基因表達及功能分析基本策略

1、基因表達及功能分析基本策略第一節(jié)第一節(jié) 基因表達的分析策略基因表達的分析策略Strategies for Analyzing Gene Expression一、通過檢測一、通過檢測mRNA揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達特征揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達特征根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達分析分為根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達分析分為:封閉性系統(tǒng)研究方法封閉性系統(tǒng)研究方法:例如例如DNA微陣列、微陣列、Northern印跡、實時印跡、實時RT-PCR等方法，其應(yīng)用范圍僅限于已測序的物種，只能研究已等方法，其應(yīng)用范圍僅限于已測序的物種，只能研究已知的基因。知的基因。開放性系統(tǒng)研究方法開放性系

2、統(tǒng)研究方法: 如差異顯示如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物分子索引法、隨機引物PCR指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的基因?；?。這里主要針對已知基因的常用表達分析方法做一介紹。這里主要針對已知基因的常用表達分析方法做一介紹。（一）基于雜交原理的方法可檢測（一）基于雜交原理的方法可檢測mRNAmRNA表達水平表達水平1Northern印跡印跡（Northern blot） 既可分析既可分析mRNA表達又可驗證表達又可驗證cDNA新序列新序列 是一種基于是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種雜交原理建立的一種RNA

3、分析技術(shù)分析技術(shù)Northern印跡分析原理示意圖印跡分析原理示意圖2核糖核酸酶保護實驗核糖核酸酶保護實驗（ribonuclease protection assay，RPA）可用于可用于mRNA定量和定量和RNA剪接分析剪接分析 是一種基于雜交原理分析是一種基于雜交原理分析mRNA的方法，既可對的方法，既可對mRNA進行定量分析又可研究其結(jié)構(gòu)特征，靈敏度和特異性進行定量分析又可研究其結(jié)構(gòu)特征，靈敏度和特異性都很高。都很高。 核糖核酸酶保護實驗原理示意圖核糖核酸酶保護實驗原理示意圖可對可對mRNA進行區(qū)域定位進行區(qū)域定位 是利用雜交原理建立的組織原位是利用雜交原理建立的組織原位mRNA檢測技術(shù)

4、，可對細(xì)胞檢測技術(shù)，可對細(xì)胞或組織中原位表達的或組織中原位表達的mRNA進行區(qū)域定位。同時也可作為進行區(qū)域定位。同時也可作為定量分析的補充。定量分析的補充。通過設(shè)計與目標(biāo)通過設(shè)計與目標(biāo)mRNA堿基序列互補的寡核苷酸序列，標(biāo)記堿基序列互補的寡核苷酸序列，標(biāo)記后作為探針；該探針能夠特異性地與目標(biāo)靶序列雜交，檢后作為探針；該探針能夠特異性地與目標(biāo)靶序列雜交，檢測標(biāo)記信號來確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達的區(qū)位信息。測標(biāo)記信號來確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達的區(qū)位信息。雖然原位雜交在功能性方面提供的信息較少，但是該技雖然原位雜交在功能性方面提供的信息較少，但是該技術(shù)還是被廣泛用于組織中的基因表達分析，這是因為其

5、術(shù)還是被廣泛用于組織中的基因表達分析，這是因為其較高的穩(wěn)定性、較廣泛的靶點和組織適用性。較高的穩(wěn)定性、較廣泛的靶點和組織適用性。3原位雜交（原位雜交（in situ hybridization，ISH）（二）兩種變換的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是常用的（二）兩種變換的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是常用的mRNA檢測方法檢測方法1反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR 可用于可用于mRNA的半定量分析的半定量分析 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 是一是一種簡單、快捷地對種簡單、快捷地對RNA進行定性、定量分析的方法。它是以進行定性、定量分析的方法。它是以mRNA為模板，體外擴增為模板，

6、體外擴增cDNA，再以，再以cDNA為模板進行特定為模板進行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR擴增。擴增。RT-PCR技術(shù)一般用于技術(shù)一般用于RNA的的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行樣品進行半定量分析。半定量分析。 該方法適合對待測樣品進行初步篩選，目前已廣泛被實時定量該方法適合對待測樣品進行初步篩選，目前已廣泛被實時定量PCR替代。替代。 常用于常用于mRNA的定量分析的定量分析 實時定量實時定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)是定量分析是

7、定量分析mRNA的最通用、最快速、最的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對簡便的方法，該方法是對PCR反應(yīng)進行實時監(jiān)測，具有很高反應(yīng)進行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。的靈敏度和特異性。2實時定量實時定量PCR目前有目前有5種技術(shù)用于實時定量種技術(shù)用于實時定量PCR： 其中最經(jīng)濟、簡便的技術(shù)是利用熒光染料（如其中最經(jīng)濟、簡便的技術(shù)是利用熒光染料（如SYBR Green ）與雙鏈與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴增產(chǎn)物的增加；分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴增產(chǎn)物的增加； 其他其他4種方法都是以熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸為探針與正確種方法都是以熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸為探針與正確的 擴 增 子

8、雜 交 ， 包 括的 擴 增 子 雜 交 ， 包 括 5 核 酸 酶 法 （ 即 人 們 熟 知 的核 酸 酶 法 （ 即 人 們 熟 知 的TaqManTM）、分子信標(biāo)、）、分子信標(biāo)、ScropionsTM和探針雜交法，它和探針雜交法，它們擁有更強的特異性，可以避免對們擁有更強的特異性，可以避免對PCR后溶解曲線的需求，后溶解曲線的需求，以及后續(xù)的以及后續(xù)的Southern雜交或?qū)U增子的測序鑒定，但是成本較雜交或?qū)U增子的測序鑒定，但是成本較高。高。SYBR Green實時定量實時定量PCR分析原理示意圖分析原理示意圖 二、通過蛋白質(zhì)檢測揭示基因二、通過蛋白質(zhì)檢測揭示基因 翻譯水平的表達特

9、征翻譯水平的表達特征 Western印跡（印跡（Western blot）是一種免疫印跡技術(shù)，其基）是一種免疫印跡技術(shù)，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)/多肽分子。當(dāng)在蛋多肽分子。當(dāng)在蛋白質(zhì)水平上檢測特定基因的表達活性時，最常用的方法就是白質(zhì)水平上檢測特定基因的表達活性時，最常用的方法就是利用利用Western印跡對細(xì)胞或組織的總蛋白質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進行印跡對細(xì)胞或組織的總蛋白質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進行定性和半定量分析。定性和半定量分析。（一）采

