分子生物學(xué)核心筆記

1、第一章第八章基因genes：基因是負責編碼RNA或一條多肽鏈DNA片段，包括編碼序列、編碼序列外的側(cè)翼序列及插入序列。是決定遺傳性狀的功能單位。結(jié)構(gòu)基因structure genes：基因中編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列稱為結(jié)構(gòu)基因?；蚪Mgenome：一個細胞或病毒的全部遺傳信息。（細胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。）真核生物基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）和線粒體DNA的全部序列，包括編碼序列和非編碼序列。GT-AG法則：真核生物基因的外顯子與內(nèi)含子接頭處都有一段高度保守的一致性序列，即：內(nèi)含子5端大多數(shù)是以GT開始，3端大多是以AG結(jié)束。端粒：以線性染色體形式存

2、在的真核基因組DNA末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒。該結(jié)構(gòu)是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，僅在真核細胞染色體末端存在。端粒DNA由重復(fù)序列組成，人類端粒一端是TTAGGG另一端是AATCCC.操縱子：是指數(shù)個功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動子和操縱基因）以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號所構(gòu)成的基因表達單位。所轉(zhuǎn)錄的RNA為多順反子。操縱元件：是一段能夠被不同基因表達調(diào)控蛋白質(zhì)識別和結(jié)合的DNA序列，是決定基因表達效率的關(guān)鍵元件。順式作用元件：是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的特異DNA序列。包括啟動子、上游啟動子元件、增強

3、子、反應(yīng)元件和poly(A)加尾信號。反式作用因子：是指真核細胞內(nèi)含有的大量可以通過直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。啟動子：是能夠被RNA聚合酶特異性識別并與其結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。（TATAbox、CAATbox、GCbox）增強子enhancer：是一段短的DNA序列，其中含有多個作用元件，可以特異性地與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強基因的轉(zhuǎn)錄活性。它可位于被增強的轉(zhuǎn)錄基因的上游或下游，也可相距靶基因較遠。多順反子mRNA(polycistronic mRNA)即每一個mRNA分子帶有幾鐘蛋白質(zhì)的遺傳信息（來自幾個結(jié)構(gòu)基因），利用共同的啟動子及終止信號，組成“操縱子”的

4、基因表達調(diào)控單元。病毒基因組的特點：一、：種類單一；病毒的核酸通常是DNA分子或者是RNA分子。二：RNA病毒基因組有單、雙鏈和正、負鏈之分。根據(jù)是否可以作為mRNA模板，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，分成正鏈RNA病毒和負鏈RNA病毒兩大類。1、單股正鏈RNA病毒基因組可以作為mRNA行使模板功能：病毒顆粒中的RNA進入宿主細胞后，可直接作為mRNA，翻譯出所編碼的蛋白質(zhì)，包括衣殼蛋白和病毒的RNA聚合酶。然后再病毒RNA聚合酶的作用下以病毒基因組RNA為模板合成出負鏈，在以負鏈為模板復(fù)制病毒RNA，并以復(fù)制的病毒RNA和衣殼蛋白自我裝配成為成熟的病毒顆粒。這些病毒稱為單股正鏈RNA病毒。2單股負鏈RNA

5、病毒需要先合成與其互補的MRNA：先以病毒基因組RNA為模板轉(zhuǎn)錄生成互補RNA，再以這個互補RNA作為mRNA翻譯出遺傳密碼所決定的蛋白質(zhì)。3、雙鏈RNA病毒基因組含有正、負兩條RNA鏈。4、部分RNA病毒基因組可以被反轉(zhuǎn)錄為DNA：有一類特殊的單股正鏈RNA病毒，即逆轉(zhuǎn)錄病毒，在這些病毒顆粒中帶有依賴RNA的DNA聚合酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶，能使RNA反向轉(zhuǎn)錄生成DNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組一般包括三個基本的結(jié)構(gòu)基因，即：gag,pol,env，分別編碼核心蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和膜蛋白。三、DNA病毒基因組有環(huán)狀DNA分子和線性DNA分子。四、其他：形式多樣、大小不一、基因重疊；、動物/細菌病毒與真核/原核基

6、因相似：內(nèi)含子；具有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因；基因編碼區(qū)無間隔：通過宿主及病毒本身酶切；無帽狀結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)基因沒有翻譯起始序列。原核基因組的特點：一、原核生物基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成；二、操縱子結(jié)構(gòu)是原核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點之一：原核生物的絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因按功能相關(guān)性成簇地串聯(lián)排列與染色體上，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動子和操縱基因）以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號構(gòu)成一個基因表達單位，即操縱子結(jié)構(gòu)。一個操縱子只含一個啟動序列和數(shù)個可轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因。在同一個啟動序列控制下，操縱子可轉(zhuǎn)錄出多順反子mRNA。三、基因密度非常高，基因組序列中編碼區(qū)所占的比例較大。可表達基因約50%，大于真核

7、生物小于病毒。重復(fù)序列很少。四、在原核生物基因組中的非編碼區(qū)內(nèi)主要是一些調(diào)控序列。五、基因一般是連續(xù)的，無內(nèi)含子；六、細菌基因組中的可移動成分能產(chǎn)生轉(zhuǎn)座現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座因子的類別和遺傳效應(yīng)：細菌基因組中的可移動成分能產(chǎn)生轉(zhuǎn)座現(xiàn)象。1、原核生物轉(zhuǎn)座因子可以分為：插入序列、轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體。2、轉(zhuǎn)座因子的幾個遺傳效應(yīng)。轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座不是本身的移動，而是由轉(zhuǎn)座因子復(fù)制出一個新的拷貝轉(zhuǎn)移到基因組中的新位置上去。新的轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)到靶點后，靶點序列會倍增為兩個靶點序列，并分別排列在轉(zhuǎn)座因子的兩側(cè)，形成同向重復(fù)序列。在轉(zhuǎn)座過程中能夠形成共同體。轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)座后能促使染色體畸變。轉(zhuǎn)座因子可以從原來的位置上切除，這個過

