進(jìn)行。綜合性實(shí)驗(yàn)涵蓋了要求學(xué)生掌握的微生物學(xué)基本技能，同時(shí)納入了一些新方法，展示了一次科學(xué)實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程，

7、給學(xué)生獨(dú)立設(shè)計(jì)和完成一個(gè)實(shí)驗(yàn)的機(jī)會(huì)，大大增加了學(xué)生動(dòng)手機(jī)會(huì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要求學(xué)生按照科研論文格式撰寫實(shí)驗(yàn)論文。二、為拓寬學(xué)生知識(shí)面，啟迪思維，精心編寫補(bǔ)充教材，主要內(nèi)容有：1.微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。2.食品微生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)。3.研究、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)。4.綜合性、研究、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告及科研論文的撰寫方法。六、因此，針對(duì)食源性疾病快速檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，但是，現(xiàn)行培養(yǎng)的公共衛(wèi)生監(jiān)督人員，對(duì)于食源性疾病的暴發(fā)的調(diào)查與控制技術(shù)還不能全面掌握，因?yàn)樯婕暗脚R床醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)、食品微生物學(xué)、食品化學(xué)、食品安全與控制等多方面的技術(shù)，這些技術(shù)又都是獨(dú)立的，分割的條塊知識(shí)，未經(jīng)整合的實(shí)驗(yàn)體系已不能滿足突發(fā)公

8、共衛(wèi)生事件時(shí)，對(duì)學(xué)生應(yīng)急能力的培養(yǎng)要求。本書重點(diǎn)培養(yǎng)學(xué)生的應(yīng)急能力， 的隨著科學(xué)發(fā)展，食品科學(xué)領(lǐng)域中微生物的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，無(wú)論是食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)藏、銷售和食用的任一環(huán)節(jié)，都要求食品專業(yè)人員正確掌握微生物學(xué)的基本理論和基本操作。近年來(lái)，食源性疾病的暴發(fā)的調(diào)查與控制涉及到多個(gè)部門的工作，需要微生物技術(shù)發(fā)展很快，伴隨著許多商品化培養(yǎng)和試劑的推出以及儀器和工具的改進(jìn)，許多微生物實(shí)驗(yàn)方法已從過(guò)去繁、費(fèi)時(shí)的工作中解脫出來(lái)。本教材除保留現(xiàn)今生產(chǎn)和科研中常應(yīng)用的一些經(jīng)典方法和器材外，還補(bǔ)充了近年來(lái)推薦和應(yīng)用的一些方法，比如；將適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)食品和餐具的快速檢測(cè)大腸菌群的紙片法與傳統(tǒng)方法共同試驗(yàn)和比較；在

9、糖發(fā)酵管作比較等。限于編者的水平，本書中錯(cuò)漏在所難免，歡迎廣大讀者指正，以便再版時(shí)改進(jìn)。編者2006年09月 實(shí)驗(yàn)須知微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是一門操作技能很強(qiáng)的課程。對(duì)每一個(gè)微生物學(xué)工作者來(lái)說(shuō)，其重要性決不亞于理論課程，兩者的關(guān)系猶如大鵬的一對(duì)強(qiáng)勁翅膀，沒有它們間的協(xié)同，就無(wú)法在廣闊的藍(lán)天中自由翱翔。實(shí)驗(yàn)課教學(xué)的主要目標(biāo)是，使學(xué)生了解食品微生物學(xué)主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，樹立牢固的無(wú)菌觀念，更重要的是培養(yǎng)學(xué)生自學(xué)能力、科學(xué)思維能力、動(dòng)手能力和表達(dá)能力。為保證實(shí)驗(yàn)效果和實(shí)驗(yàn)室的安全，我們根據(jù)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的特點(diǎn)，提出如下幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：一、學(xué)生在實(shí)驗(yàn)課前，應(yīng)充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，明確實(shí)驗(yàn)

10、目的，了解實(shí)驗(yàn)原理、方法和注意事項(xiàng)。二、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿白大褂。每次實(shí)驗(yàn)前須用濕布擦凈臺(tái)面，并洗手，以減少染菌的機(jī)會(huì)。盡量不帶個(gè)人生活、學(xué)習(xí)用品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，必須要帶的書本、文具等應(yīng)放在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)操作的指定位置。三、嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，防止雜菌污染。萬(wàn)一遇到盛菌試管或瓶不慎打破而污染皮膚、衣物、桌面等意外情況，應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，及時(shí)處理，切勿隱瞞。用過(guò)的玻片放入消毒缸內(nèi)，平板、試管、吸管和廢棄的生化微量管應(yīng)放在指定地點(diǎn)待滅菌處理，不得隨意亂放或清洗。四、認(rèn)真、及時(shí)、實(shí)事求是地做好實(shí)驗(yàn)記錄，對(duì)于當(dāng)時(shí)不能得到結(jié)果而需要連續(xù)觀察的實(shí)驗(yàn)，則需記下每次觀察的現(xiàn)象和結(jié)果。注意獨(dú)立思考解決實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題。五、

