工業(yè)微生物育種

1、1. 工業(yè)微生物育種在發(fā)酵工業(yè)中的作用如何？其目的是什么？ 工業(yè)微生物育種建立在：（1）遺傳和變異（微生物遺傳學(xué)）的基礎(chǔ)之上；（2）物理和化學(xué)誘變劑的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用；（3）工業(yè)自動(dòng)化（自動(dòng)儀表裝置和微機(jī)）。工業(yè)微生物育種在發(fā)酵工業(yè)中占有重要地位，是決定該發(fā)酵產(chǎn)品能否具有工業(yè)化價(jià)值及發(fā)酵過程成敗與否的關(guān)鍵。2. 工業(yè)微生物發(fā)展經(jīng)歷了哪幾個(gè)階段？ 1)自然選育階段 2)人工誘變選育階段 3)雜交育種階段 4)代謝控制育種階段 5)基因工程育種階段3. 工業(yè)微生物育種的核心指標(biāo)有哪些？1) 在遺傳上必須是穩(wěn)定的。穩(wěn)定性。2) 易于產(chǎn)生許多營養(yǎng)細(xì)胞、孢子或其它繁殖體。3) 必須是純種，不應(yīng)帶有其他雜菌及噬

2、菌體。4) 種子的生長必須旺盛、迅速。5) 產(chǎn)生所需要的產(chǎn)物時(shí)間短。轉(zhuǎn)化率。6) 比較容易分離提純。 7) 有自身保護(hù)機(jī)制，抵抗雜菌污染能力強(qiáng)。 8) 能保持較長的良好經(jīng)濟(jì)性能。產(chǎn)率。9) 菌株對誘變劑處理較敏感，從而可能選育出高產(chǎn)菌株。10）在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，菌株必須產(chǎn)生預(yù)期數(shù)量的目的產(chǎn)物，并保持相對地穩(wěn)定。4. 革蘭氏陽性和陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有何差異？它們對溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？5. 缺壁細(xì)菌有哪些類型和異同？制備缺壁細(xì)菌主要有哪些途徑？原生質(zhì)體：G+菌經(jīng)溶菌酶或青霉素處理；球狀體：G-菌，殘留部分細(xì)胞壁。是研究遺傳規(guī)律和進(jìn)行原生質(zhì)體育種的良好實(shí)驗(yàn)材料。L型細(xì)菌：自發(fā)突變形成細(xì)胞壁缺

3、陷菌株；6. 原生質(zhì)體制備時(shí)，為什么不同微生物要選擇不同的酶？舉例說明。酶在原生質(zhì)體制備中主要用來酶解細(xì)胞壁的，不同的微生物其細(xì)胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。 酵母菌的細(xì)胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)。霉菌的細(xì)胞壁：主要成分是纖維素、幾丁質(zhì)、葡聚糖等 。藻類的細(xì)胞壁：主要成分有纖維素構(gòu)成結(jié)構(gòu)骨架。7. 基因組、基因、密碼子、簡并、同義密碼子的概念是什么？一、基因組1. 原核生物 就是它的整個(gè)染色體，原核生物的基因組較小，DNA的含量低，如E.coli的DNA分子質(zhì)量為2.4×109Da，相當(dāng)于4.2×106bp，含有3000-4000個(gè)基

4、因，SV40病毒僅5個(gè)基因。2. 真核生物 能夠維持配子或配子體正常功能的最低數(shù)目的一套染色體，稱為基因組。分子大，達(dá)到5×1081010bp。重復(fù)序列是基因組結(jié)構(gòu)的一個(gè)特點(diǎn)，原核生物少，真核生物多，真核生物DNA序列（1）單一序列：單拷貝；（2）輕度重復(fù)序列：2-10個(gè)拷貝；（3）中度重復(fù)序列：10-幾百個(gè)拷貝；（4）高度重復(fù)序列：幾百-幾萬個(gè)拷貝。二、基因基因：是一個(gè)遺傳信息單位，對應(yīng)著一段編碼多肽氨基酸順序的不連續(xù)DNA片段?；蚣易澹河梢粋€(gè)基因通過基因重復(fù)而產(chǎn)生兩個(gè)或更多的拷貝而構(gòu)成的一組基因。操縱子：乳糖操縱子多基因家族：簡單多基因家族（每個(gè)重復(fù)單元含有單一的轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄區(qū)

5、），復(fù)雜多基因家族（每個(gè)重復(fù)單元含有多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)）。中心法則：遺傳信息以DNARNA蛋白質(zhì)這種方向進(jìn)行傳遞；反轉(zhuǎn)錄病毒可以由RNA合成DNA。基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，為一系列DNA片段所隔開，編碼序列稱為外顯子，把外顯子割裂的DNA片段稱為內(nèi)含子。擬基因：某些基因因DNA序列發(fā)生變化，在序列上與活性基因相似，但不具有功能、不能編碼蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)座子：能在同一細(xì)胞的不同染色體之間或者同一染色體的不同位點(diǎn)之間轉(zhuǎn)移的一些DNA序列。轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座會(huì)引起極性效應(yīng)插入突變、缺失和倒位等多種遺傳效應(yīng)。3、 遺傳密碼 密碼子：mRNA上三個(gè)連續(xù)的核苷酸決定一個(gè)特定的氨基酸，這三 個(gè)

