微生物生理學(xué)課程論文-微生物堿性蛋白酶的性質(zhì)研究進展

1、微生物堿性蛋白酶的性質(zhì)研究進展摘要:綜述了微生物堿性蛋白酶的研究狀況,包括酶的微生物來源、酶學(xué)特性、微生物堿性蛋白酶在國內(nèi)外的應(yīng)用研究和現(xiàn)狀,并對其前景進行了展望。關(guān)鍵詞:堿性蛋白酶蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)微生物生理1堿性蛋白酶概述蛋白酶(protease,水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱。蛋白酶是一種重要的工業(yè)化應(yīng)用的酶制劑,占酶制劑市場的65%以上1,廣泛用于洗滌劑、制革、銀回收、醫(yī)藥、食品加工、飼料、化學(xué)工業(yè)、廢物處理等行業(yè)。蛋白酶執(zhí)行大量的不同的生理功能,從細胞水平擴展到器官和有機體水平,導(dǎo)致比如止血和發(fā)炎等的級聯(lián)系統(tǒng)。它們負責(zé)包括在正常生理功能和在非正常狀態(tài)下的病理生理功能的復(fù)雜過程。它們也存在于

2、致病生物體的生活史中,這就使它們成為一個潛在的發(fā)展治療因子的對象,來治愈如癌癥和艾滋病等可怕疾病。此外,蛋白酶應(yīng)用于食品和清潔劑工業(yè)具有悠久的歷史。在皮革工業(yè)中用于脫毛和皮革軟化,來替代以往有毒化學(xué)藥劑的使用還是一個相對較新的領(lǐng)域,這同時也增加了它的生物化學(xué)方面的重要性2。蛋白酶的多樣性以及它們特定的功能已經(jīng)引起了世界范圍內(nèi)對開發(fā)它們的生理學(xué)和生物工程的的廣泛關(guān)注。微生物具有生長速度快、生長條件較簡單、代謝過程特殊和分布廣等特點,微生物來源的蛋白酶,由于具有培養(yǎng)簡便,產(chǎn)量豐富等特點,適于工業(yè)化生產(chǎn)而得以廣泛應(yīng)用。近三十年來,人們對微生物蛋白酶的研究越來越深入,高產(chǎn)工程菌的選育以及對蛋白酶的純化

3、、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)研究又為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供了堅實的基礎(chǔ)3。隨著生物化學(xué)分子生物學(xué)、基因工程、蛋白質(zhì)工程的興起,蛋白酶的研究和應(yīng)用進入了一個嶄新的階段。而堿性蛋白酶也因其穩(wěn)定的生物活性和相對特殊的作用條件而成為目前市場上應(yīng)用最為廣泛的蛋白酶之一。2 蛋白酶的分類蛋白酶是一類復(fù)雜的水解酶,它們在生理、生化和催化特性方面有很大的差異。目前,對蛋白酶進行分類主要依據(jù)三個標準:裂解反應(yīng)的類型;裂解位點的化學(xué)特征;與結(jié)構(gòu)相關(guān)的進化關(guān)系。根據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)命名委員會的建議,微生物蛋白酶根據(jù)作用于蛋白酶底物的位點總體上分為內(nèi)肽酶和外肽酶;外肽酶切開蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵而游離出氨基

4、酸。其中作用于氨基末端的稱為氨肽酶,作用于羧基末端的稱為羧肽酶。內(nèi)肽酶切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵,生成分子量較小的多肽類。根據(jù)它們的活性中心和必需基團分又可以分為四類:1絲氨酸蛋白酶、2天冬氨酸蛋白酶、3半胱氨酸蛋白酶、4金屬蛋白酶,這是目前比較流行的分類方法;根據(jù)其最適作用pH還可以分為酸性蛋白酶,中性蛋白酶和堿性蛋白酶。2.1絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶廣泛存在于各種生物體中,這類酶的活性部位又稱活性絲氨酸殘基,可被二異丙基氟磷酸(DFP或者苯甲基磺酰氟(PMSF抑制,很多絲氨酸蛋白酶也可被PCMB所抑制。該類酶水解時通常分為兩步反應(yīng),在反應(yīng)中被切斷的氨基酸或肽鏈片段與酶之間會以共價相連,這一酞基

5、化步驟之后跟隨一個去酞基化過程,這一去酞基化過程是一個水的親核反應(yīng),結(jié)果是肽鏈的水解。絲氨酸內(nèi)肽酶可分為三類:類胰蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶、類彈性蛋白酶,它們分別作用于帶正電氨基酸殘基、疏水殘基、小疏水殘基,多數(shù)絲氨酸蛋白酶的催化基團是Ser-His-Asp的三聯(lián)體。絲氨酸蛋白酶它們對底物的特異性較小,具低的分子量(18.535KDa。多數(shù)絲氨酸蛋白酶的等電點為4.46.2之間。此類酶幾乎全是內(nèi)肽酶,胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶等都屬此類。其中最知名的堿性絲氨酸蛋白酶是由Bacillus licheniformis產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶。真菌的堿性絲氨酸蛋白酶被認為參與體內(nèi)激素原的加工過程。2.