11、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險(xiǎn)，應(yīng)先關(guān)掉火源，再用濕布或沙土掩蓋滅火。必要時(shí)用滅火機(jī)。六、每次實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行培養(yǎng)的材科，應(yīng)標(biāo)明自己的組別及處理方法，放于教師指定的地點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室中的菌種和物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。七、離開實(shí)驗(yàn)室前，先用消毒液泡手，再用肥皂洗手，并用清水沖凈。打掃好實(shí)驗(yàn)室，并注意關(guān)好門窗、水電。實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馄胀ü鈱W(xué)顯微鏡基本構(gòu)造及原理，掌握顯微鏡的操作使用。（二）實(shí)驗(yàn)原理普通光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器。以往最簡(jiǎn)單的顯微鏡僅由幾塊透鏡組成，而當(dāng)前使用的顯微鏡由一套透鏡組成。普通光學(xué)顯微鏡通常能將物體放大15

12、002000倍。1.顯微鏡的構(gòu)造普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造可分為兩大部分：一為機(jī)械裝置，一為光學(xué)系統(tǒng)，這兩部分很好的配合，才能發(fā)揮顯微鏡的作用。2.顯微鏡的機(jī)械裝置顯微鏡的機(jī)械裝置包括鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、推動(dòng)器、粗動(dòng)螺旋、微動(dòng)螺旋等部件（1）鏡座  鏡座是顯微鏡的基本支架，它由底座和鏡臂兩部分組成。在它上面連接有載物臺(tái)和鏡筒，它是用來(lái)安裝光學(xué)放大系統(tǒng)部件的基礎(chǔ)。（2）鏡筒  鏡筒上接接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉(zhuǎn)換器下）間的暗室。從物鏡的后緣到鏡筒尾端的距離稱為機(jī)械筒長(zhǎng)。因?yàn)槲镧R的放大率是對(duì)一定的鏡筒長(zhǎng)度而言的。鏡筒長(zhǎng)度的變化，不僅放大倍率隨之變化，而

13、且成像質(zhì)量也受到影響。因此，使用顯微鏡時(shí)，不能任意改變鏡筒長(zhǎng)度。國(guó)際上將顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)筒長(zhǎng)定為160mm，此數(shù)字標(biāo)在物鏡的外殼上。（3）物鏡轉(zhuǎn)換器  物鏡轉(zhuǎn)換器上可安裝34個(gè)接物鏡，一般是三個(gè)接物鏡（低倍、高倍、油鏡）。Nikon顯微鏡裝有四個(gè)物鏡。轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，可以按需要將其中的任何一個(gè)接物鏡和鏡筒接通，與鏡筒上面的接目鏡構(gòu)成一個(gè)放大系統(tǒng)。（4）載物臺(tái)  載物臺(tái)中央有一孔，為光線通路。在臺(tái)上裝有彈簧標(biāo)本夾和推動(dòng)器，其作用為固定或移動(dòng)標(biāo)本的位置，使得鏡檢對(duì)象恰好位于視野中心。（5）推動(dòng)器  是移動(dòng)標(biāo)本的機(jī)械裝置，它是由一橫一縱兩個(gè)推進(jìn)齒軸的金屬架構(gòu)成的，好的顯微鏡在縱

14、橫架桿上刻有刻度標(biāo)尺，構(gòu)成很精密的平面座標(biāo)系。如果我們須重復(fù)觀察已檢查標(biāo)本的某一部分，在第一次檢查時(shí)，可記下縱橫標(biāo)尺的數(shù)值，以后按數(shù)值移動(dòng)推動(dòng)器，就可以找到原來(lái)標(biāo)本的位置。（6）粗動(dòng)螺旋  粗動(dòng)螺旋是移動(dòng)鏡筒調(diào)節(jié)接物鏡和標(biāo)本間距離的機(jī)件，老式顯微鏡粗螺旋向前扭，鏡頭下降接近標(biāo)本。新近出產(chǎn)的顯微鏡（如Nikon顯微鏡）鏡檢時(shí)，右手向前扭載物臺(tái)上升，讓標(biāo)本接近物鏡，反之則下降，標(biāo)本脫離物鏡。（7）微動(dòng)螺旋  用粗動(dòng)螺旋只可以粗放的調(diào)節(jié)焦距，要得到最清晰的物象，需要用微動(dòng)螺旋做進(jìn)一步調(diào)節(jié)。微動(dòng)螺旋每轉(zhuǎn)一圈鏡筒移動(dòng)0.1毫米（100微米）。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡的粗動(dòng)螺旋和微動(dòng)

