工業(yè)微生物育種

1、1. 工業(yè)微生物育種在發(fā)酵工業(yè)中的作用如何？其目的是什么？ 工業(yè)微生物育種建立在：（1）遺傳和變異（微生物遺傳學）的基礎之上；（2）物理和化學誘變劑的發(fā)現(xiàn)和應用；（3）工業(yè)自動化（自動儀表裝置和微機）。工業(yè)微生物育種在發(fā)酵工業(yè)中占有重要地位，是決定該發(fā)酵產品能否具有工業(yè)化價值及發(fā)酵過程成敗與否的關鍵。2. 工業(yè)微生物發(fā)展經歷了哪幾個階段？ 1)自然選育階段 2)人工誘變選育階段 3)雜交育種階段 4)代謝控制育種階段 5)基因工程育種階段3. 工業(yè)微生物育種的核心指標有哪些？1) 在遺傳上必須是穩(wěn)定的。穩(wěn)定性。2) 易于產生許多營養(yǎng)細胞、孢子或其它繁殖體。3) 必須是純種，不應帶有其他雜菌及噬

2、菌體。4) 種子的生長必須旺盛、迅速。5) 產生所需要的產物時間短。轉化率。6) 比較容易分離提純。 7) 有自身保護機制，抵抗雜菌污染能力強。 8) 能保持較長的良好經濟性能。產率。9) 菌株對誘變劑處理較敏感，從而可能選育出高產菌株。10）在規(guī)定的時間內，菌株必須產生預期數(shù)量的目的產物，并保持相對地穩(wěn)定。4. 革蘭氏陽性和陰性菌的細胞壁結構有何差異？它們對溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？5. 缺壁細菌有哪些類型和異同？制備缺壁細菌主要有哪些途徑？原生質體：G+菌經溶菌酶或青霉素處理；球狀體：G-菌，殘留部分細胞壁。是研究遺傳規(guī)律和進行原生質體育種的良好實驗材料。L型細菌：自發(fā)突變形成細胞壁缺

3、陷菌株；6. 原生質體制備時，為什么不同微生物要選擇不同的酶？舉例說明。酶在原生質體制備中主要用來酶解細胞壁的，不同的微生物其細胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。 酵母菌的細胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白質、幾丁質。霉菌的細胞壁：主要成分是纖維素、幾丁質、葡聚糖等 。藻類的細胞壁：主要成分有纖維素構成結構骨架。7. 基因組、基因、密碼子、簡并、同義密碼子的概念是什么？一、基因組1. 原核生物 就是它的整個染色體，原核生物的基因組較小，DNA的含量低，如E.coli的DNA分子質量為2.4×109Da，相當于4.2×106bp，含有3000-4000個基

4、因，SV40病毒僅5個基因。2. 真核生物 能夠維持配子或配子體正常功能的最低數(shù)目的一套染色體，稱為基因組。分子大，達到5×1081010bp。重復序列是基因組結構的一個特點，原核生物少，真核生物多，真核生物DNA序列（1）單一序列：單拷貝；（2）輕度重復序列：2-10個拷貝；（3）中度重復序列：10-幾百個拷貝；（4）高度重復序列：幾百-幾萬個拷貝。二、基因基因：是一個遺傳信息單位，對應著一段編碼多肽氨基酸順序的不連續(xù)DNA片段?；蚣易澹河梢粋€基因通過基因重復而產生兩個或更多的拷貝而構成的一組基因。操縱子：乳糖操縱子多基因家族：簡單多基因家族（每個重復單元含有單一的轉錄和非轉錄區(qū)

5、），復雜多基因家族（每個重復單元含有多個不同的轉錄區(qū)和非轉錄區(qū)）。中心法則：遺傳信息以DNARNA蛋白質這種方向進行傳遞；反轉錄病毒可以由RNA合成DNA?；虻木幋a序列在DNA分子上是不連續(xù)的，為一系列DNA片段所隔開，編碼序列稱為外顯子，把外顯子割裂的DNA片段稱為內含子。擬基因：某些基因因DNA序列發(fā)生變化，在序列上與活性基因相似，但不具有功能、不能編碼蛋白質。轉座子：能在同一細胞的不同染色體之間或者同一染色體的不同位點之間轉移的一些DNA序列。轉座因子的轉座會引起極性效應插入突變、缺失和倒位等多種遺傳效應。3、 遺傳密碼 密碼子：mRNA上三個連續(xù)的核苷酸決定一個特定的氨基酸，這三 個

