基因工程技術生產(chǎn)重組蛋白ppt課件

1、從基因到蛋白的復制、轉錄和翻譯過程從基因到蛋白的復制、轉錄和翻譯過程功能蛋白功能蛋白組裝組裝什么是基因工程什么是基因工程 基因工程基因工程(Genetic Engineering)原稱遺傳工原稱遺傳工程。是指在分子程度上將一種或多種生物體程。是指在分子程度上將一種或多種生物體(供體供體)的的DNA片斷目的基因與載體片斷目的基因與載體DNA分子如質(zhì)分子如質(zhì)粒、病毒等在體外進展拼接重組粒、病毒等在體外進展拼接重組,產(chǎn)生新的自然界產(chǎn)生新的自然界從未有過的重組從未有過的重組DNA分子，然后轉入另一種生物體分子，然后轉入另一種生物體(受體受體)內(nèi)，使之按照人們的志愿遺傳并表達出新的內(nèi)，使之按照人們的志愿

2、遺傳并表達出新的性狀的技術?；蚬こ逃袝r也稱為重組性狀的技術?；蚬こ逃袝r也稱為重組DNA技術技術(DNA Recombination)或分子克隆技術或分子克隆技術(Molecular Cloning)。什么是重組蛋白什么是重組蛋白 重組蛋白是指將一種或多種生物體供體的重組蛋白是指將一種或多種生物體供體的基因?qū)肓硪环N生物體受體內(nèi)，使之按照人們基因?qū)肓硪环N生物體受體內(nèi)，使之按照人們的志愿遺傳并表達出的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。的志愿遺傳并表達出的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。n運用基因工程技術構建重組細胞并經(jīng)過重組細胞培運用基因工程技術構建重組細胞并經(jīng)過重組細胞培育，令其超量合成其它生物體內(nèi)含量極微但卻具有育，令其超量合成

3、其它生物體內(nèi)含量極微但卻具有極高經(jīng)濟價值重組蛋白是現(xiàn)代生物技術中最活潑的極高經(jīng)濟價值重組蛋白是現(xiàn)代生物技術中最活潑的研討方向之一，廣泛運用于消費藥用蛋白質(zhì)及代謝研討方向之一，廣泛運用于消費藥用蛋白質(zhì)及代謝工程等領域。工程等領域。n曾經(jīng)投放市場并正在研制開發(fā)的重組蛋白藥物幾乎曾經(jīng)投放市場并正在研制開發(fā)的重組蛋白藥物幾乎觸及到醫(yī)藥的各個領域，包括各種抗病毒劑、抗癌觸及到醫(yī)藥的各個領域，包括各種抗病毒劑、抗癌因子、抗因子、抗AIDS藥物、新型抗生素、重組疫苗、重組藥物、新型抗生素、重組疫苗、重組生長激素、重組干擾素、重組抗體、免疫輔助劑、生長激素、重組干擾素、重組抗體、免疫輔助劑、抗衰老保健品、心腦

4、血管防護急救藥、生長因子以抗衰老保健品、心腦血管防護急救藥、生長因子以及診斷試劑等。及診斷試劑等。 重組蛋白的消費包括重組蛋白的消費包括 上游技術和下游技上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是外源基因術兩大組成部分。上游技術指的是外源基因重組、克隆和表達載體以及基因工程菌細重組、克隆和表達載體以及基因工程菌細胞的設計與構建；而下游技術那么涉及到胞的設計與構建；而下游技術那么涉及到含有重組外源基因的生物細胞基因工程菌含有重組外源基因的生物細胞基因工程菌或細胞的大規(guī)模培育以及外源基因表達的或細胞的大規(guī)模培育以及外源基因表達的重組蛋白的分別純化過程。重組蛋白的分別純化過程。 重組蛋白的整個過