10、用特異抗體經(jīng)（一）采用特異抗體經(jīng)Western印跡可直接印跡可直接 測定基因編碼多肽測定基因編碼多肽1. 蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品的制備2. SDS-PAGE分離分離3. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜4. 特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜交交5. 再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的Ig）6. 最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息疫印

11、跡信息Western blot基本程序基本程序 酶聯(lián)免疫吸附分析（酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是一種建立在抗原）也是一種建立在抗原-抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)分析基本方抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)分析基本方法。法。 該方法不需經(jīng)電泳分離待檢樣品蛋白質(zhì)，而是預(yù)先將樣品包被該方法不需經(jīng)電泳分離待檢樣品蛋白質(zhì)，而是預(yù)先將樣品包被在支持體上，以后反應(yīng)過程與在支持體上，以后反應(yīng)過程與Western印跡大致相同印跡大致相同順序結(jié)合順序結(jié)合（即（即“吸附吸附”）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也可預(yù)）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也

12、可預(yù)先包被抗體，先包被抗體，“吸附吸附”抗原），再進行酶抗原），再進行酶-底物反應(yīng)。反應(yīng)后通過專底物反應(yīng)。反應(yīng)后通過專門的酶標(biāo)儀測定、記錄數(shù)據(jù)。門的酶標(biāo)儀測定、記錄數(shù)據(jù)。（二）酶聯(lián)免疫吸附分析與（二）酶聯(lián)免疫吸附分析與Western印跡原理印跡原理相似但形式不同相似但形式不同特點：特點：具有特異性；具有特異性；靈敏度很高；靈敏度很高；穩(wěn)定、操作簡便，標(biāo)本用量少，適于大規(guī)模篩查，尤穩(wěn)定、操作簡便，標(biāo)本用量少，適于大規(guī)模篩查，尤其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；既可以做定性試驗也可以做定量分析。既可以做定性試驗也可以做定量分析。 被廣泛應(yīng)用于微生物

13、學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和免被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域。疫學(xué)等領(lǐng)域。 酶聯(lián)免疫吸附分析酶聯(lián)免疫吸附分析 免疫組織化學(xué)（免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）與）與免疫細(xì)胞化免疫細(xì)胞化學(xué)（學(xué)（immunocytochemistry）原理相同，都是利用標(biāo)記的特）原理相同，都是利用標(biāo)記的特異性抗體通過抗原異性抗體通過抗原-抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，在組織或細(xì)胞原抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，在組織或細(xì)胞原位檢測特定抗原（即目標(biāo)蛋白質(zhì)）的方法，簡稱為免疫組位檢測特定抗原（即目標(biāo)蛋白質(zhì)）的方法，簡稱為免疫組化實驗。近年來由于熒光標(biāo)記抗體的廣泛應(yīng)用，這兩種方化實驗。近年來由于熒光標(biāo)

14、記抗體的廣泛應(yīng)用，這兩種方法又被統(tǒng)稱為法又被統(tǒng)稱為免疫熒光法。免疫熒光法。（三）免疫組化實驗可對組織（三）免疫組化實驗可對組織/ /細(xì)胞細(xì)胞 表達的蛋白質(zhì)進行原位檢測表達的蛋白質(zhì)進行原位檢測（immunofluorescence），可應(yīng)用熒光（倒置）顯微鏡或），可應(yīng)用熒光（倒置）顯微鏡或激光激光共聚焦顯微鏡（共聚焦顯微鏡（confocal microscopy）對靶分子進行定性、定量）對靶分子進行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進行斷層成像，是在蛋白質(zhì)和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進行斷層成像，是在蛋白質(zhì)水平分析基因表達的直觀方法。水平分析基因表達的直觀方法。 其中抗體對于蛋白質(zhì)靶

15、點的特異性、種間交叉反應(yīng)、檢測系統(tǒng)的靈敏其中抗體對于蛋白質(zhì)靶點的特異性、種間交叉反應(yīng)、檢測系統(tǒng)的靈敏性以及細(xì)胞或組織的固定類型是該方法的關(guān)鍵因素。性以及細(xì)胞或組織的固定類型是該方法的關(guān)鍵因素。 運用雙重著色或多重著色程序同時對多個感興趣的靶分子進行檢測，運用雙重著色或多重著色程序同時對多個感興趣的靶分子進行檢測，是一種揭示更多有關(guān)細(xì)胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方是一種揭示更多有關(guān)細(xì)胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。法。 免疫組化主要是作為定性、定位的技術(shù)，若結(jié)合密度計量系統(tǒng)、免疫組化主要是作為定性、定位的技術(shù)，若結(jié)合密度計量系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。

16、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）在細(xì)胞水平分析特定蛋白）在細(xì)胞水平分析特定蛋白質(zhì)的基本原理也是抗原質(zhì)的基本原理也是抗原-抗體反應(yīng)，它利用熒光標(biāo)記抗體與抗抗體反應(yīng)，它利用熒光標(biāo)記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析熒光信號，從而根據(jù)細(xì)原的特異性結(jié)合，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析熒光信號，從而根據(jù)細(xì)胞表達特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細(xì)胞（即特異基因胞表達特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細(xì)胞（即特異基因表達的細(xì)胞）作出判斷。表達的細(xì)胞）作出判斷。（四）流式細(xì)胞術(shù)用于分析（四）流式細(xì)胞術(shù)用于分析 表達特異蛋白質(zhì)的陽性細(xì)胞表達特異蛋白質(zhì)

17、的陽性細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)可以檢測活細(xì)胞，也可以檢測用甲醛固定的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)可以檢測活細(xì)胞，也可以檢測用甲醛固定的細(xì)胞。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達水平的定量分析，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達水平的定量分析，并能夠根據(jù)各種蛋白質(zhì)的表達模式區(qū)分細(xì)胞亞群。并能夠根據(jù)各種蛋白質(zhì)的表達模式區(qū)分細(xì)胞亞群。此外，流式細(xì)胞術(shù)可以使用多個熒光標(biāo)記的抗體同時對多此外，流式細(xì)胞術(shù)可以使用多個熒光標(biāo)記的抗體同時對多個基因產(chǎn)物進行標(biāo)記和監(jiān)測，是對細(xì)胞進行快速分析、分個基因產(chǎn)物進行標(biāo)記和監(jiān)測，是對細(xì)胞進行快速分析、分選、特征鑒定的一種有效方法。選、特征鑒定的一種有效方法。三、高通量檢測技術(shù)成為基因表達研究三、

