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1、4A15基因在畢赤氏酵母中的分泌表達(dá)及初步純化Alade畢赤氏酵母作為表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)1、表達(dá)效率高,遺傳穩(wěn)定性好2、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚3、有Pr加工系統(tǒng)4、培養(yǎng)簡(jiǎn)單,成本低廉5、表達(dá)產(chǎn)物可分泌至培養(yǎng)基中而自身蛋白的分泌卻很少,利于下游的純化(畢赤氏酵母是近年來廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng)。) 一、實(shí)驗(yàn)材料 DH5、pPICZA 、GS115、TOP10、,pQE4A15 pMD18T載體、Pfu高保真酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 . PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、羊抗鼠IgG -HRP、增強(qiáng)型HRP-DAB、底物顯色試劑盒. 基因在畢赤氏酵母中表達(dá)的簡(jiǎn)單過程4A15基因的獲

2、取(PCR)目的基因的修飾與克隆表達(dá)載體的構(gòu)建畢赤氏酵母的線性化、電轉(zhuǎn)化與鑒定目的基因在畢赤酵母GS115中的表達(dá)重組蛋白的鑒定與分析重組 4A 15 的初步純化1、目的基因4A15獲取-PCR 在設(shè)計(jì) N 端引物時(shí)引入Xho酶切位點(diǎn)及 Kex2 信號(hào)肽水解位點(diǎn),并刪除 Kex2后面的 Ste3 位點(diǎn)Glu-Ala-Glu-Ala) 在下游引物5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC ATA 3引入終止密碼子和Xba酶切位點(diǎn),目的基因4A15獲取-PCR 以 pQE4A15 為模板,進(jìn)展 PCR 擴(kuò)增, 擴(kuò)增條件為 943 min,9430 s,5730 s,7250 s

3、,35個(gè)循環(huán),72延伸 10 min,4保管. 1.5% 瓊脂糖分析 PCR 產(chǎn)物2、目的基因的修飾與克隆 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收后+克隆載體 pMD18T 以 1:3 (V的比例通過 T4 連接酶接, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5,菌落 PCR 。 分析陽(yáng)性菌落:挑取 4 個(gè)陽(yáng)性菌落 進(jìn)行序列分析. 序列正確的命名為 p4A153、表達(dá)載體的構(gòu)建 雙酶切基因片段p4A15,用試劑盒回收,雙酶切質(zhì)質(zhì)粒pPICZaA ,回收大片段, 定向連接,連接產(chǎn)物在低鹽的LB 平板上培養(yǎng)。 挑取抗性菌落提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定。5、畢赤氏酵母GS115的電轉(zhuǎn)化與鑒定5.1電轉(zhuǎn)化 1、 線性化限制性內(nèi)切酶 Bs

4、tXI 單酶切表達(dá)載體和重組質(zhì)粒 2、電轉(zhuǎn)化電激轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GSll5 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件:電壓 1 500 V,4 ms).電轉(zhuǎn)化完成后培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化物涂布于Zeocin 100 mg /L 的 YPD 平板上,28恒溫培養(yǎng)36 h 左右,抗性平板上生長(zhǎng)的菌落相應(yīng)的命名GS115/pPICZaA 和 GS115/pPICZa4A15. 5、畢赤氏酵母GS115的電轉(zhuǎn)化與鑒定5.2轉(zhuǎn)化子的鑒定 提取抗性菌落的基因組DNA,(方法參見Invitrogen 酵母手冊(cè)). 以此基因組 DNA 為模板,pPICZaA 5 Aox1 primer 和 3 Aox1 primer 為引物進(jìn)行PCR. 1.5

5、%的瓊脂糖凝膠電泳分析6、目的基因在畢赤酵母GS115中表達(dá) 挑陽(yáng)性克隆單菌落接種于BMGY(含酵母粉、甘油、生物素)的培養(yǎng)基上搖床培養(yǎng)28 ,250 r /min 培養(yǎng)至 OD600 為 26) 離心收集菌體,用BMMY重懸,至OD6001 繼續(xù)搖床。. 每 24 h 向培養(yǎng)基中添加無水甲醇誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中至終濃度為 1%;每 24 h取樣,離心收集上清液,上清液用丙酮沉淀后進(jìn)行 12%SDS-PAGE 分析. 對(duì) GS115 和 GS115 /pPICZaA 作同樣的處理,以便于下游 SDS PAGE的分析6 、重組蛋白的鑒定與分析6.1 Western blotting將丙酮沉

6、淀后上清12%聚丙烯酰凝膠電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜1% BSA 封閉硝酸纖維膜依次加入一抗A42 抗體和二抗羊抗小鼠 HRP 標(biāo)志 IgG),TBST 洗滌 5 次,HRP-DAB 底物顯色試劑盒顯色.Western Blot 原理 a Western Blot與Southern印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測(cè)物是蛋白質(zhì),“探針是抗體,“顯色用標(biāo)記的二抗。Western Blot 原理 b 經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素膜NC膜上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物

7、學(xué)活性不變。Western Blot 原理 c 以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。 Western Blot操作步驟 1、蛋白樣品制備 2、蛋白含量的測(cè)定 3、SDSPAGE電泳 4、轉(zhuǎn)膜 5、免疫反應(yīng) 6、化學(xué)發(fā)光,顯影,定影 7、凝膠圖象分析6、重組蛋白的鑒定與分析6.2 質(zhì)譜分析從考染考馬斯亮藍(lán)R250CBR-250,用于檢測(cè)Pr的氨基和羧基凝膠上切下重組蛋白帶, 進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析.7 、重組

8、4A15 的初步純化 挑取陽(yáng)性克隆單菌落接種于 BMGY 培養(yǎng)基中28 ,250 r /min 培養(yǎng)至 OD600 為 26), 離心收集菌體,用 BMMY 重懸,至OD6001繼續(xù)搖床。 每24 h 向培養(yǎng)基中添加無水甲醇至終濃度為 1%;培育 48 h。 離心收集上清液,分別加入固體硫酸銨至其飽和度 30% 40% 50% 60% 70%。 離心收集沉淀,取適量沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析。 并用Band Scan 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)純度分析.蛋白質(zhì)的分離純化方法 Alade四種分離純化方法 1、根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化 2 、根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化 3 、根據(jù)電荷不同進(jìn)行分

9、離純化 4 、利用對(duì)配體的特異親和力進(jìn)行分離純化1、根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化 主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時(shí)常用的方法,它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用,除去無機(jī)鹽。2、根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等 常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。3 、根據(jù)電荷不同進(jìn)行分離純化 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類。 離子交換層析(IEC)是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。 陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì),被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來,其中結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來 另外,離子交換層析還用于抗凝血蛋白的提取4、利用對(duì)配體的特異親和力進(jìn)行分離純化 親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力(即生物學(xué)親和力

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