15、螺旋是共軸的。3.顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等組成，光學(xué)系統(tǒng)使物體放大，形成物體放大像 。（1）反光鏡  較早的普通光學(xué)顯微鏡是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成，可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡的中央，照明標(biāo)本。不用聚光器時(shí)用凹面鏡，凹面鏡能起會(huì)聚光線的作用。用聚光器時(shí)，一般都用平面鏡。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調(diào)節(jié)螺旋，可通過(guò)調(diào)節(jié)電流大小調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。（2）聚光器  聚光器在載物臺(tái)下面，它是由聚光透鏡、虹彩光圈和升降螺旋組成的。聚光器可分為明視場(chǎng)聚光器和暗視場(chǎng)聚

16、光器。普通光學(xué)顯微鏡配置的都是明視場(chǎng)聚光器，明視場(chǎng)聚光器有阿貝聚光器、齊明聚光器和搖出聚光器。阿貝聚光器在物鏡數(shù)值孔徑高于0.6時(shí)會(huì)顯示出色差和球差。齊明聚光器對(duì)色差、球差和慧差的校正程度很高，是明視場(chǎng)鏡檢中質(zhì)量最好的聚光器，但它不適于4倍以下的物鏡。搖出聚光器能將聚光器上透鏡從光路中搖出滿足低倍物鏡（4×）大視場(chǎng)照明的需要。聚光器安裝在載物臺(tái)下，其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來(lái)的光線聚焦于樣品上，以得到最強(qiáng)的照明，使物象獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以調(diào)節(jié)，使焦點(diǎn)落在被檢物體上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦點(diǎn)在其上方1.25mm處，而其上升限度為載物臺(tái)平面下方0.1mm。因此，要

17、求使用的載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間，否則被檢樣品不在焦點(diǎn)上，影響鏡檢效果。聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開大和縮小，影響著成像的分辨力和反差，若將虹彩光圈開放過(guò)大，超過(guò)物鏡的數(shù)值孔徑時(shí)，便產(chǎn)生光斑；若收縮虹彩光圈過(guò)小，分辨力下降，反差增大。因此，在觀察時(shí)，通過(guò)虹彩光圈的調(diào)節(jié)再把視場(chǎng)光闌（帶有視場(chǎng)光闌的顯微鏡）開啟到視場(chǎng)周緣的外切處，使不在視場(chǎng)內(nèi)的物體得不到任何光線的照明，以避免散射光的干擾。（3）物鏡  安裝在鏡筒前端轉(zhuǎn)換器上的接物透鏡利用光線使被檢物體第一次造像，物鏡成像的質(zhì)量，對(duì)分辨力有著決定性的影響。物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerical apea

18、ture簡(jiǎn)寫為NA），每個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑都標(biāo)在物鏡的外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。物鏡的種類很多，可從不同角度來(lái)分類：根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質(zhì)不同，可分為：干燥系物鏡  以空氣為介質(zhì)，如常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。油浸系物鏡  常以香柏油為介質(zhì)，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×100×，數(shù)值孔值大于1。根據(jù)物鏡放大率的高低，可分為：低倍物鏡  指1×6×，NA值為0.040.15；中倍物鏡  指6×25×，NA值為0.15 0.40；高倍物鏡 

19、; 指25×63×，NA值為0.350.95；油浸物鏡  指90×100×，NA值為1.251.40。根據(jù)物鏡像差校正的程度來(lái)分類可分為：消色差物鏡  是最常用的物鏡，外殼上標(biāo)有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和青光形成的色差。鏡檢時(shí)通常與惠更斯目鏡配合使用。復(fù)消色差物鏡  物鏡外殼上標(biāo)有“Apo”字樣，除能校正紅、藍(lán)、綠三色光的色差外，還能校正黃色光造成的相差，通常與補(bǔ)償目鏡配合使用。特種物鏡  在上述物鏡基礎(chǔ)上，為達(dá)到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如：帶校正環(huán)物鏡，帶視場(chǎng)光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無(wú)應(yīng)變物鏡