18、高通量檢測技術(shù)成為基因表達研究的有力工具的有力工具 高通量篩選高通量篩選(High throughput screening，HTS)技術(shù)是在技術(shù)是在大量核酸、多肽信息累計（即資料庫）基礎(chǔ)上，采用微板作為大量核酸、多肽信息累計（即資料庫）基礎(chǔ)上，采用微板作為分子載體，制作集成分子載體，制作集成“芯片芯片”，以自動化操作系統(tǒng)進行分子雜，以自動化操作系統(tǒng)進行分子雜交的試驗過程。交的試驗過程。 因為快捷、靈敏、信息量大，適合大規(guī)模操作，故稱因為快捷、靈敏、信息量大，適合大規(guī)模操作，故稱“高通量高通量”。 高通量檢測技術(shù)適合高通量檢測技術(shù)適合“組學(xué)組學(xué)”（omics）研究，更適合生命）研究，更適合生命

19、活動過程相關(guān)的基因表達譜分析。活動過程相關(guān)的基因表達譜分析。1. 1. 基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法 基因芯片（基因芯片（gene chip）又稱）又稱DNA微陣列微陣列(DNA microarray)、DNA芯芯片（片（DNA chip）, 是將大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、是將大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因組、基因組DNA、microRNA等等) 集成在同一基片上，組成密集成在同一基片上，組成密集分子排列，通過與標(biāo)記樣品進行雜交，檢測、獲取細(xì)胞或組織集分子排列，通過與標(biāo)記樣品進行雜交，檢測、獲取細(xì)胞或組織的基因信

20、息。的基因信息。 其中其中基因表達譜（基因表達譜（expression prifile）分析是目前基因芯片應(yīng)用最）分析是目前基因芯片應(yīng)用最多的一個方面，主要采用多的一個方面，主要采用cDNA芯片，基因表達譜芯片便于對不同狀態(tài)芯片，基因表達譜芯片便于對不同狀態(tài)（如生理和病理條件）下的基因表達譜進行比較，揭示（如生理和病理條件）下的基因表達譜進行比較，揭示轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）差異表達的規(guī)律，對探索發(fā)病機制、評價治）差異表達的規(guī)律，對探索發(fā)病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標(biāo)具有重要意義。療效果、篩選藥物靶標(biāo)具有重要意義。（一）基因芯片和高通量測序技術(shù)可在基因水（一）基因芯片和高

21、通量測序技術(shù)可在基因水平高通量地分析基因表達平高通量地分析基因表達2. 2. 高通量測序技術(shù)是新一代基因表達譜分析高通量測序技術(shù)是新一代基因表達譜分析方法方法 高通量測序技術(shù)可以一次對幾十萬到幾百萬個高通量測序技術(shù)可以一次對幾十萬到幾百萬個DNA分分子片段進行序列測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全子片段進行序列測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全貌貌, 又被稱為又被稱為深度測序深度測序(deep sequencing)。 在在DNA水平上，可以大規(guī)模地分析基因組甲基化、篩選突變基因、檢測基因多水平上，可以大規(guī)模地分析基因組甲基化、篩選突變基因、檢測基因多態(tài)性；態(tài)性； 在在RNA水平上，可以對

22、水平上，可以對RNA片段進行掃描、定量與鑒定，對全基因組進行廣片段進行掃描、定量與鑒定，對全基因組進行廣譜表達研究。譜表達研究。 1）目前，高通量測序技術(shù)不僅僅在）目前，高通量測序技術(shù)不僅僅在DNA測序中起到重要測序中起到重要的作用，并且已經(jīng)應(yīng)用于基因組分析的各個方面：的作用，并且已經(jīng)應(yīng)用于基因組分析的各個方面：2）高通量測序另一個被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子）高通量測序另一個被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易地解決芯片技術(shù)在檢測研究。測序方法能輕易地解決芯片技術(shù)在檢測小分子時遇到的技術(shù)難題小分子時遇到的技術(shù)難題(短序列短序列, 高度同源高度同源

23、), 而且小分子而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度的短序列正好配合了高通量測序的長度,同時測序方法還能在同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA?；蛐酒娜秉c基因芯片的缺點: : 在于它是一個在于它是一個“封閉系統(tǒng)封閉系統(tǒng)”, , 它只能檢測人們已知序列它只能檢測人們已知序列的特征的特征( (或有限的變異或有限的變異) )。高通量測序的優(yōu)勢高通量測序的優(yōu)勢: : 在于它是一個在于它是一個“開放系統(tǒng)開放系統(tǒng)”, , 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新信息它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。（二）蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳可在蛋白質(zhì)

24、水平高通（二）蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳可在蛋白質(zhì)水平高通量地分析基因表達量地分析基因表達 蛋白質(zhì)芯片（蛋白質(zhì)芯片（protein chip）是一種對蛋白質(zhì)的表達和功能）是一種對蛋白質(zhì)的表達和功能進行高通量分析的技術(shù)。進行高通量分析的技術(shù)。 是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別復(fù)雜生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功在基片上，用以識別復(fù)雜生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/DNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/RNA-蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與

25、藥物、酶與底物、小分蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、小分子子-蛋白質(zhì)等的相互作用。蛋白質(zhì)等的相互作用。1 1蛋白質(zhì)芯片有多種形式和用途蛋白質(zhì)芯片有多種形式和用途蛋白質(zhì)檢測芯片包括蛋白質(zhì)檢測芯片包括: :1. 1. 抗體芯片抗體芯片2. 2. 抗原芯片抗原芯片3. 3. 配體芯片配體芯片4. 4. 碳水化合物芯片等碳水化合物芯片等根據(jù)蛋白質(zhì)芯片制作方法和用途不同，可將其分為根據(jù)蛋白質(zhì)芯片制作方法和用途不同，可將其分為1. 1. 蛋白質(zhì)檢測芯片蛋白質(zhì)檢測芯片2. 2. 蛋白質(zhì)功能芯片兩大類蛋白質(zhì)功能芯片兩大類 目前比較和鑒定蛋白質(zhì)表達譜更多采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳目前比較和鑒定