5、程由工程菌重組蛋白的整個過程由工程菌(細胞細胞)的設計構建上游技的設計構建上游技術和基因產(chǎn)物重組蛋白的消費下游技術兩大部分術和基因產(chǎn)物重組蛋白的消費下游技術兩大部分組成，前者的單元操作過程如下組成，前者的單元操作過程如下: (1) 從供體細胞中分別出基因組從供體細胞中分別出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源別將外源DNA(包括外源基因或目的基因包括外源基因或目的基因)和載體分子切開和載體分子切開(簡簡稱切稱切); (2) 用用DNA銜接酶將含有外源基因的銜接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子片段接到載體分子上，構成上，構成DNA重組分子重組分子(簡稱接簡稱接

6、); (3) 借助于細胞轉化手段將借助于細胞轉化手段將DNA重組分子導入受體細胞中重組分子導入受體細胞中(簡簡稱轉稱轉); (4) 短時間培育轉化細胞，以擴增短時間培育轉化細胞，以擴增DNA重組分子或使其整合到重組分子或使其整合到受體細胞的基因組中受體細胞的基因組中(簡稱增簡稱增); (5) 挑選和鑒定轉化細胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達的挑選和鑒定轉化細胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達的基因工程菌或細胞基因工程菌或細胞(簡稱檢簡稱檢)。 由此可見，基因工程的上游操作過程可簡化為由此可見，基因工程的上游操作過程可簡化為:切、接、轉切、接、轉、增、檢。、增、檢。nThe DNA containin

7、g the gene must be isolated away from its genomic contextnThat should be simple but there are big problemsGene of interestCloning can supply large quantities of recombinant DNASingle bacterium transformed with single copy of plasmid which is subsequently replicatedGrowth to a colonyProvides several

8、mg of recombinant DNAProvides several mg of recombinant DNAInoculate into liquid broth重組蛋白表達的典型穿越載體。重組蛋白表達的典型穿越載體。MCS = 多克隆位點；多克隆位點；Op = 細菌復制起始位點；細菌復制起始位點； Mp = 細菌中的選擇性基因；細菌中的選擇性基因；ME = 真核生物中的選擇性基因；真核生物中的選擇性基因； OE = 真核復制起始位點；真核復制起始位點；PE = 真核啟動子；真核啟動子；TE = 真核中止子；真核中止子；hG = 表達的外源基因。表達的外源基因。重組蛋白的表達系統(tǒng)重組

9、蛋白的表達系統(tǒng) 所謂重組蛋白的表達系統(tǒng)，是指消費重組蛋白所謂重組蛋白的表達系統(tǒng)，是指消費重組蛋白的基因工程宿主菌或宿主細胞。的基因工程宿主菌或宿主細胞。 目前常用的表達系統(tǒng)宿主要有原核的細菌主目前常用的表達系統(tǒng)宿主要有原核的細菌主要是大腸桿菌，要是大腸桿菌，E. Coli.和真核的酵母菌、昆蟲細和真核的酵母菌、昆蟲細胞、動物細胞系以及近年開展起來的盤基網(wǎng)柄菌系胞、動物細胞系以及近年開展起來的盤基網(wǎng)柄菌系統(tǒng)。統(tǒng)。1、原核生物表達系統(tǒng)細菌 (E. coli.)2、真核生物表達系統(tǒng)酵母菌(Yeast)3、動物細胞4、昆蟲細胞4、新型真核表達系統(tǒng)盤基網(wǎng)柄菌 盤基網(wǎng)柄菌盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteli

10、um discoideum)屬于真屬于真菌界的粘菌亞界的聚粘霉綱菌界的粘菌亞界的聚粘霉綱(Acrasiomzcetes)。1869年真菌學家年真菌學家Oskar Brefeld初次描畫了盤基網(wǎng)柄初次描畫了盤基網(wǎng)柄菌。盤基網(wǎng)柄菌屬菌。盤基網(wǎng)柄菌屬D. discoideum由由Raper 1935年年發(fā)現(xiàn)。在自然界中發(fā)現(xiàn)。在自然界中D. discoideum 經(jīng)過吞噬土壤外經(jīng)過吞噬土壤外表的細菌攝取營養(yǎng)和繁衍。表的細菌攝取營養(yǎng)和繁衍。生長階段生長階段 (growth phase)重組基因工程菌的高密度培育重組基因工程菌的高密度培育n培育基組成的優(yōu)化培育基組成的優(yōu)化n 流加流加n固定化固定化n罐流床