6、核苷酸稱為密碼子。 簡并：幾種密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象。 同義密碼子：對應(yīng)于同一氨基酸的不同密碼子。 基因組:個(gè)體或細(xì)胞所含的全套基因的總和。在原核生物中為整個(gè)染色體?；?DNA 分子的一個(gè)片段。密碼子:mRNA 分子中以三個(gè)核苷酸為一組，決定一種氨基酸以及多肽鏈合成起始與終止的信號。 簡并:兩種或多種核苷酸三聯(lián)體決定同一種氨基酸。同義密碼子:對應(yīng)同一氨基酸的不同密碼子。8. 起始密碼子和終止密碼子有哪些？起始密碼子：AUG 終止密碼子：UAA UAG UGAmRNA上的堿基順序每3個(gè)堿基用解讀框架劃分開，可決定其所生成蛋白質(zhì)的氨基酸順序，為了使堿基順序作為遺傳信息能正確轉(zhuǎn)譯，通常需要從

7、某個(gè)特定的位置開始轉(zhuǎn)譯。這個(gè)起始點(diǎn)的密碼子就叫做起始密碼子。起始密碼子是定位翻譯開始位置的信號標(biāo)記。AUG 少數(shù)細(xì)菌(屬于原核生物)以GUG(纈氨酸)或UUG為起始密碼子。 蛋白質(zhì)翻譯過程中終止肽鏈合成的信使核糖核酸(mRNA)的三聯(lián)體堿基序列。一般情況下為UAA、UAG和UGA，它們不編碼氨基酸。 9. 什么是可讀框？密碼子閱讀的方向是沿著mRNA的什么方向進(jìn)行？可讀框是以起始密碼子開始，在三聯(lián)體讀框的倍數(shù)后出現(xiàn)終止密碼子之間的一段序列?？勺x框有可能編碼一條多肽鏈或一種蛋白質(zhì)。當(dāng)沒有已知蛋白質(zhì)產(chǎn)物時(shí)，該區(qū)域被稱為可讀框,而當(dāng)確知該可讀框編碼某一蛋白時(shí)，它就被稱為編碼區(qū)，即一個(gè)可讀框

8、是潛在的編碼區(qū)。很多情況下，可讀框即指某個(gè)基因的編碼序列。自起始密碼子到終止密碼子之間的核苷酸三聯(lián)體序列。一般情況下，可讀框即指 某個(gè)基因的編碼序列。由起始子AUG(甲硫氨酸)開始，每三個(gè)為一個(gè)密碼子翻譯，直至遇到終止子。10. 基因突變的特征有哪些，請做簡單解釋。1、 突變的稀有性 自然突變頻率很低，細(xì)菌10-410-10，高等生物10-510-8，不同的生物，不同的基因其突變率相差較大。2、突變的重演性和可逆性 指同種生物的同一基因突變?yōu)橄嗤谋硇?，可以在不同個(gè)體間重復(fù)出現(xiàn)。3、突變的平行性 即可發(fā)生回復(fù)突變，顯性基因可以突變?yōu)殡[性基因，而隱性基因也可以突變?yōu)轱@性基因，前者稱為正向突變，后

9、者稱為回復(fù)突變。4、突變的多方向性與復(fù)等位基因 親緣關(guān)系相近的物種由于遺傳物質(zhì)相近，而發(fā)生相似的基因突變，基因的突變可以向多個(gè)方向進(jìn)行，一個(gè)基因可以突變?yōu)閍1、a2、a3an等而構(gòu)成所謂的復(fù)等位基因。這些復(fù)等位基因可以從野生型基因突變產(chǎn)生，也可以從其它任何一個(gè)突變基因突變產(chǎn)生。5、突變的有害性和有利性 突變大多數(shù)是有害的。這是因?yàn)樯锝?jīng)長期的自然選擇，產(chǎn)生了與外界環(huán)境相同協(xié)調(diào)的關(guān)系，這種關(guān)系一旦因突變而改變便可能干擾內(nèi)部的生理生化過程，所以大部分突變對生物體是不利的。少數(shù)的突變能促進(jìn)和加強(qiáng)某些生命活力，所以是有利的突變。例如作物抗病性，微生物的抗藥性等，這些突變?yōu)樯镞M(jìn)化提供了最有利的條件。1