26、蛋白質(zhì)表達譜更多采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)又稱結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)又稱二維電泳（二維電泳（two-dimensional electrophoresis, 簡稱簡稱2-D電泳）。電泳）。 原理原理: 根據(jù)蛋白質(zhì)分子的兩個屬性根據(jù)蛋白質(zhì)分子的兩個屬性等電點和分子質(zhì)量等電點和分子質(zhì)量將蛋白質(zhì)混合物進行分離。電泳結(jié)果經(jīng)染色后，即可對不同樣將蛋白質(zhì)混合物進行分離。電泳結(jié)果經(jīng)染色后，即可對不同樣品中蛋白質(zhì)的表達譜進行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質(zhì)品中蛋白質(zhì)的表達譜進行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質(zhì)點切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用點

27、切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用質(zhì)譜（質(zhì)譜（mass spectrum）技術(shù)進行定性分析，對差異表達的蛋白質(zhì)進行鑒定。）技術(shù)進行定性分析，對差異表達的蛋白質(zhì)進行鑒定。 可同時分離數(shù)成百上千的蛋白質(zhì)?？赏瑫r分離數(shù)成百上千的蛋白質(zhì)。2 2雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜普遍用于蛋白質(zhì)表達譜的雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜普遍用于蛋白質(zhì)表達譜的分析和鑒定分析和鑒定第二節(jié)第二節(jié) 生物信息學(xué)在預(yù)測基因生物信息學(xué)在預(yù)測基因功能中的應(yīng)用功能中的應(yīng)用 Bioinformatics Application in Predicting Gene Function一、利用生物信息學(xué)方法進行基因功能注一、利用生物信息學(xué)方法進行基因功能注釋

28、釋(一）通過序列比對預(yù)測基因功能一）通過序列比對預(yù)測基因功能 序列比對是生物信息學(xué)最基本的分析技術(shù)之一，最常用的方序列比對是生物信息學(xué)最基本的分析技術(shù)之一，最常用的方法是將目的法是將目的DNA或蛋白質(zhì)序列與已知的或蛋白質(zhì)序列與已知的DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比對，搜索到與目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白質(zhì)，用行比對，搜索到與目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白質(zhì)，用這些基因和蛋白質(zhì)預(yù)測目的基因和蛋白質(zhì)的功能。局部比對搜索工具這些基因和蛋白質(zhì)預(yù)測目的基因和蛋白質(zhì)的功能。局部比對搜索工具BLAST是進行序列比對的基本工具，它允許用戶選擇一條查詢是進行序列比對的基本工具

29、，它允許用戶選擇一條查詢序列與一個數(shù)據(jù)庫進行比對，找到數(shù)據(jù)庫中與輸入的查詢序列序列與一個數(shù)據(jù)庫進行比對，找到數(shù)據(jù)庫中與輸入的查詢序列相匹配的項。相匹配的項。BLAST是一個序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族，其中包括許是一個序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族，其中包括許多有特定用途的程序。多有特定用途的程序。 程序程序查詢序列查詢序列類型類型數(shù)據(jù)庫類型數(shù)據(jù)庫類型注注BLASTNDNADNABLASTP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)BLASTXDNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)將待搜索的核酸序列按將待搜索的核酸序列按6個閱讀框翻譯成蛋白個閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列比對質(zhì)序列，然后與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列比對TBLAST

30、N蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNA將數(shù)據(jù)庫中的核酸序列按將數(shù)據(jù)庫中的核酸序列按6個閱讀框翻譯成蛋個閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后與待搜索的蛋白質(zhì)序列比對白質(zhì)序列，然后與待搜索的蛋白質(zhì)序列比對TBLASTXDNADNA無論是待搜索的核酸序列還是數(shù)據(jù)庫中的核無論是待搜索的核酸序列還是數(shù)據(jù)庫中的核酸序列都按酸序列都按6個閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然個閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后比對后比對BLAST序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族（二）利用生物信息學(xué)方法分析基因芯片數(shù)據(jù)（二）利用生物信息學(xué)方法分析基因芯片數(shù)據(jù)最常用的方法有：最常用的方法有：差異表達分析（又稱基因表達差異分析）差異表達分析（又稱基因表達差異分

31、析）聚類分析聚類分析差異表達分析的目的：差異表達分析的目的： 識別兩個條件下表達差異顯著的基因，即一個基因在兩個條識別兩個條件下表達差異顯著的基因，即一個基因在兩個條件中的表達水平，在排除各種偏差后，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義件中的表達水平，在排除各種偏差后，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義1. 1. 倍數(shù)分析：計算每個基因在兩個條件下的表達比值；倍數(shù)分析：計算每個基因在兩個條件下的表達比值；2. 2. 統(tǒng)計分析中的統(tǒng)計分析中的t t檢驗和方差分析：通過計算表達差異的置信度來檢驗和方差分析：通過計算表達差異的置信度來分析差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義；分析差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義；3. 3. 建模的方法：通過確定兩個條件

32、下的模型參數(shù)是否相同來建模的方法：通過確定兩個條件下的模型參數(shù)是否相同來判斷表達差異的顯著性。判斷表達差異的顯著性。差異表達分析常用的分析方法有差異表達分析常用的分析方法有3類：類：聚類分析所依據(jù)的基本假設(shè)：聚類分析所依據(jù)的基本假設(shè)： 若組內(nèi)基因具有相似的表達模式，則它們可能具有相似的若組內(nèi)基因具有相似的表達模式，則它們可能具有相似的功能，例如受共同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因，或者產(chǎn)物構(gòu)成同一功能，例如受共同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因，或者產(chǎn)物構(gòu)成同一個蛋白復(fù)合體的基因，或者參與相同調(diào)控路徑的基因。個蛋白復(fù)合體的基因，或者參與相同調(diào)控路徑的基因。 在具體應(yīng)用中可按照相似的表達譜對基因進行聚類，從而在具體應(yīng)

33、用中可按照相似的表達譜對基因進行聚類，從而預(yù)測組內(nèi)未知基因的功能。預(yù)測組內(nèi)未知基因的功能。 目前已經(jīng)有很多種聚類的方法應(yīng)用到基因芯片的研究當(dāng)目前已經(jīng)有很多種聚類的方法應(yīng)用到基因芯片的研究當(dāng)中，如層次聚類中，如層次聚類(Hierarchical clustering)、K 均值聚類均值聚類(K-means clustering)、自組織映射、自組織映射(self organizing map)、PCA (principlecomponet analysis)等。等。 在氨基酸序列整體同源性不明顯的情況下，對蛋白質(zhì)在氨基酸序列整體同源性不明顯的情況下，對蛋白質(zhì)的功能域進行分析將對預(yù)測基因功能提供極