8、程成為切離。轉(zhuǎn)座可引起插入突變。給受體基因組增添了新的標志基因。真核基因組的特點：真核生物基因組遠大于原核生物基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，具有多個復(fù)制起點；基因組由染色體DNA和染色體外DNA組成。真核基因為單順反子，而細菌和病毒的結(jié)構(gòu)基因多為多順反子；基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū)；真核基因多為不連續(xù)的斷裂基因，由外顯子和內(nèi)含子鑲嵌而成；存在大量的重復(fù)序列；功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族；還存在一些假基因存在可移動的遺傳因素；體細胞為雙倍體，而精子和卵子為單倍體。轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn）這是一類長度在200020000bp之間較大的轉(zhuǎn)座因子，如Tn1681 Tn420.它們除了帶有

9、與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因以外，還帶有其他基因，如Tn903 Tn5帶有卡那霉素抗藥基因等。質(zhì)粒plasmid:是存在于細菌 染色體外的、具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。衛(wèi)星DNA：是出現(xiàn)在非編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)序列。其特點是具有固定的重復(fù)單位，該重復(fù)單位首尾相連形成重復(fù)序列片段，通常存在于間隔DNA和內(nèi)含子中。串聯(lián)重復(fù)序列是形成衛(wèi)星DNA的基礎(chǔ)。分類：大衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA?；匚慕Y(jié)構(gòu)：在DNA鏈上，兩個拷貝反向串聯(lián)在一起，中間沒有間隔序列。RFLP：即限制性片段長度多態(tài)性，個體之間DNA的核苷酸序列存在差異，稱為DNA多態(tài)性。由于堿基組成的變化而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點，從而導(dǎo)

10、致相應(yīng)的限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化，稱為RFLP。多基因家族multigene family：核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的基因，其編碼產(chǎn)物常具有相似的功能。假基因pseudogene與某些有功能的基因結(jié)構(gòu)相似，但不能表達基因產(chǎn)物的基因。引起DNA損傷的因素及機制：1、紫外線引起DNA損傷：形成胸腺嘧啶二聚體引起DNA之間的交聯(lián)、DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、甚至DNA鏈的斷裂。2、電力輻射引起DNA損傷：可導(dǎo)致堿基變化：由.OH自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等可導(dǎo)致脫氧核糖的變化：脫氧核糖分解，最后可引起DNA鏈斷裂?？蓪?dǎo)致DNA斷裂

11、：使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開。引起DNA鏈交聯(lián)：包括DNA-DNA鏈間鏈內(nèi)交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。3、烷化劑引起DNA損傷：烷化劑導(dǎo)致堿基烷基化烷化劑導(dǎo)致堿基脫落烷化劑導(dǎo)致DNA斷鏈烷化劑導(dǎo)致DNA鏈交聯(lián)4、堿基類似物、修飾劑引起堿基對的改變5、其他因素：丫啶類化合物引起堿基插入和堿基缺失；氧自由基。6、DNA也會產(chǎn)生自發(fā)性損傷：DNA復(fù)制時產(chǎn)生堿基錯配；DNA修復(fù)使產(chǎn)生堿基錯配；堿基自發(fā)改變導(dǎo)致DNA損傷：互變異構(gòu)位導(dǎo)致DNA突變；脫氨基作用導(dǎo)致DNA突變；堿基丟失導(dǎo)致DNA突變。DNA損傷（突變）可分為：鏈內(nèi)共價交聯(lián)、鏈間共價交聯(lián)、DNA鏈斷裂、堿基突變（轉(zhuǎn)換和顛換）、插入或缺失、D

12、NA重組等。DNA損傷修復(fù)機制：1、某些DNA損傷可以直接修復(fù)：DNA斷裂口可以直接修復(fù)；二聚體可被光復(fù)活酶直接修復(fù)；烷基化堿基可以直接修復(fù)。2、切除修復(fù)是細胞內(nèi)最普遍的修復(fù)方式：過程識別：DNA特異內(nèi)切酶或糖苷酶識別DNA損傷位點；切除：在損傷位點的5上游切斷DNA鏈，沿5-3方向逐步切除DNA損傷部分合成：DNA聚合酶在缺口處催化DNA合成并沿5-3方向延伸連接：在DNA連接酶的作用下，新合成的DNA片段與原來的DNA鏈連接。切除修復(fù)可分為單個核苷酸切除修復(fù)和核苷酸片段切除修復(fù)。3、重組修復(fù)是DNA損傷較多時的修復(fù)方式4、SOS修復(fù)是DNA損傷嚴重時的應(yīng)急性修復(fù)方式。5、細胞周期檢查點控制

13、是真核生物誘導(dǎo)修復(fù)的主要機制基因表達：是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，合成特定的蛋白質(zhì)，進而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過程。因子依賴性和非依賴性兩種機制介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的終止：1、不依賴因子的終止子有兩個重要特征：一個反向重復(fù)序列，使RNA末端形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)在信息鏈上有一連串的T，因而RNA末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)之后緊接著出現(xiàn)一串U，RNA/DNA雜交分子的rU-dA堿基對結(jié)合力較弱，當發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成時，RNA聚合酶停止移動，RNA鏈從DNA上脫落。2、有一些基因的RNA轉(zhuǎn)錄終止階段依賴因子。當RNA聚合酶移動至終止子部位時，因子與其結(jié)合，并發(fā)揮ATP酶和解鏈酶活

14、性，使RNA與DNA分離，轉(zhuǎn)錄過程終止。原核生物的tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工：1、剪切作用將多順反子初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分離并切除多余序列；2、有些tRNA分子在3端需要修復(fù)或添加CCA序列；3、通過某些堿基的化學(xué)修飾在tRNA分子中形成希有堿基。蛋白質(zhì)編碼區(qū)（開放閱讀框ORF）:在mRNA的核苷酸序列中，有一段序列是一個特定蛋白質(zhì)多肽鏈的序列信息，這一段核苷酸序列從起始密碼子開始、倒終止密碼子結(jié)束，稱為蛋白質(zhì)編碼區(qū)或開放閱讀框，此段核苷酸序列決定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。SD序列：mRNA起始密碼子AUG上游813個堿基處存在的一段特定的核苷酸序列，該序列稱為SD序列，是mRNA的起始密碼子之所以能與小亞基定位結(jié)