6、核苷酸稱為密碼子。 簡并：幾種密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象。 同義密碼子：對應于同一氨基酸的不同密碼子。 基因組:個體或細胞所含的全套基因的總和。在原核生物中為整個染色體?；?DNA 分子的一個片段。密碼子:mRNA 分子中以三個核苷酸為一組，決定一種氨基酸以及多肽鏈合成起始與終止的信號。 簡并:兩種或多種核苷酸三聯(lián)體決定同一種氨基酸。同義密碼子:對應同一氨基酸的不同密碼子。8. 起始密碼子和終止密碼子有哪些？起始密碼子：AUG 終止密碼子：UAA UAG UGAmRNA上的堿基順序每3個堿基用解讀框架劃分開，可決定其所生成蛋白質的氨基酸順序，為了使堿基順序作為遺傳信息能正確轉譯，通常需要從

7、某個特定的位置開始轉譯。這個起始點的密碼子就叫做起始密碼子。起始密碼子是定位翻譯開始位置的信號標記。AUG 少數(shù)細菌(屬于原核生物)以GUG(纈氨酸)或UUG為起始密碼子。 蛋白質翻譯過程中終止肽鏈合成的信使核糖核酸(mRNA)的三聯(lián)體堿基序列。一般情況下為UAA、UAG和UGA，它們不編碼氨基酸。 9. 什么是可讀框？密碼子閱讀的方向是沿著mRNA的什么方向進行？可讀框是以起始密碼子開始，在三聯(lián)體讀框的倍數(shù)后出現(xiàn)終止密碼子之間的一段序列?？勺x框有可能編碼一條多肽鏈或一種蛋白質。當沒有已知蛋白質產物時，該區(qū)域被稱為可讀框,而當確知該可讀框編碼某一蛋白時，它就被稱為編碼區(qū)，即一個可讀框

8、是潛在的編碼區(qū)。很多情況下，可讀框即指某個基因的編碼序列。自起始密碼子到終止密碼子之間的核苷酸三聯(lián)體序列。一般情況下，可讀框即指 某個基因的編碼序列。由起始子AUG(甲硫氨酸)開始，每三個為一個密碼子翻譯，直至遇到終止子。10. 基因突變的特征有哪些，請做簡單解釋。1、 突變的稀有性 自然突變頻率很低，細菌10-410-10，高等生物10-510-8，不同的生物，不同的基因其突變率相差較大。2、突變的重演性和可逆性 指同種生物的同一基因突變?yōu)橄嗤谋硇停梢栽诓煌瑐€體間重復出現(xiàn)。3、突變的平行性 即可發(fā)生回復突變，顯性基因可以突變?yōu)殡[性基因，而隱性基因也可以突變?yōu)轱@性基因，前者稱為正向突變，后

9、者稱為回復突變。4、突變的多方向性與復等位基因 親緣關系相近的物種由于遺傳物質相近，而發(fā)生相似的基因突變，基因的突變可以向多個方向進行，一個基因可以突變?yōu)閍1、a2、a3an等而構成所謂的復等位基因。這些復等位基因可以從野生型基因突變產生，也可以從其它任何一個突變基因突變產生。5、突變的有害性和有利性 突變大多數(shù)是有害的。這是因為生物經長期的自然選擇，產生了與外界環(huán)境相同協(xié)調的關系，這種關系一旦因突變而改變便可能干擾內部的生理生化過程，所以大部分突變對生物體是不利的。少數(shù)的突變能促進和加強某些生命活力，所以是有利的突變。例如作物抗病性，微生物的抗藥性等，這些突變?yōu)樯镞M化提供了最有利的條件。1

10、1.突變發(fā)生后，細胞內有哪些修復突變的機制？DNA結構被改變后：一種是DNA分子在復制過程中排除或克服修復系統(tǒng)的作用而成為突變體；另一種是經修復系統(tǒng)修補后恢復原有DNA分子結構，不能形成突變體。 微生物修復系統(tǒng)：光修復和暗修復（復制前修復和復制后修復） 紫外線誘變作用：主要是使DNA單股鏈上的鄰近兩個嘧啶堿基結合形成嘧啶二聚體，DNA鏈的結構發(fā)生變形，失去堿基正常配對，DNA復制、RNA轉錄都不能正常進行，成為一條有缺口的DNA鏈。12. 什么是表型延遲？怎樣避免表型延遲現(xiàn)象？表型延遲：是指微生物通過自發(fā)突變或人工誘變而產生新的基因型個體所表現(xiàn)除了的遺傳特性不能在當代出現(xiàn)，其表型的出現(xiàn)必須經過