34、其有價值的信的功能域進行分析將對預(yù)測基因功能提供極其有價值的信息。目前已通過多序列比對將蛋白質(zhì)的同源序列收集在一息。目前已通過多序列比對將蛋白質(zhì)的同源序列收集在一起，確定了大量蘊藏于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的保守區(qū)域或序列，起，確定了大量蘊藏于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的保守區(qū)域或序列，如結(jié)構(gòu)域（如結(jié)構(gòu)域（domain）和模體（）和模體（motif），這些共享結(jié)構(gòu)域），這些共享結(jié)構(gòu)域和保守模體通常與特定的生物學(xué)活性相關(guān)，反映了蛋白和保守模體通常與特定的生物學(xué)活性相關(guān)，反映了蛋白質(zhì)分子的一些重要功能。質(zhì)分子的一些重要功能。 （三）通過生物信息學(xué)方法分析蛋白質(zhì)（三）通過生物信息學(xué)方法分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來預(yù)測蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)來預(yù)測

35、蛋白質(zhì)功能運用蛋白質(zhì)序列模體搜索工具預(yù)測蛋白質(zhì)功能的方法是：運用蛋白質(zhì)序列模體搜索工具預(yù)測蛋白質(zhì)功能的方法是：首先收集現(xiàn)有的蛋白質(zhì)家族，構(gòu)造模體數(shù)據(jù)庫；首先收集現(xiàn)有的蛋白質(zhì)家族，構(gòu)造模體數(shù)據(jù)庫； 而后通過搜索該數(shù)據(jù)庫確定查詢序列是否具有可能的序而后通過搜索該數(shù)據(jù)庫確定查詢序列是否具有可能的序 列模體，列模體，判斷該序列是否屬于一個已知的蛋白質(zhì)家族；判斷該序列是否屬于一個已知的蛋白質(zhì)家族；然后根據(jù)該蛋白質(zhì)家族的已知功能預(yù)測未知蛋白質(zhì)的功能。然后根據(jù)該蛋白質(zhì)家族的已知功能預(yù)測未知蛋白質(zhì)的功能。 常用的模體數(shù)據(jù)庫有常用的模體數(shù)據(jù)庫有INTERPROSCAN、PROSITE、SMART等。等?；蚪M功

36、能注釋常用數(shù)據(jù)庫基因組功能注釋常用數(shù)據(jù)庫 現(xiàn)在人們已經(jīng)越來越清楚地認(rèn)識到，生物功能大多不是現(xiàn)在人們已經(jīng)越來越清楚地認(rèn)識到，生物功能大多不是只由一個或幾個基因控制的，而是通過生物體內(nèi)眾多的分子只由一個或幾個基因控制的，而是通過生物體內(nèi)眾多的分子（如（如DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)）共同構(gòu)成的、蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)）共同構(gòu)成的復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的。當(dāng)前生物學(xué)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一就復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的。當(dāng)前生物學(xué)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一就是，了解生物體內(nèi)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及它們的動態(tài)特是，了解生物體內(nèi)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及它們的動態(tài)特征。要想全面系統(tǒng)地解析這些復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)需要大量相征

37、。要想全面系統(tǒng)地解析這些復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)需要大量相關(guān)數(shù)據(jù)的積累，現(xiàn)代基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等大規(guī)模數(shù)據(jù)關(guān)數(shù)據(jù)的積累，現(xiàn)代基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等大規(guī)模數(shù)據(jù)采集技術(shù)大大加快了這一進程。目前人們已經(jīng)利用生物技采集技術(shù)大大加快了這一進程。目前人們已經(jīng)利用生物技術(shù)和信息技術(shù)建立了各種生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站，可為研術(shù)和信息技術(shù)建立了各種生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站，可為研究者提供基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑、蛋白質(zhì)相互作究者提供基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑、蛋白質(zhì)相互作用等方面的信息。用等方面的信息。二、利用生物網(wǎng)絡(luò)全面系統(tǒng)地了解二、利用生物網(wǎng)絡(luò)全面系統(tǒng)地了解基因的功能基因的功能 生物體任何細(xì)胞的遺傳信息、基因都是相同

38、的，但同生物體任何細(xì)胞的遺傳信息、基因都是相同的，但同一個基因在不同組織、不同細(xì)胞中的表達卻不相同。一個一個基因在不同組織、不同細(xì)胞中的表達卻不相同。一個基因的表達既影響其他的基因，又受其他基因的影響，基基因的表達既影響其他的基因，又受其他基因的影響，基因之間相互促進、相互抑制，構(gòu)成一個復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)因之間相互促進、相互抑制，構(gòu)成一個復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。絡(luò)。 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究就是：利用生物芯片等高通量技基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究就是：利用生物芯片等高通量技術(shù)所產(chǎn)生的大量基因表達譜數(shù)據(jù)，以及蛋白質(zhì)術(shù)所產(chǎn)生的大量基因表達譜數(shù)據(jù)，以及蛋白質(zhì)-DNA-DNA間間的相互作用等信息，結(jié)合實驗室研究結(jié)果，用生物信息

39、學(xué)方的相互作用等信息，結(jié)合實驗室研究結(jié)果，用生物信息學(xué)方法構(gòu)建基因調(diào)控模型，對某一物種或組織的基因表達關(guān)系進法構(gòu)建基因調(diào)控模型，對某一物種或組織的基因表達關(guān)系進行整體性研究，從而推斷基因之間的調(diào)控關(guān)系，揭示支配基行整體性研究，從而推斷基因之間的調(diào)控關(guān)系，揭示支配基因表達和功能的基本規(guī)律。因表達和功能的基本規(guī)律。 （一）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究基因調(diào)控（一）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究基因調(diào)控常用基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控數(shù)據(jù)庫常用基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控數(shù)據(jù)庫 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是生物系統(tǒng)的重要生命活動過程，機體通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是生物系統(tǒng)的重要生命活動過程，機體通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中分子之間的相互識別、聯(lián)絡(luò)和相互作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中分子之間的相互識別、聯(lián)絡(luò)和

40、相互作用, , 實實現(xiàn)整體功能上的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。由于細(xì)胞內(nèi)各種信號通路之現(xiàn)整體功能上的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。由于細(xì)胞內(nèi)各種信號通路之間存在著緊密的聯(lián)系和交叉調(diào)控間存在著緊密的聯(lián)系和交叉調(diào)控, , 形成了非常復(fù)雜的信號形成了非常復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究的目的是期望通過建立細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究的目的是期望通過建立細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程的模型，找出參與此過程的各個蛋白質(zhì)間的信號傳導(dǎo)過程的模型，找出參與此過程的各個蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，闡明其在基因調(diào)控、疾病發(fā)生中的作用。相互作用關(guān)系，闡明其在基因調(diào)控、疾病發(fā)生中的作用。 生物信息學(xué)方法利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識進行通生物信息學(xué)方法利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)

