微生物分類與鑒定

1、第九章第九章微生物的分類和鑒定微生物的分類和鑒定 地球上的物種估計大約有150萬，其中微生物超過10萬種，而且其數(shù)目還在不斷增加。生物分類的二種基本原則：生物分類的二種基本原則：a）根據(jù)表型表型(phenetic)特征的相似程度分群歸類，這種 表型分類重在應用，不涉及生物進化或不以反映生 物親緣關系為目標。b）按照生物系統(tǒng)發(fā)育相關性水平來分群歸類，其目標 是探尋各種生物之間的進化關系，建立反映生物系 統(tǒng)發(fā)育的分類系統(tǒng)。從進化論誕生以來，已經(jīng)成生物學家普遍接受的分類原則生物系統(tǒng)學生物系統(tǒng)學(systematics)(systematics)章節(jié)內(nèi)容章節(jié)內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 通用分類單元通用分類單元系

2、統(tǒng)分類單元、種的概念、學名、亞種第二節(jié)第二節(jié) 微生物在生物界的地位微生物在生物界的地位生物界級分類學說、五界系統(tǒng)、三域?qū)W說及其發(fā)展、微生物的進化第三節(jié)第三節(jié) 各大類微生物的分類系統(tǒng)綱要各大類微生物的分類系統(tǒng)綱要原核微生物分類系統(tǒng)綱要、真菌的分類系統(tǒng)綱要第四節(jié)第四節(jié) 微生物的鑒定微生物的鑒定經(jīng)典分類鑒定方法、現(xiàn)代分類鑒定方法。 第一節(jié)第一節(jié) 通用分類單元通用分類單元 分類是認識客觀事物的一種基本方法。我們分類是認識客觀事物的一種基本方法。我們要認識、研究和利用各種微生物資源也必須對它要認識、研究和利用各種微生物資源也必須對它們進行分類。們進行分類。分類學涉及三個相互依存又有區(qū)別的組成部分：鑒定鑒

3、定分類、分類、命名、命名、命名命名(nomenclature)：鑒定鑒定(identification或或determination)：分類分類(classification)：一、分類單元及其等級一、分類單元及其等級界界 （Kingdom） (Regnum)門門 （Phylum） (Phylum)綱綱（Class） (Classis)目目（Order） (Ordo)科科（Family） (Familia)屬屬（Genus） (Genus)種種（Species） (Species)根據(jù)Carl Woese的理論，現(xiàn)在還在界界之上之上使用域域(domain) （把全部生物先分為古生菌域、細菌域和

4、真核生物域，域下面再分界。）常用的細菌分類學術語：1）培養(yǎng)物）培養(yǎng)物(culture)：2）菌株）菌株(strain)：從自然界中分離得到的任何一種微生物的純從自然界中分離得到的任何一種微生物的純培養(yǎng)物都可以稱為微生物的一個菌株；用實驗方法培養(yǎng)物都可以稱為微生物的一個菌株；用實驗方法( (如通過誘變?nèi)缤ㄟ^誘變) ) 所獲得的某一菌株的變異型，也可以稱為一個新的菌株，以便所獲得的某一菌株的變異型，也可以稱為一個新的菌株，以便與原來的菌株相區(qū)別。與原來的菌株相區(qū)別。Bacillus subtilisASI.398Bacillus subtilisBF7658生產(chǎn)蛋白酶生產(chǎn)淀粉酶3）型）型(form

5、或或type)：常指亞種以下的細分。當同種或同亞種不同菌株之間的性狀差異，不足以分為新的亞種時，可以細分為不同的型。4）種（）種（species）： 微生物的種：具有高度特征相似性的菌株群，這個菌株群與其微生物的種：具有高度特征相似性的菌株群，這個菌株群與其 他類群的菌株有很明顯的區(qū)別。他類群的菌株有很明顯的區(qū)別。菌株與型的區(qū)別菌株與型的區(qū)別：菌株之間不存在鑒別性特征的差異，命名不同的菌株無需分類學菌株之間不存在鑒別性特征的差異，命名不同的菌株無需分類學依據(jù)，依據(jù)，不同型的細菌之間存在鑒別性特征的差異，命名或鑒定不同的型不同型的細菌之間存在鑒別性特征的差異，命名或鑒定不同的型必需有分類學依據(jù)。