6、2天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶的特性是在低pH(34條件下具有最大活性,活性中心含有天冬氨酸殘基,廣泛存在于真菌中,很少在細菌中存在。這類酶對其他三類酶的抑制劑不敏感。大多數(shù)天冬氨酸蛋白酶的分子量在3045KDa之間,等電點通常在3.44.6之間。它們要求切點兩旁的氨基酸為芳香族氨基酸殘基。多數(shù)真菌的天冬氨酸蛋白酶在中性pH條件下不穩(wěn)定。其催化活性依賴于天冬氨酸殘基,晶體學(xué)研究表明,天冬氨酸蛋白酶的胃蛋白酶家系都具有兩葉的分子結(jié)合劑如EDTA,該酶的活性位點位于兩葉之間,每一葉都為天冬氨酸蛋白酶提供了維持其活性所必須的一對天冬氨酸殘基中的一個,這兩葉彼此相互同源,通過基因復(fù)制得到。胃蛋白酶家系

7、中大部分酶活性位點的天冬氨酸殘基都在一個10Asp-Thr-Gly-Xaa的基序中,該基序同時位于兩葉的氨基端和羧端,其中Xaa 可以是Ser或Thr,其側(cè)鏈可通過氫鍵與Asp相連。2.3半胱氨酸蛋白酶只有少數(shù)真菌可產(chǎn)生半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶的催化機制與絲氨酸蛋白酶的極其相似,其中存在的Cys-His-Asn三聯(lián)體和絲氨酸蛋白酶中的Ser-His-Asp是同源的。這類酶活性部位有一活性半胱氨酸殘基,活性可受到氧化劑、烷化劑和重金屬的抑制。半胱氨酸、EDTA能夠激活酶的活性。多數(shù)半胱氨酸蛋白酶的最適作用pH為58。木瓜蛋白酶、菠蘿酶、無瓜果酶等植物蛋白酶以及某些鏈球菌蛋白酶均屬此類。2.

8、4金屬蛋白酶金屬蛋白酶的活性中心含有Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Cu2+等金屬元素,金屬螯合劑如乙二胺四醋酸(EDTA,鄰菲繞啉(OP等能將金屬原子從酶蛋白剝離而引起失活,失活的酶重新加入金屬離子可使酶活性恢復(fù),這種酶也可受到氰化物及其他金屬的強烈抑制。絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑對它們的活性無影響。金屬蛋白酶的最適pH為59,在細菌和真菌中均有發(fā)現(xiàn)。多數(shù)細菌和真菌的金屬蛋白酶都含有鋅原子,每一個酶分子含一個鋅原子。鋅原子對酶的活性是必需的,鈣離子對穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)有作用。屬于這一類的蛋白酶包括許多微生物中性蛋白酶、胰羧肽酶A和某些氨肽酶。3 堿性蛋白酶的來源堿性蛋白酶主要

9、存在于細菌,放線菌和真菌中。目前,商業(yè)中應(yīng)用的堿性蛋白酶主要來源于芽孢桿菌,如丹麥酶制劑生產(chǎn)商NovoNordisk 使用的生產(chǎn)菌株就包括地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis,緩慢芽孢桿菌Bacilluslentus,其它的堿性蛋白酶商業(yè)生產(chǎn)菌株還包括嗜堿性芽孢桿菌Bacillus alcalophilus (Gist-Brocades,荷蘭等。一些革蘭氏陰性菌及真菌等也產(chǎn)生堿性蛋白酶。目前堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株有Bacillus licheniformis,Bacillus mojavensis,Aspergillus clavatus4等。真菌比細菌產(chǎn)生更多種類的蛋白酶。例