41、知識進行通路推斷路推斷, , 可以幫助闡釋信號分子作用機制可以幫助闡釋信號分子作用機制, , 輔助實驗設(shè)計輔助實驗設(shè)計, , 節(jié)節(jié)省大量的人力物力。有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫資源較省大量的人力物力。有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫資源較多多 。 （二）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（二）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)常用信號通路數(shù)據(jù)庫常用信號通路數(shù)據(jù)庫 代謝網(wǎng)絡(luò)處于生物體的功能執(zhí)行階段，其結(jié)構(gòu)組成方代謝網(wǎng)絡(luò)處于生物體的功能執(zhí)行階段，其結(jié)構(gòu)組成方式反映了生物體的功能構(gòu)成。代謝網(wǎng)絡(luò)把細(xì)胞內(nèi)所有生化式反映了生物體的功能構(gòu)成。代謝網(wǎng)絡(luò)把細(xì)胞內(nèi)所有生化反應(yīng)表示為網(wǎng)絡(luò)形式，反映了代謝活動中所有化合物及酶反應(yīng)表示為網(wǎng)絡(luò)形

42、式，反映了代謝活動中所有化合物及酶之間的相互作用。之間的相互作用。 通過基因組注釋信息可以識別出編碼催化生物體內(nèi)生化反通過基因組注釋信息可以識別出編碼催化生物體內(nèi)生化反應(yīng)的酶的基因應(yīng)的酶的基因, ,結(jié)合相關(guān)的酶反應(yīng)數(shù)據(jù)庫就可以預(yù)測物種結(jié)合相關(guān)的酶反應(yīng)數(shù)據(jù)庫就可以預(yù)測物種特異的酶基因、酶以及酶催化反應(yīng)，由此產(chǎn)生了許多優(yōu)特異的酶基因、酶以及酶催化反應(yīng)，由此產(chǎn)生了許多優(yōu)秀的代謝數(shù)據(jù)庫秀的代謝數(shù)據(jù)庫, ,可以方便地檢索某一生物代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝可以方便地檢索某一生物代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝反應(yīng)。反應(yīng)。 （三）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究代謝途徑（三）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究代謝途徑常用代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫常用代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（四）利用生物

43、網(wǎng)絡(luò)研究蛋白質(zhì)相互作用（四）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究蛋白質(zhì)相互作用 從某種程度上可以說，細(xì)胞進行的生命活動，是蛋白從某種程度上可以說，細(xì)胞進行的生命活動，是蛋白質(zhì)在一定條件下相互作用的結(jié)果，若蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)質(zhì)在一定條件下相互作用的結(jié)果，若蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)被破壞或穩(wěn)定性丟失，會引起細(xì)胞的功能性障礙。闡明蛋被破壞或穩(wěn)定性丟失，會引起細(xì)胞的功能性障礙。闡明蛋白質(zhì)相互作用的完整網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于從系統(tǒng)的角度加深白質(zhì)相互作用的完整網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于從系統(tǒng)的角度加深對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識。對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識。 近年來各種預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的計算方法被不斷提近年來各種預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的計算方法被不斷提出，將

44、這些方法與實驗方法結(jié)合，挖掘出了蛋白質(zhì)相互作出，將這些方法與實驗方法結(jié)合，挖掘出了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中更多的相互作用節(jié)點，目前已有多個蛋白質(zhì)相互用網(wǎng)絡(luò)中更多的相互作用節(jié)點，目前已有多個蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫應(yīng)運而生，可用來研究蛋白質(zhì)相互作用的生作用的數(shù)據(jù)庫應(yīng)運而生，可用來研究蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)過程物學(xué)過程 。常用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫常用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫三、復(fù)雜疾病的生物信息學(xué)研究策略三、復(fù)雜疾病的生物信息學(xué)研究策略 包括信息提取、分析和建模包括信息提取、分析和建模 癌癥、糖尿病、高血壓等復(fù)雜疾病對人類健康影響巨大，這癌癥、糖尿病、高血壓等復(fù)雜疾病對人類健康影響巨大，這類疾病的發(fā)病機制一

45、般與多種遺傳或非遺傳因素，以及它們之間類疾病的發(fā)病機制一般與多種遺傳或非遺傳因素，以及它們之間的相互作用有關(guān)，不能通過單基因、單通路、單層次的變化解釋。的相互作用有關(guān)，不能通過單基因、單通路、單層次的變化解釋。 以系統(tǒng)的觀點解釋復(fù)雜疾病中遺傳與環(huán)境的關(guān)系、描以系統(tǒng)的觀點解釋復(fù)雜疾病中遺傳與環(huán)境的關(guān)系、描述復(fù)雜疾病中基因的特征、分析疾病基因型與表現(xiàn)型之間述復(fù)雜疾病中基因的特征、分析疾病基因型與表現(xiàn)型之間的關(guān)系，已成為生物信息學(xué)研究復(fù)雜疾病的基本觀點，針的關(guān)系，已成為生物信息學(xué)研究復(fù)雜疾病的基本觀點，針對復(fù)雜疾病的研究模式，也開始從傳統(tǒng)的對復(fù)雜疾病的研究模式，也開始從傳統(tǒng)的“序列序列結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)功能功

46、能”向向“相互作用相互作用網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)功能功能”轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)變。疾病的基因組合及相互作用信息的提?。杭磳?fù)雜疾病相關(guān)靶基因疾病的基因組合及相互作用信息的提?。杭磳?fù)雜疾病相關(guān)靶基因的識別，以及利用的識別，以及利用SNPsSNPs、基因、蛋白質(zhì)等不同類型的信息，構(gòu)建疾病、基因、蛋白質(zhì)等不同類型的信息，構(gòu)建疾病驅(qū)使相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)。驅(qū)使相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)。生物信息分析及多層次信息的融合：即從不同層次對疾病的遺生物信息分析及多層次信息的融合：即從不同層次對疾病的遺傳復(fù)雜性進行分析，對不同遺傳網(wǎng)絡(luò)間的映射算法進行研究，傳復(fù)雜性進行分析，對不同遺傳網(wǎng)絡(luò)間的映射算法進行研究，進而將進而將SNPsSNPs、基因、蛋白質(zhì)等不同