6、必需有分類學依據(jù)。二、微生物的命名雙名法，由二個拉丁字或希臘字或拉丁化了的其它文字組成，一般用斜體表示一般用斜體表示屬名在前，一般用拉丁字名詞表示，字首字母大寫種名在后，常用拉丁文形容詞表示，全部小寫若所分離的菌株只鑒定到屬，而未鑒定到種，可用若所分離的菌株只鑒定到屬，而未鑒定到種，可用sp來表示來表示，例如例如 Bacillus sp由于細菌分類單元的劃分缺乏一個易于操作的統(tǒng)一標準，為了減少因采用不同標準界定分類單元所造成的混亂，細菌系統(tǒng)分類也像其他生物分類一樣采用“模式概念”種和亞種指定模式菌株（type strain）；亞屬和屬指定模式種（type species）；屬以上至目級分類單元

7、指定模式屬（type genus）；模式菌株應送交菌種保藏機構保藏，以便備查考和索取。第二節(jié)第二節(jié) 微生物在生物界的地位微生物在生物界的地位一、生物的界級分類學說一、生物的界級分類學說兩界系統(tǒng)三界系統(tǒng)四界系統(tǒng)五界系統(tǒng)六界系統(tǒng)利用16SrRNA建立分子進化樹的美國科學家 Carl Woese 二、三域?qū)W說及其發(fā)展二、三域?qū)W說及其發(fā)展三、rRNA和系統(tǒng)發(fā)育樹1. rRNA的順序和進化培養(yǎng)微生物培養(yǎng)微生物提取并純化提取并純化rRNArRNA序列測定序列測定分析比較分析比較微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關系微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關系2. 特征序列或序列印記（signature sequence）通過對通過對r R

8、NA全序列資料的分析比較（特別是全序列資料的分析比較（特別是采用計算機）發(fā)現(xiàn)的在不同采用計算機）發(fā)現(xiàn)的在不同種群水平上的特種群水平上的特異特征性寡核苷酸序列，或異特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序在某些特定的序列位點上出現(xiàn)的單堿基印記列位點上出現(xiàn)的單堿基印記。特征序列特征序列有助于有助于迅速確定某種微生物的迅速確定某種微生物的分類歸屬，或建立新的分類單位。分類歸屬，或建立新的分類單位。3. 系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetic tree) 通過比較通過比較生物大分子序列差異的數(shù)值構生物大分子序列差異的數(shù)值構建的系統(tǒng)樹稱為分子系統(tǒng)樹，其特點是建的系統(tǒng)樹稱為分子系統(tǒng)樹，其特點是用一用一種樹狀分枝

9、的圖型來概括各種種樹狀分枝的圖型來概括各種( (類類) )生物之間生物之間的親緣關的親緣關系。系。16 S r RNA系統(tǒng)發(fā)育樹1）生命的第三種形式古生菌動物界和植物界動物界和植物界原核生物和真核生物（原核生物和真核生物（20世紀世紀60年代）年代）古細菌古細菌(archaebacteria)真細菌真細菌( (Eubacteria)真核生物真核生物(Eukaryotes)（1977，Carl Woese）Bacteria(細菌細菌)Archaea(古生菌古生菌)Eukarya(真核生物真核生物)（1990，Carl Woese）原核生物原核生物界（界（Kingdom）域（域（domain）2）

10、建立16 S r RNA系統(tǒng)發(fā)育樹的意義a）使生物進化的研究范圍真正覆蓋所有生物類群；）使生物進化的研究范圍真正覆蓋所有生物類群；傳統(tǒng)生物進化研究主要基于復雜的形態(tài)學和化石記載，因此多限傳統(tǒng)生物進化研究主要基于復雜的形態(tài)學和化石記載，因此多限于研究后生生物，而后者僅占整個生物進化歷程的于研究后生生物，而后者僅占整個生物進化歷程的1/5b）提出了一種全新的正確衡量生物間系統(tǒng)發(fā)育關系的方法；c）對探索生命起源及原始生命的發(fā)育進程提供了線索和理論依據(jù)；d）突破了細菌分類僅靠形態(tài)學和生理生化特性的限制，建立了全 新的分類理論；e）為微生物生物多樣性和微生物生態(tài)學研究建立了全新的研究理 論和研究方法，特

11、別是不經(jīng)培養(yǎng)直接對生態(tài)環(huán)境中的微生物進 行研究。不可培養(yǎng)微生物（uncultured microorganisms） 從環(huán)境中直接分離并克隆從環(huán)境中直接分離并克隆rRNA并分析其序列并分析其序列和在分子進化樹上的位置等方法而發(fā)現(xiàn)的的目前尚和在分子進化樹上的位置等方法而發(fā)現(xiàn)的的目前尚不能在人工條件下獲得培養(yǎng)的微生物。不能在人工條件下獲得培養(yǎng)的微生物。不可培養(yǎng)的微生物與生物多樣性3）三（界）三（界)域生物的主要特征域生物的主要特征三界理論雖然是根據(jù)三界理論雖然是根據(jù)16SrRNA16SrRNA序列的比序列的比較提出的，但其他特征的比較研究結果較提出的，但其他特征的比較研究結果也在一定程度上支持了三