11、罐流床n微過濾微過濾 下下 游游培育基組成的優(yōu)化培育基組成的優(yōu)化碳源種類的選擇碳源種類的選擇下游：培育基組成的優(yōu)化下游：培育基組成的優(yōu)化2L發(fā)酵罐中流加培育盤基網(wǎng)柄菌消費發(fā)酵罐中流加培育盤基網(wǎng)柄菌消費hFasL基因工程菌的固定化培育基因工程菌的固定化培育n將基因工程菌固定在多孔載體上，可提高菌體將基因工程菌固定在多孔載體上，可提高菌體密度，實現(xiàn)延續(xù)發(fā)酵，為利用其消費異源蛋白密度，實現(xiàn)延續(xù)發(fā)酵，為利用其消費異源蛋白提供了有效途徑。提供了有效途徑。n多孔載體：多孔陶瓷、浮石、片狀硅膠泡沫和多孔載體：多孔陶瓷、浮石、片狀硅膠泡沫和柱狀硅膠泡沫等。柱狀硅膠泡沫等。固定化培育基因工程菌細胞固定化培育基因

12、工程菌細胞載體外表和內(nèi)部的細胞固定化電鏡掃描照片載體外表和內(nèi)部的細胞固定化電鏡掃描照片多孔陶瓷多孔陶瓷浮石浮石生物微膠囊固定化生物微膠囊固定化經(jīng)過一層半透膜圍成的微囊將細胞包埋，使目的蛋白細胞留在微囊經(jīng)過一層半透膜圍成的微囊將細胞包埋，使目的蛋白細胞留在微囊中，而培育基營養(yǎng)成分和細胞分泌的小分子物質(zhì)可以自在出入。中，而培育基營養(yǎng)成分和細胞分泌的小分子物質(zhì)可以自在出入。羧甲基纖維素鈉海藻酸鈣羧甲基纖維素鈉海藻酸鈣 CMCALG體系體系罐流床反響器延續(xù)培育固定化細胞罐流床反響器延續(xù)培育固定化細胞NoImageair inair humidifierair outproductreservoirtr

13、icklebedrecirculationpumpfeedreservoir利用微過濾實現(xiàn)工程菌高密度培育利用微過濾實現(xiàn)工程菌高密度培育airreactormediumfiltrateCross-flow-Filter 采用新型陶瓷等微過濾模塊采用新型陶瓷等微過濾模塊, ,使之使之既能截流細胞既能截流細胞, ,又能分別限制細胞又能分別限制細胞密度的自分泌因子等抑制物密度的自分泌因子等抑制物, ,從而從而提高細胞密度及目的蛋白的產(chǎn)量提高細胞密度及目的蛋白的產(chǎn)量重組蛋白的分別純化下游技術n預處置及固液分別技術n 細胞破碎n 重組蛋白的包涵體處置技術n 離心n 膜分別技術n 雙水相萃取n 反膠束提取純化技術n 超臨界萃取技術n吸附色譜分別技術吸附色譜分別技術n 活性炭活性炭n 氧化鋁氧化鋁n 硅膠硅膠n 滑石粉滑石粉n 硅藻土硅藻土n 大網(wǎng)格聚合物吸附大網(wǎng)格聚合物吸附n固相析出分別法固相析出分別法n 鹽析法鹽析法n 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法n 等電點沉淀等電點沉淀n 其它沉淀法其它沉淀法n 水溶性非離子型聚合物沉淀劑水溶性非離子型聚合物沉淀劑n 金屬離子和絡合物沉淀金屬離子和絡合物沉淀n 離子型多聚物沉淀劑離子型多聚物沉淀劑n