20、，無(wú)罩物鏡，長(zhǎng)工作距離物鏡等。目前在研究中常用的物鏡還有：半復(fù)消色差物鏡（FL），平場(chǎng)物鏡(Plan)，平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡（Plan Apo）,超平場(chǎng)物鏡（Splan，超平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡（Splan Apo）等。（4）目鏡  目鏡的作用是把物鏡放大了的實(shí)像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結(jié)構(gòu)較物鏡簡(jiǎn)單，普通光學(xué)顯微鏡的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的一塊透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場(chǎng)鏡”。上下透鏡之間或在兩個(gè)透鏡的下方，裝有由金屬制的環(huán)狀光闌或叫“視場(chǎng)光闌”，物鏡放大后的中間像就落在視場(chǎng)光闌平面處，所以其上可安置目鏡測(cè)微尺。普通光學(xué)顯微鏡常用的目鏡為惠更斯目鏡（Huyge

21、ns eyepiece），如要進(jìn)行研究用時(shí)，一般選用性能更好的目鏡，如補(bǔ)償目鏡（K）、平場(chǎng)目鏡（P）、廣視場(chǎng)目鏡（WF）。照相時(shí)選用照相目鏡（NFK）。4.光學(xué)顯微鏡的成像原理顯微鏡的放大是通過(guò)透鏡來(lái)完成的，單透鏡成像具有像差，影響像質(zhì)。由單透鏡組合而成的透鏡組相當(dāng)于一個(gè)凸透鏡，放大作用更好。是顯微鏡的成像原理模式。AB為標(biāo)本    5.顯微鏡的性能顯微鏡分辨能力的高低決定于光學(xué)系統(tǒng)的各種條件。被觀察的物體必須放大率高，而且清晰，物體放大后，能否呈現(xiàn)清晰的細(xì)微結(jié)構(gòu)，首先取決于物鏡的性能，其次為目鏡和聚光鏡的性能。（1）數(shù)值孔徑 也叫做鏡口率（或開口率），簡(jiǎn)寫為N.

22、A，在物鏡和聚光器上都標(biāo)有它們的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判斷它們性能的最重要指標(biāo)。數(shù)值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關(guān)系，它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方根成正比。數(shù)值孔徑可用下式表示：N.A=n.sin2式中：n物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)析射率物鏡的鏡口角所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度。鏡口角總是小于180°。因?yàn)榭諝獾恼凵渎蕿?，所以干燥物鏡的數(shù)值孔徑總是小于1，一般為0.050.95；油浸物鏡如用香柏油（折射率為1.515）浸沒，則數(shù)值孔徑最大可接近1.5。雖然理論上數(shù)值孔徑的極限等于所用

23、浸沒介質(zhì)的折射率，但實(shí)際上從透鏡的制造技術(shù)看，是不可能達(dá)到這一極限的。通常在實(shí)用范圍內(nèi)，高級(jí)油浸物鏡的最大數(shù)值孔徑是1.4。幾種物質(zhì)的介質(zhì)的折射率如下：空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.5，甘油為1.47，香柏油為1.52。介質(zhì)折射率對(duì)物鏡光線通路的影響見。（2）分辨力D可用下式表示：D=/2N.A.可見光的波長(zhǎng)為0.40.7微米，平均波長(zhǎng)為0.55微米。若用數(shù)值孔為0.65的物鏡，則D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。這表示被檢物體在0.42微米以上時(shí)可被觀察到，若小于0.42微米就不能視見。如果使用數(shù)值孔徑為1.25的物鏡，則D=2.20微米。凡被檢物體長(zhǎng)度大于這個(gè)

24、數(shù)值，均能視見。由此可見，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根據(jù)上式，可通過(guò)：（1）減低波長(zhǎng)；（2）增大折射率；（3）加大鏡口角來(lái)提高分辨力。紫外線作光源的顯微鏡和電子顯微鏡就是利用短光波來(lái)提高分辨力以檢視較小的物體的。物鏡分辨力的高低與造象是否清楚有密切的關(guān)系。目鏡沒有這種性能。目鏡只放大物鏡所造的象。（3）放大率顯微鏡放大物體，首先經(jīng)過(guò)物鏡第一次放大造象，目鏡在明視距離造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物體兩者體積大小之比例。因此，顯微鏡的放大率（V）等于物鏡放大率（V1）和目鏡放大率（V2）的乘積，即：V=V1×V2比較精確的計(jì)算方法，可從下列公式求得M=×DF

25、1F2F1=接物鏡焦距，F(xiàn)2=接目鏡焦距  =光學(xué)筒長(zhǎng)，D=明視距離（=250毫米）=接物鏡的放大倍數(shù)D=接目鏡放大倍數(shù)M=顯微鏡放大倍數(shù)F1F2設(shè)=160毫米   F1=4毫米  D=250毫米  F2=150毫米則M=×D=160×250=40×16.7=668倍F1F2415（4）焦深在顯微鏡下觀察一個(gè)標(biāo)本時(shí)，焦點(diǎn)對(duì)在某一象面時(shí)，物象最清晰，這象面為目的面。在視野內(nèi)除目的面外，還能在目的面的上面和下面看見模糊的物象，這兩個(gè)面之間的距離稱為焦深。物鏡的焦深和數(shù)值孔徑及放大率成反比：即數(shù)值孔徑和放大率愈大，焦深愈