15、合的關(guān)鍵。SD序列與小亞基中16SrRNA3端的序列互補，當mRNA與小亞基結(jié)合時，SD序列與16SrRNA3端的互補序列配對結(jié)合，使起始密碼子定位于翻譯起始部位。真核生物mRNA的加工：1、甲基化鳥苷酸以5端磷酸基團連接mRNA5端形成帽子結(jié)構(gòu)。2、多聚腺苷酸的加入形成mRNA的3尾。3、mRNA前體經(jīng)剪接過程除去內(nèi)含子序列。4、mRNA分子中的少數(shù)堿基可被甲基化。5、RNA編輯：是通過對mRNA的加工使遺傳信息在mRNA水平上發(fā)生改變。時間特異性：在多細胞生物從受精卵到組織、器官形成的各個不同發(fā)育階段，相應(yīng)基因嚴格按照一定時間順序開啟或關(guān)閉，這就是基因表達的時間特異性?？臻g特異性：在個體生

16、長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)。分子伴侶（伴侶蛋白）：是一類序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的保守性蛋白，他們在細胞內(nèi)能協(xié)助其他多肽結(jié)構(gòu)完成正確的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運和降解。管家基因：在生物體生命的全過程都是必須的，且在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達的基因。原核生物轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：原核生物基因多以操縱子的形式存在。操縱子由調(diào)控區(qū)與信息區(qū)組成，上游是調(diào)控區(qū)，包括啟動子與操縱元件兩部分。啟動子是同RNA聚合酶結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的特異性DNA序列，操縱元件是特異的阻遏物結(jié)合區(qū)。1、啟動子決定轉(zhuǎn)錄方向、模板鏈、轉(zhuǎn)錄效率。2、不同的因子可以競爭結(jié)合RNA聚合酶，打開特定的一套基因。3、阻遏蛋

17、白在轉(zhuǎn)錄水平對基因表達具有負調(diào)控作用。4、正調(diào)控蛋白結(jié)合于特異DNA序列后促進基因的轉(zhuǎn)錄。5、到位蛋白通過DNA重組倒位而調(diào)節(jié)基因表達、6、RNA聚合酶抑制物可與RNA結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄。7、衰減子可以在轉(zhuǎn)錄過程中控制轉(zhuǎn)錄水平。嚴謹反應(yīng)：細菌在缺乏氨基酸的環(huán)境中，RNA聚合酶活性降低，RNA合成減少或停止。衰減子attenuator：細菌中的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯合成是偶聯(lián)在一起的。這一特點使細菌的一些操縱子中的特殊序列可以在轉(zhuǎn)錄過程中控制轉(zhuǎn)錄水平。這些特殊結(jié)構(gòu)稱為衰減子。衰減子又稱為弱化子，位于一些操縱子中第一個結(jié)構(gòu)基因之前，是一段能減弱轉(zhuǎn)錄作用的順序。乳糖操縱子的作用機制1、乳糖操縱子（la

18、c operon）的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱元件O，一個啟動子P和一個調(diào)節(jié)基因I（是調(diào)節(jié)基因，編碼產(chǎn)生阻遏蛋白）。2、阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時，I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，抑制RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導(dǎo)開放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機制為可誘導(dǎo)的負調(diào)控。3、CAP的正性調(diào)節(jié)：lac啟動子是弱啟動子，在啟動子上游有CAP結(jié)合位點，當大腸

19、桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時，cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使CAP發(fā)生變構(gòu)，CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動序列附近的CAP結(jié)合位點，激活RNA聚合酶活性，促進結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對乳糖操縱子實行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。CAP：是大腸桿菌分解代謝物基因活化蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號傳遞個許多操縱子，使細菌在缺乏葡萄糖時可以利用其他能源。CAP結(jié)合DNA是由cAMP控制的。cAMP結(jié)合于CAP，誘導(dǎo)CAP發(fā)生構(gòu)象改變，使之

20、能夠結(jié)合于特定的DNA序列，激活臨近基因的轉(zhuǎn)錄。cAMP水平降低時，cAMP與CAP解離，CAP轉(zhuǎn)回到無活性的構(gòu)象，并與DNA解離，這將關(guān)閉葡萄糖以外的其他的與糖代謝相關(guān)的操縱子。由于CAP的作用依賴于cAMP，因此，CAP又稱為cAMP受體蛋白。原核生物翻譯水平的調(diào)控：一、SD序列是影響翻譯的重要因素：1、SD序列的順序及位置影響翻譯起始效率。2、mRNA二級結(jié)構(gòu)可以屏蔽SD序列。二、mRNA的穩(wěn)定性（降解速度）是翻譯調(diào)控的另一重要機制。mRNA的5端與核糖體結(jié)合，可明顯提高其穩(wěn)定性。三、翻譯產(chǎn)物也可以對相應(yīng)的mRNA的翻譯進行調(diào)控：1、核糖體蛋白控制其mRNA的翻譯。2、翻譯終止因子RF2

21、調(diào)節(jié)自身的翻譯。四、小分子RNA可以抑制特定mRNA的翻譯?；蛑嘏牛褐改承┗蚱胃淖冊瓉泶嬖陧樞?，通過調(diào)整有關(guān)基因片段的銜接順序，再重排成為一個完整的轉(zhuǎn)錄單位。真核生物在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：主要是通過反式作用因子、順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來完成的，主要是反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過程。一、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成是轉(zhuǎn)錄的可調(diào)控環(huán)節(jié)：真核生物RNA聚合酶識別的是由通用轉(zhuǎn)錄因子與DNA形成的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，只有當一個或多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA上，形成有功能的啟動子，才能被RNA聚合酶所識別并結(jié)合。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過程為：TFD結(jié)合TATA盒；RNA聚合

22、酶識別并結(jié)合TFD-DNA復(fù)合物形成一個閉合的復(fù)合物；其他轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶結(jié)合形成一個開放復(fù)合物，開放轉(zhuǎn)錄。二、反式作用因子是真核細胞內(nèi)重要的基因表達調(diào)控蛋白。反式作用因子（trans-acting factor）：真核細胞內(nèi)含有的大量可以通過直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。在結(jié)構(gòu)上含有與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中，反式作用因子的作用是：促進或抑制TFD與TATA盒結(jié)合；促進或抑制RNA聚合酶與TFD-DNA復(fù)合物的結(jié)合；促進或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。反式作用因子三個基本特征一般具有三個功能域：DNA識別結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域和結(jié)合其他蛋白結(jié)合域；能識別