10、如, Aspergillus oryzae產(chǎn)生酸性、中性、和堿性蛋白酶。真菌蛋白酶在一個比較廣的pH(411范圍內(nèi)都具有活性而且顯示出顯著的底物特異性。然而,它們與細菌相比反應(yīng)速率較低,耐熱性較差。真菌酸性蛋白酶的最適pH為44.5,在pH2.56.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。因為它們較窄的反應(yīng)pH和穩(wěn)定特異性,所以在乳酪生產(chǎn)工業(yè)中具有特殊的用途。真菌的中性蛋白酶是金屬蛋白酶,在pH7.0有活性,且可被螯合劑抑制。真菌堿性蛋白酶也被用作飼料添加劑。4 堿性蛋白酶的性質(zhì)4.1分子量堿性蛋白酶的分子量范圍多數(shù)集中在18-35Kda,少數(shù)堿性蛋白酶的分子量例外,達到45Kda或82Kda,也有少數(shù)蛋白酶分子量很小

11、,有的甚至只有8Kda5。在一些芽孢桿菌中,堿性蛋白酶的電泳條帶呈現(xiàn)出多樣性。這種多樣性一方面是由于酶蛋白分子中天冬酰胺或谷氨酰胺殘基可逆的脫氨基作用造成,另一方面是因為一些蛋白酶也存在自我剪切作用。4.2 最佳pH及溫度大部分堿性蛋白酶的最適pH值為911,如Bacillus sp.所產(chǎn)堿性蛋白酶最適pH為1011,少數(shù)蛋白酶最適pH可達到更高,如Bacillus clausii GMBE 22 所產(chǎn)蛋白酶最適pH為。堿性蛋白酶的最適溫度分布范圍較廣,分離自嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp B18的蛋白酶最適溫度達到85。史勁松等從冰川中分離出一株耐冷菌Bacillus cereus SY

12、P-A2-3,所產(chǎn)冷適性蛋白酶最適溫度為426;4.3 金屬離子對酶活性的影響二價金屬離子如Ca2+,Mg2+,Mn2+等能提高堿性蛋白酶活力,此外Ca2+能增強絕大多數(shù)蛋白酶的熱穩(wěn)定性。研究認為Ca2+可以保護這些酶熱變性并且在高溫情況下保護其防止構(gòu)象改變。另外,特定的Ca2+結(jié)合位點還影響到蛋白酶的活性及穩(wěn)定性。在一些研究中,發(fā)現(xiàn)Hg2+會阻遏酶活,重金屬離子對酶的毒性作用在其他一些文獻中也有所論述。大部分二價金屬離子對酶活有促進作用,5mmol/L 的Mn2 + ,Fe2 +,Zn2 +,Mg2 +,Co2 +能顯著促進Bacillussubtilis 分泌的蛋白酶的活力7,其中Mn2+

13、的作用最為顯著,處理后酶活升至167%。5 高產(chǎn)菌株的選育高堿性蛋白酶活力菌株是工業(yè)化生產(chǎn)實現(xiàn)的前提和基礎(chǔ),然而從自然界分離得到的堿性蛋白酶菌株酶活力一般都較低,不能直接應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。為此,必須對產(chǎn)酶菌株進行定向或非定向性的改造,以提高原始菌株產(chǎn)酶能力符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求,一般可以采取以下措施:5.1利用傳統(tǒng)的物理、化學(xué)因子單獨或復(fù)合誘變選育高活力菌株早期許多研究表明,通過物理、化學(xué)因子單獨或復(fù)合誘變選育高活力產(chǎn)堿性蛋白酶菌株是一種切實可行的方法,至今仍不失為菌種選育的一種好方法。那淑敏8(1987利用NTG和紫外線復(fù)合誘變地衣芽孢桿菌獲得變異株Bacillus licheniformis

14、 533-F13,產(chǎn)酶活力達10000U/mL,相對出發(fā)菌株酶活提高了近20倍。由此可見,通過物理、化學(xué)因子誘變或優(yōu)化發(fā)酵條件選育高活力菌株的確是一個切實可行的辦法。5.2 原生質(zhì)體技術(shù)選育堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株通過原生質(zhì)體技術(shù)改良堿性蛋白酶菌株有很多成功的研究報道9-10。潘延云9用原生質(zhì)體融合的方法,將堿性蛋白酶生產(chǎn)菌2709與含有堿性蛋白酶基因克隆載體pDW2的工程菌枯草桿菌BDl05進行原生質(zhì)融合,得到1株高效表達的高產(chǎn)堿性蛋白酶的工程菌A16,通過雙親的形態(tài)學(xué),營養(yǎng)特征和不同抗藥性為篩選指標進行觀察證明A16攜有雙親的遺傳物質(zhì),表型和生長特征與2709相似,發(fā)酵液酶活比2709高50%1