12、也在一定程度上支持了三界生物的劃分。界生物的劃分。 隨著越來越多的微生物的全基因組序列的測定，隨著越來越多的微生物的全基因組序列的測定，人們發(fā)現(xiàn)生物在進化中存在著非常廣泛的水平基因人們發(fā)現(xiàn)生物在進化中存在著非常廣泛的水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，很多科學家都認為不能僅靠對轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，很多科學家都認為不能僅靠對16SrRNA的序列比較來確定生物之間的親緣關系，還必須借的序列比較來確定生物之間的親緣關系，還必須借助各種信息對這個進化樹進行改進。助各種信息對這個進化樹進行改進。Carl Woose的rRNA進化樹完美無缺？ 一項新的研究指出，一項新的研究指出，在我們體內(nèi)的每個細胞中有在我們體內(nèi)的每個細胞中有 40

13、 個左右的細菌基因，這個由細菌到人類寄主的個左右的細菌基因，這個由細菌到人類寄主的所謂的所謂的“橫向轉(zhuǎn)移橫向轉(zhuǎn)移(lateral transfer)”給進化生物學給進化生物學帶來了極大的問題帶來了極大的問題。 2001年5月18日 美國科學周刊292卷 第5520期人類基因組中的細菌基因？人類基因組中的細菌基因？第三節(jié)第三節(jié) 各大類微生物的分類系統(tǒng)綱要各大類微生物的分類系統(tǒng)綱要二 、真菌（菌物）分類系統(tǒng)簡介真菌（菌物）分類系統(tǒng)簡介一、 原核微生物分類系統(tǒng)原核微生物分類系統(tǒng)一、 原核微生物分類系統(tǒng)原核微生物分類系統(tǒng)（一）伯杰氏鑒定細菌學手冊(Bergeys Manual of Determina

14、tive Bacteriology)美國賓夕法尼亞大學的細菌學教授伯杰美國賓夕法尼亞大學的細菌學教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)伯杰氏手冊伯杰氏手冊: 是目前進行細菌分類、鑒定的最重要參考書，是目前進行細菌分類、鑒定的最重要參考書，其特點是描述非常詳細，包括對細菌各個屬種的特征及進行其特點是描述非常詳細，包括對細菌各個屬種的特征及進行鑒定所需做的實驗的具體方法。鑒定所需做的實驗的具體方法。1923年以來已出至第九版年以來已出至第九版(1994)；第九版伯杰氏細菌鑒定手冊設立第九版伯杰氏細菌鑒定手冊設立35個群，將古細菌部個群，將古細菌部改編為改編為5個群，全書描寫了約個群，全

15、書描寫了約500個屬。個屬。劃分為四大類：劃分為四大類： 第一類第一類 具細胞壁的革蘭氏陰性真細菌具細胞壁的革蘭氏陰性真細菌 第二類第二類 具細胞壁的革蘭氏陽性真細菌具細胞壁的革蘭氏陽性真細菌 第三類第三類 無細胞壁的真細菌無細胞壁的真細菌 第四類第四類 古細菌古細菌 伯杰氏細菌鑒定手冊伯杰氏細菌鑒定手冊（二）伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊（二）伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)第一版第一版 1984年問世，至年問世，至1989年出齊，共年出齊，共4卷。卷。第二版第二版 由由George Garrity主編分為主編分為5卷，將從卷，

16、將從2000年起年起陸續(xù)出版。這一版納入了研究核糖體陸續(xù)出版。這一版納入了研究核糖體RNA測序所產(chǎn)生測序所產(chǎn)生的許發(fā)育的許發(fā)育)分類系統(tǒng)。分類系統(tǒng)。伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊第二版 分古細菌和真細菌分古細菌和真細菌2個界，下設18門、27綱、73目、186科，包括870余屬和4900多個種。界界：古細菌：古細菌(Archaeota)(Archaeota) 部部1 1：熱變形菌、硫化葉菌、嗜壓菌：熱變形菌、硫化葉菌、嗜壓菌(Thermoprotei(Thermoprotei、SulfolobiSulfolobi、BarophilesBarophiles，2121屬屬3636種種) ) 部部2 2：產(chǎn)甲