23、并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件；對基因的表達有正性或負性調(diào)控作用，激活和阻遏基因的表達。反式作用因子結(jié)構(gòu)域具有多種結(jié)構(gòu)模式：1、DNA結(jié)合域有不同的結(jié)構(gòu)模式：鋅指結(jié)構(gòu)借助半胱氨酸和組氨酸與鋅離子結(jié)合；同源結(jié)構(gòu)域具有螺旋回折螺旋結(jié)構(gòu)：許多反式作用因子結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域中具有一段相同的保守序列，是60個左右氨基酸組成的螺旋回折螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域，稱為同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain,HD）,簡稱同源域。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)使兩個單體結(jié)合并形成DNA結(jié)合域。螺旋-環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)易于形成二聚體堿性-螺旋含較多的堿性氨基酸。2、轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域是反式作用因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。其模型有：酸性-螺旋結(jié)構(gòu)。帶有負電荷的-螺旋

24、區(qū)。富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域存在于多種轉(zhuǎn)錄因子中。富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域 常與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連。三、轉(zhuǎn)錄起始是由多種激活的反式作用因子進行復(fù)合調(diào)控反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達式調(diào)節(jié)反式作用因子合成出來就具有活性；共價修飾磷酸化和去磷酸化，糖基化；配體結(jié)合許多激素受體是反式作用因子；蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物的解離與形成。反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合：反式作用因子被激活后，即可識別并結(jié)合上游啟動子元件和增強子中的保守性序列，對基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用。反式作用因子的作用方式成環(huán)、扭曲、滑動、Oozing。反式作用因子的組合式調(diào)控作用：每一種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮促進或抑

25、制作用，但反式作用因子對基因調(diào)控不是由單一因子完成的而是幾種因子組合發(fā)揮特定的作用。真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機制mRNA的加工和運輸可形成轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控：5端加帽和3端多聚腺苷酸化的調(diào)控意義：5端加帽和3端多聚腺苷酸化是保持mRNA穩(wěn)定的一個重要因素，它至少保證mRNA在轉(zhuǎn)錄過程中不被降解。mRNA選擇性剪接對基因表達調(diào)控的作用mRNA運輸?shù)目刂普{(diào)節(jié)進入細胞質(zhì)的mRNA量。第九章 細胞信號傳導(dǎo)信息分子：攜帶生物信息，在細胞之間進行傳遞的小分子化學(xué)物質(zhì)受體：靶細胞中能夠被體內(nèi)一些生物活性物質(zhì)如激素、細胞因子所識別，并與之結(jié)合將信號傳至細胞內(nèi)產(chǎn)生生物效應(yīng)的物質(zhì)，也即細胞接受細胞外信號的接收裝置，

26、直接參與細胞的信息傳遞。受體的化學(xué)性質(zhì)主要為蛋白質(zhì)。受體的作用：1、識別外源性信息分子，與受體相對應(yīng)，信息分子亦可以稱為配體；2、將配體的信號進行轉(zhuǎn)換，使之稱為細胞內(nèi)分子可以識別的信號，并傳遞到其他分子，引起細胞的應(yīng)答。受體與信息分子的結(jié)合特點：高度親和力、高度特異性、可逆行、可飽和性、放大效應(yīng)。受體的分類：1、細胞表面受體：水溶性、表面信號分子：離子通道受體、G蛋白偶聯(lián)受體、單次跨膜受體。2、細胞內(nèi)受體：脂溶性化學(xué)信號?？梢晕挥诩毎|(zhì)也可以位于細胞核內(nèi)。蛋白激酶（protein kinase）：能夠?qū)?磷酸基團從磷酸供體分子上轉(zhuǎn)移至底物蛋白的氨基酸受體上的一大類酶。蛋白磷酸酶（protein

27、 phosphatase）是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類酶分子，與蛋白激酶相對應(yīng)存在，共同構(gòu)成磷酸化與去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開關(guān)系統(tǒng)。對蛋白激酶所引起的變化產(chǎn)生衰減信號接頭蛋白也稱調(diào)控結(jié)合元件(modular binding domain) 即信號分子中存在著的一些特殊的結(jié)構(gòu)域，大約50-100個氨基酸構(gòu)成，信號分子通過這些特殊結(jié)構(gòu)域相互識別和作用而有序銜接，形成不同的信號傳遞鏈。SH2結(jié)構(gòu)域 信號分子與含磷酸酪氨酸蛋白分子SH3結(jié)構(gòu)域 信號分子與含脯氨酸蛋白分子PH結(jié)構(gòu)域 磷脂分子PIP2、PIP3PTB結(jié)構(gòu)域 同SH2 ：信號分子與含磷酸酪氨酸蛋白分子G蛋白

28、的循環(huán)和活化：一、G蛋白的組成 三聚體G蛋白由、三種亞基組成。亞基具有GTP水解酶活性，又有調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白作用，和亞基具有調(diào)節(jié)亞基作用，也有調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白的作用，而且亞基上有脂鏈，故具有固定作用。這三個亞基可以聚合在一起形成三聚體，也可以解離為和形式。當G蛋白與GDP相結(jié)合時無活性，而與GTP結(jié)合時則活化成激活狀態(tài)。 二、G蛋白循環(huán)受體與信息分子結(jié)合后，受體構(gòu)象改變，并使與受體相偶聯(lián)的G蛋白構(gòu)象改變，使GTP置換了GDP。G蛋白激活后，離開受體并解離成和亞基GTP，亞基水解GTP，并調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP等第二信使的濃度，從而把信息傳導(dǎo)給下游分子，同時，與亞基結(jié)合的GTP水解成