11、2代以上的復制。（1）與誘變劑性質和細胞壁結構組成有關，有些誘變劑滲入細胞的速度相當慢。（2）若突變發(fā)生在多核細胞中的某一個核，該細胞就成為雜核細胞了。如果該核突變的基因是唯一控制突變表型的基因，那么突變是隱性的，只有幾代繁殖分裂得到純的核突變細胞，才能出現(xiàn)由該基因控制的突變表型。（3）原有基因產物的影響 原有基因產物在子細胞中的濃度隨著繁殖逐步稀釋到最低限度后，突變表型才顯現(xiàn)。13. 誘變劑主要有哪三類？誘變劑：凡能誘發(fā)生物基因突變，并且突變頻率遠遠超過自發(fā)突變率的物理因子或化學物質。（1） 物理誘變劑，例如，電離輻射、紫外線、電磁波等（2） 化學誘變劑，如藥品、農藥、食品添加劑、調味品、化

12、妝品、洗滌劑、塑料、著色劑、（3） 生物誘變劑，如真菌的代謝產物、病毒、寄生蟲等。（4） 生物體內還有一些內源性誘變劑。內源性誘變劑是在人體健康異常的情況下產生的，如遺傳因素、內分泌紊亂等。14. 簡述紫外線照射誘變育種的原理、方法和基本步驟。1. 紫外線的誘變機制 紫外線引起： DNA與蛋白質的交聯(lián)；胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用；DNA鏈的斷裂；嘧啶二聚體的形成（單鏈上相鄰兩個胸腺嘧啶之間或雙鏈相對應的兩個胸腺嘧啶之間）。最有效波長為253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外線。 絕對劑量單位：erg/mm2相對劑量單位：用照射時間或殺菌率表示。一般認為殺菌率在90%99

13、.9%時，誘變效果較好。不同微生物所需殺菌時間15W功率的紫外燈管和固定距離為30cm的條件下照射微生物，要使殺菌率達到9099.9的效果：芽孢菌約需10 min；照射短小芽孢桿菌的營養(yǎng)體來獲得缺陷型需要13 min；一般微生物營養(yǎng)體照射35min；無芽孢菌和革蘭氏陽性菌只需0.52 min。紫外線誘變的步驟與方法：（1）出發(fā)菌株，把細菌斜面培養(yǎng)到對數(shù)期，霉菌或放線菌則培養(yǎng)到孢子剛成熟。（2）前培養(yǎng)，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，同時加入抑制修復的物質（咖啡堿或異煙肼），達到最佳生理狀態(tài)。（3）制備菌懸液；（4）紫外線照射，暗室進行，或誘變后立即浸入冰水中12 h，低溫抑制突變修復。（5）后培養(yǎng)，根據(jù)延遲

14、現(xiàn)象的原理，照射完畢的菌懸液加入到適合于正突變體繁殖的培養(yǎng)基，在適宜溫度下培養(yǎng)1.52 h。（6）稀釋涂皿，后培養(yǎng)結束后，從中取一定量培養(yǎng)物，作不同稀釋度，涂皿，并且以未經紫外線照射過的菌懸液作對照，培養(yǎng)后，挑取菌落，以待篩選。 15.化學誘變劑主要有哪四類？化學誘變劑：是一類能對DNA起作用、改變起結構、并引起遺傳變異的化學物質。包括：堿基類似物、烷化劑、移碼突變劑以及其他種類等?；瘜W突變劑具有專一性，只對基因的某部位發(fā)生作用?；瘜W誘變劑的劑量主要決定于其濃度和處理時間。劑量使用原則：以誘變效應大，而副反應小為原則。注意：90以上的化學誘變劑都是致癌物質或極毒藥品。使用時注意自身安全，并防止

15、污染環(huán)境。 一、堿基類似物 是一類和天然的嘌呤嘧啶等四種堿基分子結構相似的物質。既能誘發(fā)正向突變，又能誘發(fā)回復突變。2、 烷化劑 活性烷基易取代DNA分子中活潑的氫原子，從而改變DNA分子結構，引起突變。3、 脫氨基 亞硝酸的誘變機制 亞硝酸可直接作用于正在復制或未復制的DNA分子，脫去堿基中的氨基變成酮基，改變堿基氨氫鍵的電位，引起轉換而發(fā)生變異。還可引起DNA兩條單鏈之間交聯(lián)。4、 移碼誘變劑 移碼誘變劑與DNA相互結合引起堿基增添或缺失而造成突變。五、羥化劑 羥胺（HA）1. 羥胺的誘變機制：G:CA:T2. 羥胺的處理方法 六、金屬鹽類七、其他化學誘變劑1. 秋水仙堿：誘變輔助劑 2.