26、小。因此調(diào)節(jié)油鏡比調(diào)節(jié)低倍鏡要更加仔細(xì)，否則容易使物象滑過(guò)而找不到。6.顯微鏡的使用操作及注意事項(xiàng)顯微鏡結(jié)構(gòu)精密，使用時(shí)必須細(xì)心，要按下述操作步驟進(jìn)行。（1）觀察前的準(zhǔn)備1.顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時(shí)，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運(yùn)到實(shí)驗(yàn)桌上。2.將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙。3.調(diào)節(jié)光照 不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過(guò)反光鏡來(lái)調(diào)節(jié)光照，但不能用直射陽(yáng)光，直射陽(yáng)光會(huì)影響物像的清晰并刺激眼睛。將10×物鏡轉(zhuǎn)入光孔，將聚光器上的虹彩光圈打開到最大位置，用左眼觀察目鏡中視野的亮度，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，使視野的光照達(dá)

27、到最明亮最均勻?yàn)橹埂９饩€較強(qiáng)時(shí)，用平面反光鏡，光線較弱時(shí)，用凹面反光鏡。自帶光源的顯微鏡，可通過(guò)調(diào)節(jié)電流旋鈕來(lái)調(diào)節(jié)光照強(qiáng)弱。4.調(diào)節(jié)光軸中心 顯微鏡在觀察時(shí)，其光學(xué)系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場(chǎng)光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場(chǎng)內(nèi)可見到視場(chǎng)光闌圓球多邊形的輪廓像，如此像不在視場(chǎng)中央，可利用聚光器外側(cè)的兩個(gè)調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場(chǎng)光闌打開，能看到光束向視場(chǎng)周緣均勻展開直至視場(chǎng)光闌的輪廓像完全與視場(chǎng)邊緣內(nèi)接，說(shuō)明光線已經(jīng)合軸。（2）低倍鏡觀察  鏡檢任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習(xí)慣

28、。因?yàn)榈捅剁R視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。將標(biāo)本片放置在載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使被觀察的標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀察并同時(shí)用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺(tái)），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動(dòng)器移動(dòng)標(biāo)本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進(jìn)行觀察。（3）高倍鏡觀察  在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號(hào)的物鏡，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適

29、中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺(tái)上升（或鏡筒下降），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進(jìn)行觀察。（4）油鏡觀察  油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，再加上一般光學(xué)顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時(shí)要特別細(xì)心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。使用油鏡按下列步驟操作：1.先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺(tái)下降）約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。2.在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。3.從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油

30、中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。4.從接目鏡內(nèi)觀察，放大視場(chǎng)光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場(chǎng)光闌油鏡開大視場(chǎng)光闌），上調(diào)聚光器，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)徐徐下降（或鏡筒上升），當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，必須再?gòu)膫?cè)面觀察，重復(fù)上述操作。5.觀察完畢，下降載物臺(tái)，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭23下即可，（注意向一個(gè)方向擦拭）。6.將各部分還原，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺(tái)通光孔相對(duì)，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降

31、下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個(gè)干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺(tái)等機(jī)械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。實(shí)驗(yàn)二 相差顯微鏡（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庀嗖铒@微鏡基本構(gòu)造及原理，掌握相差顯微鏡的操作使用。（二）實(shí)驗(yàn)原理1.相差顯微鏡的特點(diǎn) 相差顯微鏡是一種將光線通過(guò)透明標(biāo)本細(xì)節(jié)時(shí)所產(chǎn)生的光程差（即相位差）轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)差的特種顯微鏡。光線通過(guò)比較透明的標(biāo)本時(shí)，光的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化。因此，用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本（如活的細(xì)胞）時(shí)，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而，由于細(xì)胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過(guò)這種標(biāo)本時(shí)，直射光和衍射光的

32、光程就會(huì)有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會(huì)發(fā)生改變（產(chǎn)生相位差）。光的相位差人的肉眼感覺不到，但相差顯微鏡能通過(guò)其特殊裝置環(huán)狀光闌和相板，利用光的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差（明暗差），從而使原來(lái)透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對(duì)比度增強(qiáng)，使我們能比較清楚的觀察到普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。2.相差顯微鏡的成像原理 鏡檢時(shí)光源只能通過(guò)環(huán)狀光闌的透明環(huán)，經(jīng)聚光器后聚成光束，這束光線通過(guò)被檢物體時(shí)，因各部分的光程不同，光線發(fā)生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦點(diǎn)平面和相板上