17、烷菌：產(chǎn)甲烷菌(Methanogens(Methanogens，2121屬屬9797種種) ) 部部3 3：鹽桿菌：鹽桿菌(Halobacteria(Halobacteria，1414屬屬5050種種) ) 部部4 4：熱原體：熱原體(Thermoplasma(Thermoplasma，2 2屬屬4 4種種) ) 部部5 5：熱球菌：熱球菌(Thermococci(Thermococci，5 5屬屬1919種種) ) 界界：真細菌：真細菌(Bacteria)部部6 6：產(chǎn)液菌：產(chǎn)液菌(Aquifex)(Aquifex)和相關細菌和相關細菌(3(3屬屬5 5種種) )部部7 7：棲熱袍菌：棲熱袍

18、菌(Thermotoga)(Thermotoga)和和GeotogasGeotogas，9 9屬屬2222種種) )部部8 8：異常球菌：異常球菌(Deinococci(Deinococci，1 1屬屬8 8種種) ) 部部9 9：棲熱菌和歸屬不明的屬：棲熱菌和歸屬不明的屬(Thermi(Thermi，1010屬屬2121種種) ) 部部1010：產(chǎn)菌黃：產(chǎn)菌黃(Chrysiongenes,1(Chrysiongenes,1屬屬2 2種種) ) 部部1111：綠屈撓菌和滑柱菌：綠屈撓菌和滑柱菌(Chloroflexi(Chloroflexi和和HerpetosiphonsHerpetosiph

19、ons，5 5屬屬1111種種) ) 界界：真細菌：真細菌(Bacteria) 部12：熱微菌(Thermomicrobia,1屬2種) 部13：藍細菌(Cyanobacteria，69屬73種) 部14：綠菌(Chlorobia，6屬17種) 部15：-變形細菌(-Proteobacteria，117屬392種) 部16：-變形細菌(-Proteobacteria，53屬204種) 界界：真細菌：真細菌(Bacteria)部部1717：-變形細菌(-Proteobacteria，150屬854種) 部部1818：-變形細菌(-Proteobacteria，39屬128種)部部1919：-變形

20、細菌(-Proteobacteria，6屬56種) 部部2020：梭菌(Clostridia)和相關細菌(73屬403種) 部部2121：柔膜菌(Mollicutes，10屬191種) 部部2222：芽胞桿菌和乳桿菌(Bacilli和Lactobacilli，55屬535種)界界：真細菌：真細菌(Bacteria)部部2323：放線細菌(Actinobacteria，117屬，1371種) 部部2424：浮霉狀菌和衣原體(Planctomycetes和Chlamydia，5屬14種) 部部2626：絲狀桿菌(Fibrobacters，3屬5種) 部部2727：擬桿菌(Bacteroides，2

21、0屬130種)界界：真細菌：真細菌(Bacteria)部部2828：黃桿菌(Flavobacteria，15屬72種)部部2929：鞘氨醇桿菌(Sphingobacteria，22屬76訓)部部3030：梭形菌(Fusoforms，6屬29種) 部部3131：疣微菌和相關細菌(Verrucomicrobium，2屬5種) 二 真菌（菌物）分類系統(tǒng)簡介真菌（菌物）分類系統(tǒng)簡介Ainsworth et al(1973) V.Arx (1981) 真菌字典（真菌字典（1983）Kendrick (1992) 真菌字典（真菌字典（1995）Alexopoulos&Mins(1996)黏菌門：黏

22、菌綱黏菌門：黏菌綱 根腫菌綱根腫菌綱真菌門：真菌門：鞭毛菌亞門：壺菌綱鞭毛菌亞門：壺菌綱 絲壺菌綱絲壺菌綱 卵菌綱卵菌綱接合菌亞門：接合菌綱接合菌亞門：接合菌綱 毛菌綱毛菌綱子囊菌亞門：半子囊菌綱子囊菌亞門：半子囊菌綱 不整囊菌綱不整囊菌綱 核菌綱核菌綱 盤菌綱盤菌綱 腔菌綱腔菌綱 蟲囊菌綱蟲囊菌綱擔子菌亞門擔子菌亞門 ：冬孢菌綱：冬孢菌綱 層菌綱層菌綱 腹菌綱腹菌綱半知菌亞門：半知菌亞門： 芽孢綱芽孢綱 絲孢綱絲孢綱 腔孢綱腔孢綱 真真 菌菌 界界（1995）第四節(jié)第四節(jié) 微生物分類鑒定的方法微生物分類鑒定的方法生物分類的傳統(tǒng)指標生物分類的傳統(tǒng)指標分子生物學指標分子生物學指標 微型、簡便、快