16、 抗生素: 鏈黑霉素、爭光霉素、絲裂霉素、放線菌素、正定霉素、光輝霉素、阿霉素，誘變輔助劑。 16.烷化劑的作用機制是什么？主要通過烷化基團使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，DNA復制時導致堿基配對失誤而引起突變。突變的主要位點：鳥嘌呤的N7，鳥嘌呤的O6、胸腺嘧啶O4突變的次要位點：鳥嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3 17. 簡述亞硝基胍誘變育種的原理、過程和安全注意事項。超級誘變劑之稱，適合誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株，還能使多基因并發(fā)突變。NTG在水溶液中隨不同pH將產生不同的分解產物。通常在pH 6.0的條件下進行誘變處理，常用磷酸緩沖液和Tris緩沖液。 NTG誘變處理

17、方法：步驟： 新鮮斜面制備菌懸液； 配制NTG母液； 菌懸液和NTG溶液混合保溫處理； 以冷的生理鹽水稀釋洗滌菌體終止反應。 平皿分離。其他方法：液體培養(yǎng)后直接加入NTG；NTG與瓊脂和菌液混合制平板。 注意：NTG是一種強烈致癌物質，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風櫥中進行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨處理，例用自來水大量沖洗或用1-2N的NaOH浸泡過夜，洗凈。18.生物誘變劑按照誘變方式主要分為哪三類? 1）轉導誘發(fā)突變2）轉化誘發(fā)突變3）轉座誘發(fā)突變19. 什么是菌株分離和篩選？菌株分離：就是將一個混雜著各種微生物的樣品通過分離技術區(qū)分開，并按照實際

18、要求和菌株的特性采取迅速、準確、有效方法對它們進行分離、篩選，進而得到所需微生物的過程。 20. 分離篩選的基本步驟有哪些？菌種的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產物鑒別這幾個步驟。 21. 抑制不需要菌類的常用方法有哪些？通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數(shù)量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達到富集的目的。 高溫處理抑制不產芽孢菌； 膽鹽和十二烷基磺酸鈉抑制革蘭陽性菌 ；硫乙醇酸鈉 抑制好氧菌；四環(huán)素等抗生素抑制細菌 ；重鉻酸鉀抑制土壤真菌、細菌 。22. 好氣微生物分離的常用方法有哪些？它們的原理如何?粗放：菌落純 細化：菌株純、細胞純（1） 稀釋涂布法 （二）劃線

19、分離法 （三）利用平皿的生化反應進行分離 1、透明圈法 混濁底物被分解后形成透明圈。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、有機酸等。 2、變色圈法：直接用顯色劑或指示劑 果膠酶：剛果紅（絳紅色水解圈）谷氨酸：溴百里酚蘭（pH 6.2以下為黃色， pH 7.6以上為藍色）內肽酶：吲羥乙酸酯被產酶菌落水解為3-羥基吲哚，后者氧化成藍色物質）乙醇：藍色的鹽類物質在醇脫氫酶和NAD作用下反應產生電子脫色，形成淡白色暈圈。 3、生長圈法 用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產生菌。 利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物（營養(yǎng)缺陷型菌株）作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生

20、長，形成生長圈 。 4. 抑菌圈法 常用于抗生素產生菌的 分離篩選。 （四）組織分離 1. 對一般有病組織的分離方法清洗組織表面0.1升汞表面消毒無菌水沖洗適宜溫度培養(yǎng)挑取菌落2. 食用菌孢子分離方法（1）組織塊分離法：組織塊切小塊，斜面直接培養(yǎng)。（2）多孢子分離：表面消毒，孢子采集。（3）單孢子分離：收集到的孢子稀釋涂布培養(yǎng)。（五）單細胞或單孢子分離法1、顯微挑取法 采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng) 。2. 小滴分離純化培養(yǎng)法（六）特殊菌類環(huán)保降解菌的分離多環(huán)芳烴、有機染料和顏料、表面活性劑、農藥、酚類和鹵代烴。分離篩選這類物質的降解微生物時，通常采用

21、以該物質為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)。23. 平皿生化反應分離有哪些主要方法？原理如何？見22。24. 如何用焦性沒食子酸法分離厭氣菌？焦性沒食子酸和NaOH互相反應除去氧氣。除去100ml空氣中的氧氣需要焦性沒食子酸固體1g和10%NaOH溶液10ml。無菌培養(yǎng)皿一套，在皿蓋內到上分離培養(yǎng)基，凝固后，皿底一側放焦性沒食子酸固體，另一側放10% NaOH溶液，使二者不相接觸。分離操作后，搖動平皿使焦性沒食子酸固體和NaOH溶液混合，發(fā)生化學反應，除去皿內的氧氣。 25.初篩和復篩的要求有什么不同？初篩是指從大量的菌落中隨機挑取進行搖瓶試驗并通過檢測得到一些較優(yōu)菌株。復篩是指將初篩得到的