29、GDP，然后亞基GDP復(fù)合物重新與亞基結(jié)合形成無活性的三聚體，完成一次信息傳導(dǎo)。G蛋白這種有活性和無活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)換稱為G蛋白循環(huán)與轉(zhuǎn)錄因子偶聯(lián)的受體： 多位于胞內(nèi)，與一些疏水性信息分子相識別，如類固醇激素、甲狀腺素、前列腺素、維生素A等。這種受體主要包括三個區(qū)域，羧基端為激素等信息分子的結(jié)合區(qū)域，氨基端為轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，調(diào)控某些基因的啟動子或上游的調(diào)控基因，中央部分為DNA的結(jié)合區(qū)，富含堿性氨基酸，平時此區(qū)與抑制蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。受體與信息分子結(jié)合時，發(fā)生構(gòu)象變化，抑制蛋白脫落，暴露出DNA的結(jié)合區(qū)，轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，與特定DNA部位結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。cAMPPKA 途徑-活化：信號分子與受體結(jié)合，

30、引起受體構(gòu)象變化受體活化G蛋白（結(jié)合GTP，與解離）活化后的G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）AC催化ATP生成cAMPcAMP活化PKA（依賴cAMP的蛋白激酶）PKA使目標蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)代謝酶的活性或調(diào)節(jié)基因的表達cAMPPKA途徑-失活：信息分子與受體解離，受體失活G蛋白失活（GTP被水解成GDP，亞基重新聚合）AC失活cAMP被磷酸二酯酶水解PKA失活胰島素受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路（一）胰島素受體介導(dǎo)的IRS-1-Ras-MAPK信號通路：這一通路主要涉及胰島素受體的基因表達調(diào)控的信號傳導(dǎo)。步驟：1、受體二聚體的形成及其磷酸化。2、募集接頭蛋白Grb2。3、Grb2的SH3募集SOS.4、

31、Ras的活化。5、MAPK的級聯(lián)激活。6、轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。（二）胰島素受體介導(dǎo)的IRS-PI3K-PKB信號通路：此通路與胰島素對代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，與細胞存活密切相關(guān)。步驟：1、PI3K的p85亞單位通過SH2結(jié)構(gòu)域與發(fā)生了洛氨酸磷酸化的IRS-1結(jié)合，p110催化亞單位激活。2、活化的PI3K催化PIP2磷酸化（D-3）生成PIP3。3、PIP3與PKB的PH（pleckstrin-homology domain）功能區(qū)結(jié)合，PKB構(gòu)象變化并轉(zhuǎn)位到胞膜，同時PIP3依賴的蛋白激酶（PDK）也與PIP3結(jié)合，使二者相互靠近。4、PDK催化PKB發(fā)生磷酸化，激活PKB。5、P

32、KB可磷酸化多種蛋白，介導(dǎo)代謝調(diào)節(jié)、細胞存活等效應(yīng)。第十章 細胞增生和凋亡的分子機制細胞周期中的四個checkpoint:（1）G1晚期 限制點 監(jiān)控G1期細胞大小及環(huán)境中是否有生長因子（2）G1®S 轉(zhuǎn)折 監(jiān)控DNA是否損傷（3）G2 ®M 轉(zhuǎn)折 監(jiān)控DNA是否損傷、DNA是否已正確完整地復(fù)制。（4）有絲分裂中期關(guān)卡 監(jiān)控姐妹染色單體是否已穩(wěn)定的附著在紡錘體上。參與細胞周期調(diào)控的蛋白質(zhì)1、周期蛋白（cyclin) 2、周期蛋白依賴性激酶（Cdk）3、周期蛋白-周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）4、Rb蛋白及E2F-DP1轉(zhuǎn)錄因子5、調(diào)節(jié)CdK磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和

33、磷酸酶6、泛素（ubiquitin）和使蛋白泛素化的酶（一）cyclin和Cdk復(fù)合物驅(qū)動細胞周期進程周期蛋白B和Cdk1的復(fù)合物又稱成熟促進因子。 Cdk 是種蛋白激酶，單獨存在的Cdk無活性，與相應(yīng)的cyclin結(jié)合后變構(gòu)而激活，并受磷酸化和去磷酸化的調(diào)控在有無活性間轉(zhuǎn)換，有活性的Cdk 復(fù)合物能夠磷酸化底物蛋白，調(diào)控它們的活性，驅(qū)動細胞周期，而 Cdk 復(fù)合物的活性又受CKI的抑制。（二）CKI抑制Cdk1及周期蛋白-Cdk復(fù)合物的活性CKI分類：Ink 4 家族：p15,p16,p18,p19蛋白。主要抑制Cdk4或Cdk6，抑制cyclin D與Cdk4或Cdk6結(jié)合，也抑制其復(fù)合物

34、利用ATP磷酸化底物的功能。Cip/Kip 家族： p21,p27,p57蛋白。是細胞接受到接觸抑制、DNA損傷、低氧或某些細胞因子信號后的產(chǎn)物，主要功能是與cyclin Cdk復(fù)合物結(jié)合，抑制它們的活性。（三）Rb蛋白與E2F-DP1結(jié)合，使E2F-DP1不能引起基因的轉(zhuǎn)錄，起負調(diào)控的作用。（四）使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也調(diào)節(jié)Cdk活性（五）泛素-蛋白酶體介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解也起調(diào)節(jié)細胞周期的作用。周期蛋白：是一類呈細胞周期特異性或時相性表達、累積與分解的蛋白質(zhì)，它與周期素依賴性激酶共同影響細胞周期的運行。調(diào)控蛋白的協(xié)同作用（一）Cdk4/6和Cdk2的活化是限制點處調(diào)控的關(guān)鍵因素分別與cyc

35、lin D、E先后結(jié)合，導(dǎo)致RB磷酸化釋放E2F-DP1，靶基因轉(zhuǎn)錄，細胞由G1®S，然后cyclin D、E經(jīng)SCF復(fù)合物多泛素化而降解。（二）Cdk1的活化是G2M關(guān)卡處關(guān)鍵調(diào)控因素cyclin B與Cdk1結(jié)合，導(dǎo)致底物蛋白的磷酸化，G2 ®M。（三）APC介導(dǎo)多泛素化蛋白降解是細胞離開M期進入G1期的關(guān)鍵調(diào)控因素 cyclin A/B Cdk1 ®APC磷酸化®連接姐妹染色體蛋白降解， M ® G1。（四）DNA損傷關(guān)卡致G1、G2期停滯 1 、通過系列磷酸化導(dǎo)致G2停滯 DNA損傷 ®活化ATM和ATR ® 磷酸化