33、的共軛面重合。因此，未發(fā)生偏斜的直射光便通過(guò)共軛面，而發(fā)生偏斜的衍射光則經(jīng)補(bǔ)償面通過(guò)。由于相板上的共軛面和補(bǔ)償面的性質(zhì)不同，它們分別將通過(guò)這兩部分的光線產(chǎn)生一定的相位差和強(qiáng)度的減弱，兩組光線再經(jīng)后透鏡的會(huì)聚，又復(fù)在同一光路上行進(jìn)，而使直射光和衍射光產(chǎn)生光的干涉，變相位差為振幅差。這樣在相差顯微鏡鏡檢時(shí)，通過(guò)無(wú)色透明體的光線使人眼不可分辨的相位差轉(zhuǎn)化為人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。3.相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)和裝置  相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是相同的，所不同的是它具有四部分特殊結(jié)構(gòu)：即環(huán)狀光闌、相板、合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡及綠色濾光片。（1）環(huán)狀光闌  具有環(huán)形開孔的光闌。位于

34、聚光器的前焦點(diǎn)平面上，光闌的直徑大小是與物鏡的放大倍數(shù)相匹配的，并有一個(gè)明視場(chǎng)光闌，與聚焦器一起組成轉(zhuǎn)盤聚光器。在使用時(shí)只要把相應(yīng)的光闌轉(zhuǎn)到光路即可。（2）相板  位于物鏡內(nèi)部的后焦平面上。相板上有兩個(gè)區(qū)域，直射光通過(guò)的部分叫“共軛面”，衍射光通過(guò)的部分叫“補(bǔ)償面”。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常以“Ph”字樣標(biāo)在物鏡外殼上。相板上鍍有兩種不同的金屬膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常為鉻、銀等金屬在真空中蒸發(fā)而鍍成的薄膜，它能把通過(guò)的光線吸收掉60%93%，相位膜為氟化鎂等在真空中蒸發(fā)鍍成，它能把通過(guò)的光線相位推遲1/4波長(zhǎng)。根據(jù)需要，兩種膜有不同的鍍法，從而制造出不同類型的相差物鏡。如果吸

35、收膜和相位膜都鍍?cè)谙喾吹墓曹椕嫔?，通過(guò)共軛面的直射光不但振幅減弱，而且相位也被推遲1/4，衍射光因通過(guò)物體時(shí)相位也被推遲1/4，這樣就使得直射光與衍射光維持在同一個(gè)相位上。根據(jù)相長(zhǎng)干涉原理，合成光等于直射光與衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通過(guò)被檢物體的合成光就比背景明亮。這樣的效果叫負(fù)相差，鏡檢效果是暗中之明。如果吸收膜鍍?cè)诠曹椕?，相位膜鍍?cè)谘a(bǔ)償面上，直射光僅被吸收，振幅減少，但相位未被推遲，而通過(guò)補(bǔ)償面的衍射光的相位，則被推遲了兩個(gè)1/4，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2。根據(jù)相消干涉原理，這樣通過(guò)被檢物體的合成光要比背景暗，這種效果叫正相差，即鏡檢效果是明中之暗。負(fù)相

36、差物鏡（Negativecontrast）用縮寫字母“N”表示，正相差物鏡（Positive  contrast）用縮寫字母“P”表示，由于吸收膜對(duì)通過(guò)它的光線的透過(guò)率不同，可分為高、中、低及低低，如Olympus光的透過(guò)率分為：7%、15%、20%、40%四個(gè)等級(jí)，因此分為高（High略寫為H），中（Medium略寫為M），低（Low略寫為L(zhǎng)）及低低（LowLow略寫成LL）四類，構(gòu)成了負(fù)高（NH）、負(fù)中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四種類型相差物鏡，這些字母符號(hào)都寫在相差物鏡的外殼上。可根據(jù)被檢物體的特性來(lái)選擇使用不同類型的相差物鏡。（3）合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡  是

37、相差顯微鏡一個(gè)極為重要的結(jié)構(gòu)。環(huán)狀光闌的像必須與相板共軛面完全吻合，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)直射光和衍射光的特殊處理。否則應(yīng)被吸收的直射光被泄掉，而不該吸收的衍射光反被吸收，應(yīng)推遲的相位有的不能被推遲，這樣就不能達(dá)到相差鏡檢的效果。由于環(huán)狀光闌是通過(guò)轉(zhuǎn)盤聚光器與物鏡相匹配的，因而環(huán)狀光闌與相板常不同軸。為此，相差顯微鏡配備有一個(gè)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡（在鏡的外殼上標(biāo)有“CT”符號(hào)），用于合軸調(diào)節(jié)。使用時(shí)撥去一側(cè)目鏡，插入合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，旋轉(zhuǎn)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡的焦點(diǎn)，便能清楚看到一明一暗兩個(gè)圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個(gè)調(diào)節(jié)鈕，使明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與暗的相板上共軛面暗環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過(guò)小或過(guò)大，可調(diào)節(jié)聚光器