47、水平的信息進行融合。、基因、蛋白質(zhì)等不同水平的信息進行融合。分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建模：即綜合生理病理相關(guān)的基因、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建模：即綜合生理病理相關(guān)的基因、SNPsSNPs、基因表達狀、基因表達狀況，蛋白質(zhì)功能狀態(tài)以及臨床治療等信息，以系統(tǒng)的方法將不同的況，蛋白質(zhì)功能狀態(tài)以及臨床治療等信息，以系統(tǒng)的方法將不同的測量數(shù)據(jù)、各種因素的辨識、各個層次上的相互作用關(guān)系進行整合，測量數(shù)據(jù)、各種因素的辨識、各個層次上的相互作用關(guān)系進行整合，建立數(shù)學(xué)模型，深入了解疾病過程、揭示復(fù)雜疾病的發(fā)病機制。建立數(shù)學(xué)模型，深入了解疾病過程、揭示復(fù)雜疾病的發(fā)病機制。復(fù)雜疾病的基本研究策略復(fù)雜疾病的基本研究策略第三節(jié)第三節(jié) 基因的

48、生物學(xué)功能鑒定技術(shù)基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)Methods for Identifying Biological Functions of Genes 目前在已知的目前在已知的2.52.5萬萬3 3萬個人類基因中，大約萬個人類基因中，大約70%70%的基因我們還不清楚的基因我們還不清楚它們的功能，有它們的功能，有90%90%的基因我們不知道它們在體內(nèi)的確切生理作用，因的基因我們不知道它們在體內(nèi)的確切生理作用，因此，利用各種技術(shù)手段研究基因組中功能未知基因的作用，將是此，利用各種技術(shù)手段研究基因組中功能未知基因的作用，將是“后基因后基因組時代組時代”功能基因組學(xué)研究的主要內(nèi)容。功能基因組學(xué)研究的主

49、要內(nèi)容。 生物信息學(xué)利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識進行合理推斷生物信息學(xué)利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識進行合理推斷, , 可以節(jié)省大量的人力物可以節(jié)省大量的人力物力，但基因功能的鑒定最終仍需要通過實驗來驗證。力，但基因功能的鑒定最終仍需要通過實驗來驗證。通常采用基因功能獲得和通常采用基因功能獲得和/ /或基因功能缺失的策略，觀察基因在細(xì)胞或或基因功能缺失的策略，觀察基因在細(xì)胞或生物個體中的，細(xì)胞生物學(xué)行為或個體表型遺傳性狀的變化，來鑒定基因生物個體中的，細(xì)胞生物學(xué)行為或個體表型遺傳性狀的變化，來鑒定基因的功能。此外，基于正向遺傳學(xué)的隨機突變篩選技術(shù)也成為揭示基因功能的功能。此外，基于正向遺傳學(xué)的隨機突變篩

50、選技術(shù)也成為揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必須在完整的生物個體及其生命過程中才能的重要手段。由于基因的功能必須在完整的生物個體及其生命過程中才能得到完整的體現(xiàn)，因此從整體水平研究基因的功能是必然的選擇。得到完整的體現(xiàn)，因此從整體水平研究基因的功能是必然的選擇?；蚬δ塬@得策略即通過將目的基因直接導(dǎo)入某一細(xì)胞基因功能獲得策略即通過將目的基因直接導(dǎo)入某一細(xì)胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達，通過細(xì)胞或個或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達，通過細(xì)胞或個體生物性狀的變化來研究基因的功能。常用的方法有轉(zhuǎn)基因體生物性狀的變化來研究基因的功能。常用的方法有轉(zhuǎn)基因和基因敲入技術(shù)等。和基因敲入

51、技術(shù)等。一、采用功能獲得策略鑒定基因的功能一、采用功能獲得策略鑒定基因的功能 轉(zhuǎn)基因技術(shù)（轉(zhuǎn)基因技術(shù)（transgenic technology）是指將外源基因?qū)胧侵笇⑼庠椿驅(qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞中，通過隨機重組使外源基因插入細(xì)胞染受精卵或胚胎干細(xì)胞中，通過隨機重組使外源基因插入細(xì)胞染色體色體DNA，再將受精卵或胚胎干細(xì)胞植入受體動物的子宮，再將受精卵或胚胎干細(xì)胞植入受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細(xì)胞分裂遺傳給后代。使得外源基因能夠隨細(xì)胞分裂遺傳給后代。（一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能（一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能 轉(zhuǎn)基因動物（轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基

52、因技術(shù)培是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物。育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物。 其基本制作過程包括：轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建，外源基因的其基本制作過程包括：轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建，外源基因的導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因動物的獲得和鑒定，轉(zhuǎn)基因動物品系的建立以及外導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因動物的獲得和鑒定，轉(zhuǎn)基因動物品系的建立以及外源基因表達的鑒定。源基因表達的鑒定。1. 1. 轉(zhuǎn)基因動物可在整體水平研究基因的功能轉(zhuǎn)基因動物可在整體水平研究基因的功能轉(zhuǎn)基因動物制作原理示意圖轉(zhuǎn)基因動物制作原理示意圖優(yōu)點：優(yōu)點：1. 利用轉(zhuǎn)基因動物模型研究外源基因，能夠接近真實地再現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因動物模型研究外源基因，能夠接

53、近真實地再現(xiàn)基因表達所導(dǎo)致的結(jié)果，及其在整體水平的調(diào)控規(guī)律，把基因表達所導(dǎo)致的結(jié)果，及其在整體水平的調(diào)控規(guī)律，把復(fù)雜的系統(tǒng)簡單化，具有系統(tǒng)性和獨立性，是目前層次最復(fù)雜的系統(tǒng)簡單化，具有系統(tǒng)性和獨立性，是目前層次最高的實驗體系。高的實驗體系。2. 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的疾病動物模型具有遺傳背景清楚、利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的疾病動物模型具有遺傳背景清楚、遺傳物質(zhì)改變簡單、更自然更接近疾病的真實癥狀等優(yōu)遺傳物質(zhì)改變簡單、更自然更接近疾病的真實癥狀等優(yōu)點。點。但轉(zhuǎn)基因動物模型仍存在一些亟待解決的問題：但轉(zhuǎn)基因動物模型仍存在一些亟待解決的問題：1. 外源基因插入宿主基因組是隨機的，可能產(chǎn)生插入突變，破外源基因