22、較優(yōu)菌株再進行多次搖瓶實驗驗證其效價和傳代穩(wěn)定性，并從中得到一兩個或少數(shù)幾個最優(yōu)的菌株。 通過定義可以知道，復篩不僅要將初篩得到的菌種進行再次發(fā)酵驗證，還需要進行傳代驗證，就是傳很多代，每代或隔代進行發(fā)酵驗證，看齊穩(wěn)定性。25. 育種的準備工作有哪些？誘變的結果是產生變異，負變機率高于正變。高產突變型是多基因決定，需要多代誘發(fā)突變逐漸積累。誘變育種工作包括：誘發(fā)突變、突變株的篩選和高產突變株最佳環(huán)境條件的調整。在誘變育種前，應該對大生產的設備和工藝具有相當?shù)闹R和全面的了解。誘變的工作量大，周期長,事先要做好充分的準備。1、 誘變前對出發(fā)菌株的了解 1. 區(qū)分不同菌落類型 2. 出現(xiàn)不同菌落類

23、型原因 遺傳因素造成的菌落變化 非遺傳因素造成的菌落變化：培養(yǎng)基組成；培養(yǎng)基來源與質量；平板厚度；菌落密度；菌的不同的生長階段。2、 全面了解菌種特性及其與生產性能的關系 考查生活史：如土霉素菌種原先要培養(yǎng)12d其實是包含了三代的生活周期。各代高產性能不同。研究菌種的某些生物學特性與產量合成的相關性：頂頭孢菌素C的產量，隨著其產生菌頂頭孢霉菌的節(jié)孢子體積增大或數(shù)量增加而提高?？疾炀浯笮『皖伾?，如灰黃霉素產生菌蕁麻青霉紫色素越深，灰黃霉素產率越低。 三、了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素 1、培養(yǎng)基的選擇2、培養(yǎng)基斜面制備技術3、接種密度4、培養(yǎng)溫度5、培養(yǎng)濕度6、試劑和原材料質量 四、了解產物各

24、組分與培養(yǎng)條件的關系 如刺孢小單孢菌產生的慶大霉素，其中的C1是有效的，C2是無效的，培養(yǎng)基中加入適量的磷和蛋白胨及加大通風都有利于C1的合成，反之，C2的比例就上升。 五、快速準確的檢測方法 建立一個適應于大規(guī)模篩選的有效檢測方法是減少誘變選育工作量的關鍵。 六、最佳的菌種保藏方法事先要建立一個最佳的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和適宜的保藏方法，否則將前功盡棄。26. 誘變育種的基本路線是怎樣的？誘變育種的優(yōu)缺點 優(yōu)點：方法簡單、投資少、收獲大；缺點：缺乏定向性。誘變育種的步驟和方法：出發(fā)菌株的選擇單孢子菌懸液的制備誘變劑及誘變劑量的選擇誘變的處理方法純化分離等。27.試設計誘變選育營養(yǎng)缺陷型菌株、產蛋

25、白酶細菌、產有機酸霉菌的整個方案，并做出說明。28.什么是增變菌株？29.誘變劑的最適劑量如何選擇？ 合適劑量：應使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大的比例。 最適劑量：能擴大變異幅度又能促使變異移向正向突變范圍的劑量。經長期誘變的高產菌株：低劑量處理。遺傳性狀不太穩(wěn)定的菌株：用較溫和的誘變劑和較低的劑量處理。要篩選具有特殊性狀或較大幅度提高產量的菌株：可以用強誘變劑和高劑量處理。誘變史較短的野生低產菌株：開始宜采用較高劑量，而后逐步用溫和誘變劑低劑量處理。多核細胞菌株：較高劑量處理。30. 誘變劑對產量性狀的誘變趨勢是怎樣的？處理劑量大，殺菌率高，在單位存活細胞中負變菌株多，正變菌株少。

26、經長期誘變的高產菌株，正突變率的高峰多出現(xiàn)在低劑量區(qū)，負變率在高劑量時更高。誘變史短的低產菌株，正變株的高峰比負變株高得多，小劑量誘變處理時正突變株多。31. 影響突變率有哪幾個因素？（一）菌種遺傳特性不同 5-BU對靜止或休眠細胞不起作用；紫外線、電離輻射、烷化基、亞硝酸等對分裂細胞和靜止孢子都有效。（二）細胞壁結構絲狀菌孢子壁較厚，表面蠟質也會阻礙誘變劑滲入?；蛐栌孟匆路邸⒅久浮⒈砻婊钚詣┑忍幚砣コ炠|。（3） 環(huán)境條件的影響1、誘變前預培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)預培養(yǎng)：培養(yǎng)基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、吖啶黃、b重氮尿嘧啶、嘌呤等物質能提高突變率。后培養(yǎng)：誘變后的菌懸液不直接分離于平板，而是立