15、00%,搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)酶水平達到國際領(lǐng)先水平,最高可達30000 U/mL。薛林貴10等人對地衣芽孢桿菌(Bacillus lichniformis53號菌株在原生質(zhì)體形成最佳條件下進行原生質(zhì)體制備并多次紫外線誘變終得一株穩(wěn)定高產(chǎn)的堿性蛋白酶產(chǎn)生菌53-G38-6,酶活由原來的1104U/mL提高到22080 U/mL,活力提高了近20倍。楊文博11以短小芽孢桿菌Bacillus pumilus C172為出發(fā)菌株,采用UV照射、DES和原生質(zhì)體NTG誘變等復(fù)合誘變處理選育出C172-415突變株,堿性蛋白酶搖瓶產(chǎn)酶最高活力達13977 U/mL。原生質(zhì)體誘變選育高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株還有大量報道。

16、實踐表明,制備原生體后對其進行誘變能大大提高菌種產(chǎn)酶量或直接原生質(zhì)融合選育高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株不失為一個好的方法。5.3 利用基因工程技術(shù)選育高產(chǎn)菌株的選育自 1985 年 Jacobs12第一次通過建立基因文庫克隆了第一條堿性蛋白酶基因 以來， 利用基因工程手段獲得高產(chǎn)堿性蛋白酶高產(chǎn)工程菌已成為當(dāng)前蛋白酶研究 的熱點之一。利用基因工程技術(shù)手段提高菌種的產(chǎn)酶能力，不僅使菌種的產(chǎn)酶量 有極大的提高，而且能夠改變酶的某些特性以求滿足生產(chǎn)需求，促進了理論研究 與實踐應(yīng)用的緊密融合，大大縮短了從探索研究到生產(chǎn)應(yīng)用的周期，同時也克服 了傳統(tǒng)菌種選育方法的隨機性和盲目性， 為微生物育種提供了一條新的思路和途

17、 徑。楊文博13等人將 Bacillus pumilus C172-60 為受體株，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 技術(shù)將攜帶糖化型-淀粉酶基因(Amy、Cmr 基因，Kmr 基因的 pBX96 質(zhì)粒成功 導(dǎo)入到受體內(nèi)，并獲得能直接利用淀粉作為碳源并保留噬菌體抗性、產(chǎn)堿性蛋白 酶的工程菌 C172-306(pBX96。 雷虹14等成功利用 PCR 技術(shù)從地衣芽孢桿菌 2709 菌株的染色體 DNA 中擴增了 2709 堿性蛋白酶的編碼序列并肯定了 2709 菌堿性蛋 白酶屬典型的 Sublilisin Carlberg。 5.4 蛋白質(zhì)工程技術(shù)選育高產(chǎn)菌株的選育 蛋白質(zhì)工程(protein enginerr

18、ing是指通過對天然蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)衍生物 的結(jié)構(gòu)分析，確定其三級結(jié)構(gòu)模型，然后通過分子設(shè)計合成突變基因，經(jīng)篩選突 變體 DNA，合成相應(yīng)蛋白質(zhì)的方法15，主要集中在提高堿性蛋白酶的穩(wěn)定性，抗 氧化性及改變蛋白酶的專一性等方面。 我國在蛋白質(zhì)工程技術(shù)選育高產(chǎn)堿性蛋白 酶菌株取得了重大的成就。 王賢舜16用蛋白質(zhì)工程的方法在計算機圖像系統(tǒng)上對 預(yù)定的分子改造方案進行了預(yù)測， 成功地完成了構(gòu)建 1 個分泌熱穩(wěn)定性比野生型 枯草桿菌蛋白酶 E 高 4 倍的工程菌。1998 年 wells 和 Estell 將 BPN 酶與底物殘 基側(cè)鏈關(guān)系密切的三個殘基逐步改換成 Carlsberg 酶底物的殘基， 同時對于活性 部位的 Ser221，His64，Asnl55 也做了替換，實現(xiàn)了 BPN 酶的專一性轉(zhuǎn)化為類似 于 Carlsberg 酶的專一性17。 6 研究前景 目前，我國堿性蛋白酶研究已經(jīng)達到了分子水平，利用基因工程手段和蛋白質(zhì) 工程手段定向改造堿性蛋白酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶活力及酶學(xué)性質(zhì)是今后很長時間的一 個發(fā)展趨勢。隨著生物技術(shù)基礎(chǔ)研究的深入和應(yīng)用技術(shù)手段的完善，堿性蛋白酶 研究將會進入一個全新的階段。今后，我國堿性蛋白酶