36、Chk2和Chk1®cdc25C ®與14-3-3結(jié)合®cdc25C無法活化Cdk1 ®G2停滯®DNA修復(fù)。 2、P53致G1、G2停滯 細胞凋亡（apoptosis)：是機體細胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的程序性死亡過程，它的發(fā)生受機體的嚴密調(diào)控。細胞凋亡的形態(tài)特點：染色體固縮、膜起泡、核膜消失、DNA斷裂®凋亡小體形成。主要的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（一）外源性死亡受體途徑的關(guān)鍵步驟是死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物的形成 有8種受體，都屬于TNFa家族成員。 Fas結(jié)合Fas L®Fas 三聚體，激活死亡結(jié)構(gòu)域®募

37、集FADD分子® Fas-FasL-FADD ®死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），并激活死亡效應(yīng)域®caspase 8自我激活®激活caspase 3 ®細胞凋亡。（二）內(nèi)源性線粒體途徑的關(guān)鍵步驟是細胞色素C從線粒體膜間隙釋放到細胞漿 進入胞漿的細胞色素C與Apaf 1、ATP/dATP結(jié)合®形成凋亡體（apoptosome）® Apaf 1通過胱天蛋白酶募集域（CARD）與caspase 9前體的CARD相互作用而募集caspase 9前體® caspase 9自我激活®激活caspase 3 ®

38、;細胞凋亡。（三）正、負調(diào)節(jié)和兩條凋亡途徑的串話第十七章 細胞增生和凋亡相關(guān)基因與疾病原癌基因（proto-oncogene)是一類廣泛存在生物體中，高度保守的基因，其產(chǎn)物具有調(diào)控細胞增生的重要功能，當其受某些因素的影響，能發(fā)生突變（活化）成為癌基因，導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化。原癌基因的特點：1、廣泛存在于生物體；2、高度保守，功能相似；3、產(chǎn)物有重要功能；4、某些因素作用下，可發(fā)生突變，使細胞惡性轉(zhuǎn)化。原癌基因的產(chǎn)物：是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵分子。生長因子、生長因子受體、非受體洛氨酸蛋白激酶、G蛋白。原癌基因的活化機制：1、點突變2、基因擴增3、基因重排4、染色體易位5、插入誘變癌基因的功能：

39、 1、轉(zhuǎn)化（transformation)細胞形態(tài)發(fā)生變化，持續(xù)增生。調(diào)控轉(zhuǎn)化的原癌基因產(chǎn)物主要是位于細胞及胞漿。2、永生化（immortalization) 細胞分化受阻，不衰老死亡。調(diào)控永生化的原癌基因產(chǎn)物主要是位于細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。抑癌基因（tumor suppressor gene）：指存在于正常細胞內(nèi)的一大類可抑制細胞生長并具有潛在抑癌作用的基因，當這類基因發(fā)生突變、缺失或失活時，可引起細胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。抑癌基因的作用：1、RB和P53調(diào)節(jié)細胞周期關(guān)卡2、調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制細胞增生3、促進DNA修復(fù)維持基因組穩(wěn)定第十一章 基因分析的基本策略Sanger雙脫氧鏈末端終止法原

40、理： 在DNA聚合酶催化下，以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新鏈DNA的合成。DNA鏈中核苷酸以3,5-磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是 2-脫氧核苷三磷酸。2,3ddNTP與普通dNTP不同，它們在脫氧核糖的3位置缺少一個羥基。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒有3羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳就可以分辨出具有特定末端不同長度的DNA片段。Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，產(chǎn)生一組具有不同長度的DN

41、A鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)電泳分離得出待測DNA片段的核苷酸序列。基因拷貝數(shù)的分析Southern Blot原理：根據(jù)基因序列合成探針，利用同源互補序列可以退火形成異源雙鏈的原理，探測檢測對象中能與探針結(jié)合的DNA序列。Southern blot的基本步驟：DNA的酶切消化和基因探針的標記；酶切消化：要保證基因的完整性。 探針標記：探針序列的確定和檢測信號的選擇。Northern blot定性分析mRNA。 技術(shù)的關(guān)鍵是在于 RNA的制備和（變性）電泳。PCR技術(shù)的基本原理：作為引物的一對寡核苷酸與模板DNA同源序列按照堿基互補配對原則形成局部雙鏈，然后在TaqDNA聚合酶作用下引導(dǎo)新鏈DNA的合成

42、，經(jīng)過25-30個變性、退火和延伸的循環(huán)，獲得特異性的DNA片段擴增產(chǎn)物。RT-PCR技術(shù)：以RNA為模板體外擴增cDNA 的技術(shù)，可用于定性和相對定量（半定量）。 基本步驟：提取總RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行特定基因的PCR擴增。轉(zhuǎn)錄后RNA剪接的分析RNA酶保護試驗（RPA）：是一種液相雜交技術(shù)，通過RNase A 和RNase T1專一性降解單鏈RNA，分析受到保護的雜交雙鏈RNA，以確定RNA的剪接情況、剪接位點以及基因內(nèi)含子的可能位置等。蛋白質(zhì)的定性定量分析：指的是對特定基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的定性和定量及定位分析。一、從總蛋白質(zhì)中鑒定特定的蛋白

43、質(zhì)Western blot 技術(shù)：是一種免疫印跡技術(shù)，以偶連標記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)分子?；静襟E：蛋白質(zhì)樣品的制備和SDS-PAGE電泳分離，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，標記的抗體與膜上蛋白質(zhì)進行抗原抗體的結(jié)合，檢測并分析標記物信號。（在樣品中蛋白質(zhì)表達水平很低時，可通過免疫沉淀收集蛋白質(zhì)。）二、在細胞水平分析特定蛋白質(zhì)流式細胞術(shù)：用熒光標記的抗體結(jié)合細胞表面或內(nèi)部的特定蛋白質(zhì)分子（抗原），經(jīng)過流式細胞儀分析熒光信號，從而根據(jù)細胞表達特定蛋白質(zhì)的情況對基因的表達活性作出判斷。三、細胞定位分析特定的蛋白質(zhì)免疫組織化學(xué)（或免疫細胞化學(xué)）技術(shù)基本步驟：抗體的制備與標記，標本（組織或