27、即轉移到營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代。作用是讓突變體重新調節(jié)代謝平衡，避免突變體表型延遲現(xiàn)象。2、溫度、pH、氧氣等外界條件對誘變效應的影響 化學誘變因子: T，速度。 最適pH：避免誘變劑分解而失去誘變效應。 輻射因子、紫外線：氧氣充足有利于突變發(fā)生。3、平皿密度效應 密度要適中，不能過密。32. 一般篩選程序是怎樣的？第一輪：一個出發(fā)菌株誘變處理選出200個菌株初篩每瓶一株選出50株復篩每株4瓶選出3-5株第二輪：4個出發(fā)菌株誘變處理4*100株初篩每瓶一株選出50株 復篩每株4瓶選出3-5株33. 簡述瓊脂塊大通量篩選方法的過程和特點適用對象：抗生素、酶類產物。 優(yōu)點：效率提高15-20倍

28、。 缺點：產物濃度高時易漏篩，培養(yǎng)條件與發(fā)酵條件差距大。 方法：瓊脂塊擴散圈和溶劑抽提法。 準確性：較直接分離在平皿上判斷活性法要準確。10、 什么是正交表？正交表的代號表示什么？正交表的常用分析方法包括哪兩種？ 正交表記為 Ln（mk），m是各因素的水平，k （列數(shù)）是因素的個數(shù)，n 是安排試驗的次數(shù)（行數(shù)）。正交表的記號：L9（34）表示 4 個因素，每個因素取 3 個水平的正交表。 L9（34）4因素3水平正交試驗，共做9次試驗，而全面試驗要做 34=81 次，減少了72次。方差分析和標準差分析。11、什么是營養(yǎng)缺陷型？原養(yǎng)型？野生型？野生型菌株：從自然界分離到的未經誘變的原始菌株。營養(yǎng)

29、缺陷型：野生型菌株經過人工誘變或自然突變失去合成某種營養(yǎng)（氨基酸、維生素、核酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長。原養(yǎng)型：營養(yǎng)缺陷型菌株經回復突變或重組變異后產生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。12、 什么是完全培養(yǎng)基？基本培養(yǎng)基？補充培養(yǎng)基？基本培養(yǎng)基(MM)- 完全培養(yǎng)基(CM)+ 補充培養(yǎng)基(SM)A、B13、 試述營養(yǎng)缺陷型菌株誘變選育的基本過程。一般包括誘發(fā)突變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型、鑒別缺陷種類。14、 營養(yǎng)缺陷型檢出有哪幾種常用方法？原理如何? 1. 點植對照法 2. 影印法 3. 夾層法 4. 限量補充培養(yǎng)法15、 營養(yǎng)缺陷型缺陷類型測定和

30、生長譜測定的基本原理是什么？營養(yǎng)缺陷型的鑒定 確定菌株屬于哪一類營養(yǎng)缺陷型或缺哪一種營養(yǎng)因子.1、鑒定方法 （1）一種營養(yǎng)因子，多株菌； （2）一個菌株，多種營養(yǎng)因子（生長譜法）。2、鑒定步驟 測定缺陷型菌株所需生長因子的類別 具體測缺陷該類別物質中的哪種因子 用單一生長因子復證試驗（1）缺陷型類別的測定 氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨：氨基酸； 酵母浸出液：氨基酸、維生素、堿基混合物； 維生素混合物：維生素； 核酸堿基混合液或酵母核酸水解物：堿基。16、 什么是溫敏突變株？ 特性 TS突變株：對溫度敏感的條件致死突變。 突變類型：錯義突變： 生化特性：酶活力受溫度控制，17、 噬菌體分離和

31、效價測定有哪四種常用方法？烈性噬菌體及其效價的測定1、重層瓊脂法：彌補平皿底面不平，使噬菌斑較大。2、單層平板法：只求驗證是否存在噬菌體，不求計數(shù)。3、快速測定法：低濃度瓊脂，借助放大設備，適合工業(yè)發(fā)酵中早期檢測。4、斑點試驗法：將宿主菌涂布平板，不同稀釋度待測試樣點于平板，培養(yǎng)后，根據(jù)噬菌斑形成與否判斷噬菌體效價。34.什么是初級代謝和次級代謝？一、初級代謝和初級代謝產物 1. 分解代謝體系：糖、脂、蛋白質 2. 素材性生物合成體系：氨基酸、核苷酸 3. 結構性生物合成體系： 蛋白質、核酸、多糖、類脂二、次級代謝和次級代謝產物次級代謝產物是對產生它們的生物本身不需要的一種產物。如抗生素、生長