38、的升降旋鈕，使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到最高點(diǎn)或降到最低點(diǎn)而仍不能矯正，說(shuō)明玻片太厚了，應(yīng)更換。調(diào)好后取下望遠(yuǎn)鏡，換上目鏡即可進(jìn)行鏡檢觀察。（4）綠色濾光片  由于使用的照明光線的波長(zhǎng)不同，常引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長(zhǎng)范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來(lái)調(diào)整光源的波長(zhǎng)。Olympus廠家生產(chǎn)的相差顯微鏡在鏡檢時(shí)要使用該廠規(guī)定的IF550綠色濾光片作為配套器件。4.相差顯微鏡的使用范圍、操作步驟及注意事項(xiàng)（1）使用范圍  相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細(xì)節(jié)，適用于對(duì)活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、增殖情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察。因此，是微生

39、物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、細(xì)胞工程、雜交瘤技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的必備工具。（2）操作步驟 根據(jù)觀察標(biāo)本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。將標(biāo)本片放到載物臺(tái)上。進(jìn)行光軸中心的調(diào)整。取下一側(cè)目鏡，換上合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合，然后取下合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡。在使用中，如需要更換物鏡倍數(shù)時(shí)，必須重新進(jìn)行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。放上綠色濾光片，即可進(jìn)行鏡檢，鏡檢操作與普通光學(xué)顯微鏡方法相同。（3）注意事項(xiàng)視場(chǎng)光闌與聚光器的孔徑光闌必須全部開大，而且光源要強(qiáng)。因環(huán)狀光闌遮掉大部分光，物鏡相板上共軛面又吸收大部分光。不同型號(hào)的光學(xué)部件不能互換使用。

40、載玻片、蓋玻片的厚度應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)，不能過(guò)薄或過(guò)厚。切片不能太厚，一般以510m為宜，否則會(huì)引起其他光學(xué)現(xiàn)象，影響成像質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)三  微生物的分離、純化和接種一、微生物的分離、純化 （一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解微生物分離和純化的原理，2.掌握常用的分離純化微生物的方法 （二）實(shí)驗(yàn)原理 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在

41、固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不

42、同類型的微生物。（三）實(shí)驗(yàn)材料1.培養(yǎng)基  淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號(hào)培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基。2.溶液或試劑 10%酚液，盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。3.儀器或其它用具 無(wú)菌玻璃涂棒，無(wú)菌吸管，接種環(huán)，無(wú)菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、涂布器等。（四）實(shí)驗(yàn)方法倒平板制備梯度稀釋液涂布（或劃線法）培養(yǎng)挑單菌落保存。1.稀釋涂布平板法（1）倒平板 將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化待冷至5560時(shí)，高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)

43、滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉素溶液(終濃度為30g/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹?，試管或瓶口保持?duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。（2）制備土壤稀釋液 稱取土樣l0g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。用一支lml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管

44、中吸取lml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的土壤溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管。 （3）涂布將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無(wú)菌吸管分別由10-4、10-5和10-6 三管土壤稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。用無(wú)菌玻璃涂棒，右手拿無(wú)菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。（4）培養(yǎng)將高

45、氏I號(hào)培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28溫室中培養(yǎng)35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37溫室中培養(yǎng)23d。（5）挑菌落將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28和37溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。（6）平板劃線分離法 倒平板 按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。 劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-l的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無(wú)論采用哪種方法，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板

46、培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線34條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過(guò)第二次劃線部分作第三次劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。 挑菌落 同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。 結(jié)果判定 （五）實(shí)驗(yàn)思考1.所做涂布平板法和劃線法是否較好地得到了單菌落？如果不是，請(qǐng)分析其原因并重做。2.在三種不同的平板上你分離得到哪些類群的微生物？簡(jiǎn)述它們的菌落特征。二、微生物的接種技術(shù)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)2.建立無(wú)

47、菌操作的概念，掌握無(wú)菌操作的基本環(huán)節(jié)（二）實(shí)驗(yàn)原理將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。無(wú)論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無(wú)菌操作，如操作不慎引起污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可靠，影響下一步工作的進(jìn)行。（三）實(shí)驗(yàn)器材1.器械和用品 酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。2.菌種和培養(yǎng)基菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus&