44、細胞）的制備，組化染色和結(jié)果的觀察。第十二章 基因功能分析的基本策略特定基因功能研究的基本策略：通過特定基因的導(dǎo)入和特定基因的剔除或表達的抑制，制備模式生物體或體外培養(yǎng)的細胞模型，觀察和檢測其表型（包括整體、細胞、分子水平）的變化，從而分析、鑒定特定基因的功能。轉(zhuǎn)基因模型包括轉(zhuǎn)基因動物模型和轉(zhuǎn)基因的細胞模型。轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal):應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的攜帶外源基因并能穩(wěn)定遺傳的動物。轉(zhuǎn)基因動物的制備基本步驟：將目的基因（或基因組片段）導(dǎo)入實驗動物的受精卵（或著床前胚胎細胞），然后將其植入受體動物的輸卵管或子宮中，發(fā)育成攜帶有外源基因的個體，并通過分析其基因組中外源基因

45、的整合狀況及其揭示外源基因功能的表型，在此基礎(chǔ)上經(jīng)過常規(guī)的遺傳育種方法培育出轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用：1、確定特定基因的功能 2、發(fā)現(xiàn)新基因功能 3、發(fā)現(xiàn)新基因（突變） 4、研究基因表達的時空性 5、建立動物模型 6、產(chǎn)生需要的器官或組織基因敲除（gene knockout）：指通過DNA同源重組定向地將外源基因替換宿主細胞染色體DNA中特定的基因，從而使特定的基因在細胞內(nèi)或生物體內(nèi)失活的過程1打靶載體的構(gòu)建：同源序列要足夠長，要含有篩選用的標志基因。2 胚胎干細胞的體外培養(yǎng)3打靶載體導(dǎo)入胚胎干細胞4同源重組胚胎干細胞的篩選5基因敲除胚胎干細胞注射入胚泡6胚泡植入假孕小鼠的子宮中7雜交育種

46、獲得純合的基因敲除動物基因敲除動物（gene knockout animal）：采用同源重組定向剔除特定基因的技術(shù)，所制備的某特定基因喪失功能的動物?；蚯贸∈螅簯?yīng)用基因敲除技術(shù)，使兩條染色體上特定等位基因都喪失功能的小鼠?；虮磉_的抑制或沉默是通過在RNA水平的干涉來分析特定基因功能的方法。（1）反義RNA封閉目標RNA的功能 （2）RNA干涉（RNA interference, RNAi） 使特定基因沉默。反義RNA（antisence RNA)：能與mRNA互補配對的RNA分子。兩種方法：1、人工合成反義RNA®導(dǎo)入細胞®抑制mRNA 2、構(gòu)建載體®導(dǎo)入細

47、胞®轉(zhuǎn)錄反義RNA ®抑制mRNARNA干涉是指由短雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源mRNA的降解過程，可使基因表達受到抑制。原理：雙鏈RNA 激活Dicer（ 酶復(fù)合物，由核酸內(nèi)切酶和解旋酶組成），識別異常的雙鏈RNA并將其切割成短雙鏈RNA（siRNA，21-23bp）， siRNA與Dicer結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），雙鏈RNA經(jīng)解旋酶作用，成為單鏈RNA，識別并結(jié)合靶RNA分子，致核酸內(nèi)切酶的切割，失去編碼蛋白質(zhì)的功能。兩個步驟：1、長雙鏈RNA成為小干涉性RNA （SiRNA); 2、RISC形成，識別SiRNA同源的mRNA ，并切割。選擇目標RNA干涉靶點

48、的注意點：1、避開蛋白結(jié)合部位，選擇AUG下游50-100bp區(qū)的AA（N19）TT或AA（N21）序列；2、GC比50%左右，長30nt；3、與其它RNA序列無同源性。主要步驟：1、確定目標RNA并選擇被干涉靶點；2、準備針對目標RNA的siRNA；3、用siRNA干涉目標RNA;4、目標RNA含量和蛋白質(zhì)水平的分析。第十三章 基因工程DNA 重組（DNA recombination）：不同來源的DNA分子通過共價連接（磷酸二酯鍵）而組合成新的DNA分子，這一過程稱為DNA重組。重組DNA技術(shù)又稱為分子克隆技術(shù)或基因工程技術(shù)。分子克?。涸隗w外對DNA分子按照既定目的和方案進行人工重組，將重組

49、分子導(dǎo)入宿主，使其在宿主中擴增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝?；蚬こ?genetic engineering)：有目的地通過分子克隆技術(shù)，利用克隆基因表達、制備特定的蛋白或多肽產(chǎn)物，或定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程?；蚬こ痰难芯績?nèi)容：1.目的基因的獲取：從生物有機體的基因組中分離帶有目的基因的DNA片段；2.重組：在體外將帶有目的基因的DNA片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇標志的載體分子上，形成重組分子；3.將重組分子導(dǎo)入受體細胞（細菌）:K-12。4.帶有重組子的細菌擴增，獲得大量的繁殖群體。5.篩選：從大量的細胞繁殖群體中篩選出帶有重組DNA分子的克隆。6.分

50、析和表達：將選出的細胞克隆的目的基因進行進一步分析并實現(xiàn)功能蛋白的表達分子克隆常用的工具酶：一、限制性核酸內(nèi)切酶：是細菌產(chǎn)生的一類能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶。分類：可分為、型三大類。型酶作用特點：只有限制性活性，無甲基化活性；只需Mg+作為催化反應(yīng)輔助因子，無須。識別順序一般為46個堿基，通常是回文結(jié)構(gòu)（反轉(zhuǎn)重復(fù)順序），即具有180°的旋轉(zhuǎn)對稱。二、DNA連接酶（DNA Ligase）：T4 DNA Ligase。催化兩個獨立雙鏈DNA片段5-磷酸基和3-羥基之間形成磷酸二酯鍵；修復(fù)雙鏈DNA中一條鏈上的缺口。三、DNA聚合酶（DNA Polymerase