32、刺激素、生物堿、色素、毒素以及甾體。35.初級代謝調節(jié)最有效的手段是什么？微生物細胞內的所有生化反應都是在酶的催化下進行的，因此對酶的調節(jié)控制是主要的、最有效的調控方式。1. 反饋阻遏：調節(jié)酶的合成量。2. 反饋抑制：調節(jié)現(xiàn)成酶分子的催化活力。 36.酶合成調節(jié)與酶活性調節(jié)的區(qū)別。酶合成的調節(jié)：通過調節(jié)酶的合成量進而調節(jié)代謝速度的調節(jié)機制，這是一種在基因水平上的代謝調節(jié)。酶活性的調節(jié)前體激活：后面的反應被前面的中間產物所促進。反饋抑制：末端代謝產物過量抑制前面的酶活性。37. 反饋阻遏和反饋抑制的區(qū)別。反饋抑制是通過調節(jié)變構酶的活力得以實現(xiàn)，因為不涉及蛋白質的合成過程，調節(jié)的效果比較直接而快速

33、。反饋阻遏是對酶合成的阻遏，是基因轉錄水平上的代謝調節(jié)，效果不及反饋抑制那樣迅速。 38. 什么是誘導和阻遏？誘導 組成酶：細胞固有的酶類，其合成是在相應的基因控制下進行，“與生俱來”。 誘導酶：細胞為適應外來底物或其結構類似物而臨時合成的一類酶，“后天學習” 。 （1）同時誘導：誘導物加入后，微生物能同時或幾乎同時誘導幾種酶的合成，主要存在于短的代謝途徑中。 （2）順序誘導：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達到對復雜代謝途徑的分段調節(jié)。阻遏 通過阻遏作用來阻礙代謝途徑中包括關鍵酶在內的一系列酶的生物合成，從而更徹底地控制代謝和減少末端產物的合成。 末端產物阻遏：由某代

34、謝途徑末端產物過量累積而引起的阻遏。 分解代謝物阻遏：有兩種碳源（或氮源）分解底物存在時，細胞利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的低物的有關分解酶合成的現(xiàn)象。39.什么是末端產物阻遏和分解代謝物阻遏？見上。40.反饋抑制有哪6種基本類型？1、直線式代謝途徑中的反饋抑制2、分支代謝途徑中的反饋抑制(1) 協(xié)同反饋抑制 (2)累積反饋抑制(3)增效反饋抑制 （4）順序反饋抑制（5）同工酶調節(jié)41. 什么是代謝調節(jié)控制育種？其常用方法有哪些？通過定向選育某種特定的突變型，改變代謝通路、降低支路代謝終產物的產生或切斷支路代謝途徑及提高細胞膜的透性，以達到大量積累有益產物的目的。42. 組成型突變株和抗分

35、解調節(jié)突變株選育的基本方法有哪些？1、限量誘導物恒化培養(yǎng)將菌種誘變后移接到低濃度誘導物的衡化器中連續(xù)培養(yǎng)。2、 循環(huán)培養(yǎng) 在含誘導物和不含誘導物的培養(yǎng)基上交替連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)。3、 鑒別性培養(yǎng)基的利用 以甘油為唯一碳源，菌落上噴O-硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG），通過顯示來判斷半乳糖苷組成型突變株。 4、篩選 用誘導能力低，但能作為良好碳源的誘導物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，突變體良好生長，野生型不能生長。如利用苯-半乳糖苷酶組成型突變株。 （一）解除碳源調節(jié)突變株的選育1、 循環(huán)培養(yǎng)法：快速利用和慢速利用的碳源交替培養(yǎng)2、鑒別性培養(yǎng)基：菌落上噴O-硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG），顯色篩選半乳糖苷酶解

36、除碳源調節(jié)的突變株。3、特殊氮源：用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物為惟一氮源配制成培養(yǎng)基。4、葡萄糖結構類似物 如2-脫氧葡萄糖（2-dG）和3-O-甲基葡萄糖（3-mG），不被微生物利用，不被代謝，但可以阻遏誘導酶的合成。 篩選方法：低濃度葡萄糖類似物及一種生長碳源。 抗性突變株的性質：抗分解阻遏突變型。（2） 解除氮源分解調節(jié)突變株的選育含氮底物的酶受到快速利用的氮源阻遏，銨鹽和其他快速利用的氮源對抗生素的生物合成具有分解調節(jié)作用。（三）解除磷酸鹽調節(jié)突變株的選育1、磷酸鹽對次生產物的調節(jié)機制 通過初級代謝的變化影響次級代謝；可以加強初級代謝，或者改變糖類的分解代謝途徑，或者限制抗生素合成的