54、插入宿主基因組是隨機的，可能產(chǎn)生插入突變，破壞宿主基因組功能；壞宿主基因組功能；2. 外源基因在宿主染色體上整合的拷貝數(shù)不等；外源基因在宿主染色體上整合的拷貝數(shù)不等；3. 整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺傳等。傳等。 雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身仍存在一些問題，但其在醫(yī)學(xué)研究中的雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身仍存在一些問題，但其在醫(yī)學(xué)研究中的重要地位是毋庸置疑的，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，其在醫(yī)學(xué)重要地位是毋庸置疑的，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，其在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域必將有更加廣泛的應(yīng)用。及生物學(xué)領(lǐng)域必將有更加廣泛的應(yīng)用。目前，科學(xué)家已經(jīng)采取了多種

55、方法使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加完善：目前，科學(xué)家已經(jīng)采取了多種方法使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加完善： 為了更為精確地調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達，使其獲得時空特異性的調(diào)為了更為精確地調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達，使其獲得時空特異性的調(diào)控，在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達載體時，選擇只在特定的細(xì)胞類型或特定的生控，在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達載體時，選擇只在特定的細(xì)胞類型或特定的生命時期才啟動基因表達的啟動子，即可使外源基因獲得時空特異性的命時期才啟動基因表達的啟動子，即可使外源基因獲得時空特異性的表達。表達?？烧{(diào)控的基因表達系統(tǒng)也是一種常用的方法：可調(diào)控的基因表達系統(tǒng)也是一種常用的方法： 例如四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)可使轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)外源例如四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)，該表達

56、系統(tǒng)可使轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)外源基因的表達受誘導(dǎo)劑（四環(huán)素）的調(diào)控，通過加入或去除誘導(dǎo)劑，基因的表達受誘導(dǎo)劑（四環(huán)素）的調(diào)控，通過加入或去除誘導(dǎo)劑，就可以實現(xiàn)對外源基因表達時間及水平的控制。就可以實現(xiàn)對外源基因表達時間及水平的控制。2. 2. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不斷完善轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不斷完善當(dāng)前轉(zhuǎn)基因動物所涉及的轉(zhuǎn)基因片段長度大多在幾十個當(dāng)前轉(zhuǎn)基因動物所涉及的轉(zhuǎn)基因片段長度大多在幾十個kbkb以以下，但是，隨著科學(xué)研究需要進行大片段下，但是，隨著科學(xué)研究需要進行大片段DNADNA、多基因或基因簇、多基因或基因簇的轉(zhuǎn)基因。的轉(zhuǎn)基因?？寺〈笃慰寺〈笃蜠NADNA常應(yīng)用酵母人工染色體常應(yīng)用酵母人工染色體(YA

57、C)(YAC)、細(xì)菌人工染色體、細(xì)菌人工染色體(BAC)(BAC)等，可獲得等，可獲得200kb200kb以上的大以上的大DNADNA片段，能攜帶包含完整的片段，能攜帶包含完整的基因或多個基因，以及基因的所有外顯子，和附近的染色體調(diào)控基因或多個基因，以及基因的所有外顯子，和附近的染色體調(diào)控區(qū)，為目的基因提供與其在正常染色體上一致的環(huán)境，保證了轉(zhuǎn)區(qū)，為目的基因提供與其在正常染色體上一致的環(huán)境，保證了轉(zhuǎn)基因在正常細(xì)胞中的時空表達?；蛟谡＜?xì)胞中的時空表達。（二）基因敲入可以實現(xiàn)基因的定向插入（二）基因敲入可以實現(xiàn)基因的定向插入 基因敲入基因敲入( gene knock-in)是通過同源重組的方法

58、，用某是通過同源重組的方法，用某一基因替換另一基因一基因替換另一基因, 或?qū)⒁粋€設(shè)計好的基因片段插入到基因或?qū)⒁粋€設(shè)計好的基因片段插入到基因組的特定位點，使之表達并發(fā)揮作用。通過基因敲入，可以研組的特定位點，使之表達并發(fā)揮作用。通過基因敲入，可以研究特定基因在體內(nèi)的功能；也可以與之前基因的功能進行比較；究特定基因在體內(nèi)的功能；也可以與之前基因的功能進行比較；或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到靶向基因治療或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到靶向基因治療的目的。的目的。基因敲入是基因打靶技術(shù)的一種，基因打靶技術(shù)是基因敲入是基因打靶技術(shù)的一種，基因打靶技術(shù)是2020世紀(jì)世紀(jì)8080年代

59、后半期發(fā)展起來的，一種按預(yù)期方式準(zhǔn)確年代后半期發(fā)展起來的，一種按預(yù)期方式準(zhǔn)確改造生物遺傳信息的實驗手段。改造生物遺傳信息的實驗手段。該技術(shù)的巧妙之處在于把胚胎干細(xì)胞技術(shù)和該技術(shù)的巧妙之處在于把胚胎干細(xì)胞技術(shù)和DNADNA同源重同源重組技術(shù)組技術(shù)“結(jié)合結(jié)合”起來，實現(xiàn)對染色體上某一基因的定向起來，實現(xiàn)對染色體上某一基因的定向修飾和改造，從而深入地了解基因的功能。修飾和改造，從而深入地了解基因的功能。除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點突變、除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點突變、缺失突變、染色體組大片段刪除等。缺失突變、染色體組大片段刪除等?；虼虬械脑砗突静襟E基因打靶的原理和基本

60、步驟1. 1. 首先首先, , 從小鼠囊胚分離出未分化的胚胎干細(xì)胞從小鼠囊胚分離出未分化的胚胎干細(xì)胞, , 然后利用細(xì)胞內(nèi)然后利用細(xì)胞內(nèi)的染色體的染色體DNADNA可以與導(dǎo)入細(xì)胞的外源可以與導(dǎo)入細(xì)胞的外源DNADNA，在相同序列的區(qū)，在相同序列的區(qū)域內(nèi)發(fā)生同源重組的原理，用含有正域內(nèi)發(fā)生同源重組的原理，用含有正- -負(fù)篩選標(biāo)記的打靶載體，負(fù)篩選標(biāo)記的打靶載體，對胚胎干細(xì)胞中的特定基因?qū)嵤ε咛ジ杉?xì)胞中的特定基因?qū)嵤按虬写虬小保?. 2. 之后將之后將“中靶中靶”的胚胎干細(xì)胞移植回小鼠囊胚的胚胎干細(xì)胞移植回小鼠囊胚( ( 受精卵分裂至受精卵分裂至8 8個細(xì)胞左右即為囊胚個細(xì)胞左右即為囊胚, ,