48、#160;aureus）。培養(yǎng)基：普通瓊脂斜面和平板,營(yíng)養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。（四）實(shí)驗(yàn)方法斜面接種法液體接種法固體接種法穿刺接種法。1.斜面接種法斜面接種法主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種。 通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個(gè)菌落，或挑取斜面，肉湯中的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上。操作應(yīng)在無(wú)菌室、接種柜或超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，先點(diǎn)燃酒精燈。將菌種斜面培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無(wú)名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對(duì)齊，應(yīng)斜持試管呈450度角，并能清楚地看到兩個(gè)試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕

49、培養(yǎng)基表面。以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)試管棉塞，使其松動(dòng)，以便接種時(shí)易于取出。 右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，以達(dá)到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹底灼燒以免滅菌不徹底。用右手的小指和手掌之間及無(wú)名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過(guò)，以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換無(wú)菌棉塞。 將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無(wú)菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，待冷卻后再?gòu)男泵嫔瞎稳∩僭S菌苔取出，接種環(huán)不能通過(guò)火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過(guò)火焰抽出管

50、口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊棉塞。將接種管貼好標(biāo)簽或用玻璃鉛筆劃好標(biāo)記后再放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。2.液體接種法 多用于增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)，也可用純培養(yǎng)菌接種液體培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗(yàn)，其操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同，僅將不同點(diǎn)介紹如下： 由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基：用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)在管內(nèi)靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩，或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時(shí)，若用接種環(huán)不易挑起培養(yǎng)物時(shí)，可用接種鉤或接種鏟進(jìn)行。 由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時(shí)，可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)

51、需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可。 接種液體培養(yǎng)物時(shí)應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺(tái)上或其他器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。凡吸過(guò)菌液的吸管或滴管，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)。3.固體接種法 普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了，不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料，進(jìn)行固體發(fā)酵。按所用菌種或種子菌來(lái)源不同可分為：用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養(yǎng)的種子發(fā)酵液。接種時(shí)按無(wú)菌操作將菌液直接倒入固體料中，攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計(jì)算在固體料總加水量之內(nèi)，否則會(huì)使接種后含水量加大

52、，影響培養(yǎng)效果。 用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌。將種子菌于無(wú)菌條件下直接倒入無(wú)菌的固體料中即可，但必須充分?jǐn)嚢枋怪旌暇鶆颉Ｒ话闶窍劝逊N子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。4.穿刺接種法 此法多用于半固體、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養(yǎng)基的接種，操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環(huán)。接種柱狀高層或半高層斜面培養(yǎng)管時(shí)，應(yīng)向培養(yǎng)基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動(dòng)，以使穿刺線整齊，便于觀察生長(zhǎng)結(jié)果。5.結(jié)果 分別記錄并描繪平板劃線、斜面和半固體接種的微生

53、物生長(zhǎng)情況和培養(yǎng)特征。（五）實(shí)驗(yàn)思考1.如何確定平板上某單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)？請(qǐng)寫出實(shí)驗(yàn)的主要步驟。2.為什么高氏I號(hào)培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對(duì)青霉素具有抗性的細(xì)菌，你認(rèn)為應(yīng)如何做？3.試述如何在接種中，貫徹?zé)o菌操作的原則? 4.以斜面上的菌種接種到新的斜面培養(yǎng)基為例說(shuō)明操作方法和注意事項(xiàng)。5.試設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離酵母菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法。（二）實(shí)驗(yàn)原理用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。

54、因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。簡(jiǎn)單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，簡(jiǎn)單染色不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染

55、色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。（三）實(shí)驗(yàn)器材1.活材料：培養(yǎng)12-16h的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis），培養(yǎng)24h的大腸桿菌

56、（Escherichia coli）2.染色液和試劑：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、復(fù)紅、二甲苯、香柏油3.器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡（四）實(shí)驗(yàn)方法1.簡(jiǎn)單染色（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾水，按無(wú)菌操作法取菌涂片，左邊涂蘇云金桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的蘇云金桿菌濃菌液挑2-3環(huán)涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取2-3環(huán)涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過(guò)

57、火焰2-3次固定（以不燙手為宜）（4）染色：將固定過(guò)的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復(fù)紅染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：將洗過(guò)的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。2.革蘭氏染色（1）涂片：涂片方法與簡(jiǎn)單染色涂片相同。（2）晾干：與簡(jiǎn)單染色法相同。（3）固定，與簡(jiǎn)單染色法相同（4）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1min。（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。（6）媒染：滴加盧哥氏

58、碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無(wú)色，立即水洗。（9）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。（12）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。（13）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：將浸過(guò)油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭?？春蟮娜旧Ｆ脧U紙將香柏油擦干凈。（五）實(shí)驗(yàn)思考給出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。（六）注意事項(xiàng)1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如