51、）1、DNA polymerase I （全酶，Kornberg polymerase）具有至少3種活性： 5®3聚合酶活性；5® 3外切酶活性；3® 5外切酶活性。應(yīng)用：1、催化DNA缺口平移（nick translation）反應(yīng)，制備高比活DNA探針；2. 第二cDNA鏈合成3. 對雙鏈DNA3突出末端進行末端標記；4. Sanger 測序 2、大腸桿菌DNA聚合酶klenow片段：5®3聚合酶；3® 5外切酶；缺失5®3外切酶活性 應(yīng)用：全酶第2-4。四、逆轉(zhuǎn)錄酶 （reverse transcriptase）依賴于RNA的D

52、NA聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶，產(chǎn)物DNA又稱cDNA（complementary DNA）。用于mRNA為模板合成cDNA，是構(gòu)建cDNA文庫和RT-PCR技術(shù)中的關(guān)鍵工具酶。五、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）:將dNTP加到DNA3羥基。作用：3端標記DNA探針在載體和待克隆片段上形成同聚物尾，以利DNA重組。六、堿性磷酸酶（AP）： 催化去除DNA、RNA、NTP及dNTP的5磷酸基團。1. 在用32P標記5末端前，去除DNA或RNA的5磷酸基；2. 在連接反應(yīng)中，去除載體DNA片段5磷酸基，防止自身環(huán)化。載體(Vector)能在連接酶作用下和外源DNA片段連接并運

53、送DNA分子進入受體細胞的DNA分子良好的載體應(yīng)具備以下條件：1. 必須有自身的復(fù)制子；2. 載體分子上必須有限制性內(nèi)切酶酶切位點,即多克隆位點（multicloning site,MCS），以供外源DNA插入3. 載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標志，以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子； 4. 載體分子必須具有足夠的容量5. 可通過特定的方法導(dǎo)入宿主(氯化鈣，磷酸鈣，電擊，等)。6. 對于表達載體還應(yīng)配備與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子，前導(dǎo)順序，增強子，加尾信號等調(diào)控DNA元件。一、質(zhì)粒載體：小片段DNA克隆，測序。特點1、分子量相對較小，能在細菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。2、具有一個以上的遺傳標記，便于對宿

54、主細胞進行選擇，如抗生素的抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lac Z）等。3、具有多個限制性內(nèi)切酶的單一切點，便于外源基因的插入。如果在這個位點有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標志基因的失活，而便于篩選。二、l噬菌體載體：構(gòu)建基因文庫（shotgun 基因組文庫、cDNA文庫）及 表達文庫。DNA可以作為載體，通過替換自身序列的方式攜帶外源DNA，這種載體稱為替換型載體三、粘性質(zhì)粒適合克隆較大的DNA片段：由質(zhì)粒和噬菌體的cos粘性末端構(gòu)建而成。粘粒載體大小為4-6kb，插入片段則可大至29-50kb應(yīng)用于大分子量DNA克隆。特點：含有質(zhì)粒的抗藥性標記如Ampr基因。帶有噬菌體的粘性末端（cos區(qū)）具

55、有一個或多個限制性內(nèi)切酶的酶切位點。粘性質(zhì)粒本身不大非重組體粘粒很小，不能在體外包裝，因而重組體的本底很低，有利于篩選。四、M13 噬菌體載體：制備單鏈DNA, 人工誘變五、病毒載體可將外源DNA帶入哺乳動物細胞六、BAC ：大片段DNA 克隆，0.1-0.4 MB。構(gòu)建物理圖譜基因工程的操作程序：一、制備目的基因和相關(guān)載體：1、從基因組文庫分離篩選基因。2、通過cDNA文庫分離篩選基因。3、人工合成基因：根據(jù)核苷酸序列。4、PCR擴增目的基因: 已知基因序列或同源序列。載體：噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫，PUC系列質(zhì)粒適合構(gòu)建CDNA文庫和克隆一些較小的DNA片段，M13噬菌體則適用

56、于克隆一些待測序的DNA片段。二、將目的基因和有關(guān)載體進行連接：1、粘性末端最適合DNA片段連接；2、人工接頭用于處理不易連接的DNA片段；3、加入同聚物尾是處理不易連接的DNA片段的另一有效方法；4、平端DNA片段可以在T4DNA連接酶的作用下，與某些限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的平端載體相連接。三、將重組的DNA導(dǎo)入受體細胞：1、轉(zhuǎn)化是直接將DNA導(dǎo)入細菌的方法；2、感染是利用噬菌體將外源DNA導(dǎo)入宿主細胞的方法；3、轉(zhuǎn)染是將外源DNA導(dǎo)入真核細胞的方法。四、DNA重組體的篩選和鑒定：1、采用遺傳學(xué)方法可以篩選特定的重組DNA：利用抗性標記可篩選帶有載體的細菌克隆利用不同標記可篩選出帶有重組體的細菌克

57、隆。a、插入滅活法利用特定抗性基因的失活進行篩選；b、a-互補篩選是利用功能互補的基因片段。2、免疫學(xué)方法是利用特異性抗體檢測表達產(chǎn)物3、核酸雜交法適合從文庫中篩選特定的DNA 4、PCR技術(shù)可對特定的DNA進行直接鑒定；5、酶切鑒定是利用限制性酶酶切圖譜鑒定特定的DNA。五、DNA重組體的擴增、表達和其他研究獲取目的基因的方法： 基因組文庫：是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體，它象一個儲存有基因組全部序列的信息庫，稱為基因組文庫。cDNA文庫：一群含重組cDNA的細菌或噬菌體克隆群體，含有某種生物的全部的mRNA的信息。轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入處于

58、感受態(tài)的宿主菌并使其獲得新的表型的過程感染：以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當?shù)募毎?，并在細胞?nèi)擴增。轉(zhuǎn)導(dǎo)：指以噬菌體為載體，在細菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過程，有時也指在真核細胞之間通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細胞DNA的過程。轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細胞的過程。藍白篩選原理：某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點的DNA序列。這些位點上如果沒有克隆外源性DNA片段，在質(zhì)粒被導(dǎo)入lac-的大腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG后，出現(xiàn)藍色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源DNA片段，將使lac Z基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。由于這種顏色標志，重組克隆和