23、速或自動化鑒定技術微型、簡便、快速或自動化鑒定技術細菌的數(shù)值分類細菌的數(shù)值分類 形態(tài)學特征形態(tài)學特征生理學特征生理學特征生態(tài)學生態(tài)學特征 從不同層次，用不同學科的技術方法來研究和比較不同微生物的細胞、細胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的反映微生物類群特征的資料。生物分類的傳統(tǒng)指標生物分類的傳統(tǒng)指標一、形態(tài)學特征培養(yǎng)特征、培養(yǎng)特征、運動性、運動性、特殊的細胞結構、特殊的細胞結構、細胞形態(tài)及其染色特性、細胞形態(tài)及其染色特性、等等等等微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一：微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一：a）易于觀察和比較，尤其是真核微生物和具有特殊）易于觀察和比較，尤其是真核微生物和具有特殊 形態(tài)結構的細菌；形

24、態(tài)結構的細菌；b）許多形態(tài)學特征依賴于多基因的表達，具有相對）許多形態(tài)學特征依賴于多基因的表達，具有相對 的穩(wěn)定性；的穩(wěn)定性；二、生理生化特征二、生理生化特征與微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關；代謝產(chǎn)物等代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)類型；營養(yǎng)類型；與氧的關系；與氧的關系；對溫度的適應性；對溫度的適應性；對對pH的適應性；的適應性；對滲透壓的適應性；對滲透壓的適應性；酶及蛋白質(zhì)都是基因產(chǎn)物；對微生物生理生化特征的比較也是對微生物基因組的間接比較；測定生理生化特征比直接分析基因組要容易得多；1 1、 API API 細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)2 2、 Enterotube Enterotube

25、系統(tǒng)系統(tǒng)3 3、 Biolog Biolog 全自動或手動細菌鑒定系統(tǒng)全自動或手動細菌鑒定系統(tǒng) 微型、簡便、快速或自動化鑒定技術微型、簡便、快速或自動化鑒定技術1、 API 細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)菌種菌種基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（液體）（液體） 菌懸液菌懸液檢測、編碼、查表、鑒定檢測、編碼、查表、鑒定適用于適用于APIAPI鑒定細鑒定細菌有菌有700700多種多種Analytica Products INC的簡稱。法國生物- 梅里埃公司生產(chǎn)的細菌數(shù)值分類分析鑒定系統(tǒng)。約有1 000 種生化反應,可鑒定的細菌大于550 種。目前中國各級疾病預防控制機構在細菌學檢驗中比較多地應用了此項技術

26、2、Enterotube 系統(tǒng)系統(tǒng) 不同培養(yǎng)基分裝不同小槽中，同不同培養(yǎng)基分裝不同小槽中，同步接種，培養(yǎng)后檢測、查表、鑒定。步接種，培養(yǎng)后檢測、查表、鑒定。3 3、BiologBiolog全自動或手動細菌鑒定系統(tǒng)全自動或手動細菌鑒定系統(tǒng) 在在96孔的細菌培養(yǎng)板上檢測微生物對孔的細菌培養(yǎng)板上檢測微生物對不同發(fā)酵性碳源利用情況進行的分類鑒定。不同發(fā)酵性碳源利用情況進行的分類鑒定。自動化、快速自動化、快速 可鑒定細菌有可鑒定細菌有11401140多種、酵母菌多種、酵母菌267267種、目種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。前已經(jīng)可用于絲狀真菌。每個孔中含有每個孔中含有不同的底物不同的底物菌懸液或菌懸液或無菌

27、水無菌水分子生物學指標分子生物學指標 DNA堿基因組成是各種生物一個穩(wěn)定的特征，即使個別基因突變，堿基組成也不會發(fā)生明顯變化。1. DNA的堿基組成(G+Cmol%) 分類學上，用分類學上，用G+C占全部堿基的克分占全部堿基的克分子百分數(shù)子百分數(shù)(G+Cmol%)來表示各類生物的來表示各類生物的DNA堿基因組成特征。堿基因組成特征。 每個生物種都有特定的GC%范圍，因此 可以作為分類鑒定的指標。細菌的GC%范圍為25-75%，變化范圍最大，因此更適合于細菌的分類鑒定。 GC%測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細菌 作出鑒定，并可檢驗表型特征分類的合理性， 從分子水平上判斷物種的親緣關系。G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的含量的比較主要用于分類鑒定中的否定否定但具有相似但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它們含量的生物并不