37、誘導物。 發(fā)酵中，添加濃度要控制在亞適量水平。2、抗磷酸突變株的篩選方法 43.抗反饋調節(jié)突變株選育有哪三種常用方法？（1） 回復突變引起的抗反饋調節(jié)突變株（2） 耐自身產物突變株選育（3） 抗終產物結構類似物突變株的選育44. 真正的回復突變和基因抑制突變有何不同？回復突變株*野生菌株突變型（抑制基因回復突變株）+野生型（真正的回復突變）45.代謝控制育種的常用手段有哪些？酶合成和酶活性的調節(jié)。46.什么是雜交？雜交育種主要包括哪三類方法？微生物雜交的本質是什么？雜交的意義 優(yōu)點：1、使兩親株的優(yōu)良性狀集中于重組體內，獲得新品種。2、重組體不僅可克服因長期誘變造成的生活力下降，代謝緩慢等缺陷

38、，也可以提高對誘變劑的敏感性。3、總結遺傳物質的轉移和傳遞規(guī)律，豐富并促進遺傳學理論的發(fā)展。雜交育種方法1、常規(guī)雜交育種 利用有性生殖、準性生殖、接合、轉化、轉導、溶源轉換和轉染等自然過程完成。2、原生質體融合育種 酶解破除細胞壁后制備原生質體，然后誘導原生質體融合雜交，雙親本不受親和力限制，甚至可打破種屬間遺傳障礙，獲得遠緣雜交重組體。47. 霉菌的雜交主要是通過什么途徑來實現(xiàn)？酵母的雜交主要通過什么途徑？霉菌雜交育種（一）異核體的形成和獲得方法1. 選擇直接親本 選擇親和力強又攜帶明顯營養(yǎng)標記和輔助標記的菌株作為雜交直接親本。 銜接法或混合法測定親和力。2. 異核體形成的方法（1）完全培養(yǎng)

39、基的混合培養(yǎng)法 配對菌株孢子混合接種于液體完全培養(yǎng)基中，長出年輕菌絲后撕碎攤布于基本培養(yǎng)基平板上，挑取異核體菌絲叢上的孢子。（2） 基本培養(yǎng)基銜接法 蘸取孢子相向劃線，部分銜接。（3） 有限培養(yǎng)基培養(yǎng)法 有限培養(yǎng)基液體培養(yǎng)長出菌絲后撕碎攤布于基本培養(yǎng)基平板上。3. 異核體的檢出在基本培養(yǎng)基平板上長出的菌絲叢，異核體菌絲、同核菌絲、互養(yǎng)菌絲混雜在一起，要進行復證。酵母菌的雜交（一）標記菌株的選擇：營養(yǎng)缺陷型或抗性突變標記（二）酵母雜交方法 1. 子囊孢子的制備：饑餓培養(yǎng)獲得子囊孢子，采用蝸牛酶或勻漿法破除子囊壁。 2. 雜交：啞鈴狀的接合子48. 微生物雜交的基本程序是怎樣的？選擇原始親本誘變篩

40、選直接親本直接親本之間親和力鑒定雜交分離到基本培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選重組體重組體分析鑒定 49.什么是原始親本和直接親本？1、原始親本（1）具有優(yōu)良性狀：高產、代謝快，產孢子能力強等。（2）具有野生型遺傳標記：如孢子顏色等。2、直接親本直接用于雜交配對的菌株，由原始親本菌株經誘變劑處理后選出。（1）性狀優(yōu)良（2）利于篩選的遺傳標記雜交育種最好采用具有明顯遺傳性狀差異大的近親菌株為直接親本。50. 什么是有限培養(yǎng)基？完全培養(yǎng)基（CM）：天然有機物基本培養(yǎng)基（MM）：無機化合物有限培養(yǎng)基（LM）：MM或蒸餾水10%20%CM補充培養(yǎng)基（SM）：MM特定物質發(fā)酵培養(yǎng)基：適合產物合成的培養(yǎng)基51

41、. 雜交育種常用的遺傳標記有哪些？1. 營養(yǎng)缺陷型標記：可選單缺、雙缺或多缺型，通常用雙缺； 2. 抗性標記：抗逆性（耐高溫、高鹽和高pH等）和抗藥性；3. 溫度敏感性標記：許可溫度下生長，非許可溫度下不生長。4. 其他性狀標記：孢子顏色、菌落形態(tài)結構、色素等52.細菌雜交育種主要通過哪三種途徑？53.什么是致育因子？什么是F+、F-和hfr?細菌接合與F性因子接合是指兩個性別不同的微生物細胞之間接觸，遺傳物質轉移、交換、重組，形成一個新個體。細菌結合時的遺傳物質為單向轉移，并且要具有性別（ F性因子）。a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子獨立存在，細胞表面