10、1.突變發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)有哪些修復(fù)突變的機(jī)制？DNA結(jié)構(gòu)被改變后：一種是DNA分子在復(fù)制過程中排除或克服修復(fù)系統(tǒng)的作用而成為突變體；另一種是經(jīng)修復(fù)系統(tǒng)修補(bǔ)后恢復(fù)原有DNA分子結(jié)構(gòu)，不能形成突變體。 微生物修復(fù)系統(tǒng)：光修復(fù)和暗修復(fù)（復(fù)制前修復(fù)和復(fù)制后修復(fù)） 紫外線誘變作用：主要是使DNA單股鏈上的鄰近兩個(gè)嘧啶堿基結(jié)合形成嘧啶二聚體，DNA鏈的結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，失去堿基正常配對，DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄都不能正常進(jìn)行，成為一條有缺口的DNA鏈。12. 什么是表型延遲？怎樣避免表型延遲現(xiàn)象？表型延遲：是指微生物通過自發(fā)突變或人工誘變而產(chǎn)生新的基因型個(gè)體所表現(xiàn)除了的遺傳特性不能在當(dāng)代出現(xiàn)，其表型的出現(xiàn)必須經(jīng)過

11、2代以上的復(fù)制。（1）與誘變劑性質(zhì)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成有關(guān)，有些誘變劑滲入細(xì)胞的速度相當(dāng)慢。（2）若突變發(fā)生在多核細(xì)胞中的某一個(gè)核，該細(xì)胞就成為雜核細(xì)胞了。如果該核突變的基因是唯一控制突變表型的基因，那么突變是隱性的，只有幾代繁殖分裂得到純的核突變細(xì)胞，才能出現(xiàn)由該基因控制的突變表型。（3）原有基因產(chǎn)物的影響 原有基因產(chǎn)物在子細(xì)胞中的濃度隨著繁殖逐步稀釋到最低限度后，突變表型才顯現(xiàn)。13. 誘變劑主要有哪三類？誘變劑：凡能誘發(fā)生物基因突變，并且突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過自發(fā)突變率的物理因子或化學(xué)物質(zhì)。（1） 物理誘變劑，例如，電離輻射、紫外線、電磁波等（2） 化學(xué)誘變劑，如藥品、農(nóng)藥、食品添加劑、調(diào)味品、化

12、妝品、洗滌劑、塑料、著色劑、（3） 生物誘變劑，如真菌的代謝產(chǎn)物、病毒、寄生蟲等。（4） 生物體內(nèi)還有一些內(nèi)源性誘變劑。內(nèi)源性誘變劑是在人體健康異常的情況下產(chǎn)生的，如遺傳因素、內(nèi)分泌紊亂等。14. 簡述紫外線照射誘變育種的原理、方法和基本步驟。1. 紫外線的誘變機(jī)制 紫外線引起： DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)；胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用；DNA鏈的斷裂；嘧啶二聚體的形成（單鏈上相鄰兩個(gè)胸腺嘧啶之間或雙鏈相對應(yīng)的兩個(gè)胸腺嘧啶之間）。最有效波長為253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外線。 絕對劑量單位：erg/mm2相對劑量單位：用照射時(shí)間或殺菌率表示。一般認(rèn)為殺菌率在90%99

13、.9%時(shí)，誘變效果較好。不同微生物所需殺菌時(shí)間15W功率的紫外燈管和固定距離為30cm的條件下照射微生物，要使殺菌率達(dá)到9099.9的效果：芽孢菌約需10 min；照射短小芽孢桿菌的營養(yǎng)體來獲得缺陷型需要13 min；一般微生物營養(yǎng)體照射35min；無芽孢菌和革蘭氏陽性菌只需0.52 min。紫外線誘變的步驟與方法：（1）出發(fā)菌株，把細(xì)菌斜面培養(yǎng)到對數(shù)期，霉菌或放線菌則培養(yǎng)到孢子剛成熟。（2）前培養(yǎng)，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，同時(shí)加入抑制修復(fù)的物質(zhì)（咖啡堿或異煙肼），達(dá)到最佳生理狀態(tài)。（3）制備菌懸液；（4）紫外線照射，暗室進(jìn)行，或誘變后立即浸入冰水中12 h，低溫抑制突變修復(fù)。（5）后培養(yǎng)，根據(jù)延遲

14、現(xiàn)象的原理，照射完畢的菌懸液加入到適合于正突變體繁殖的培養(yǎng)基，在適宜溫度下培養(yǎng)1.52 h。（6）稀釋涂皿，后培養(yǎng)結(jié)束后，從中取一定量培養(yǎng)物，作不同稀釋度，涂皿，并且以未經(jīng)紫外線照射過的菌懸液作對照，培養(yǎng)后，挑取菌落，以待篩選。 15.化學(xué)誘變劑主要有哪四類？化學(xué)誘變劑：是一類能對DNA起作用、改變起結(jié)構(gòu)、并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。包括：堿基類似物、烷化劑、移碼突變劑以及其他種類等?；瘜W(xué)突變劑具有專一性，只對基因的某部位發(fā)生作用?；瘜W(xué)誘變劑的劑量主要決定于其濃度和處理時(shí)間。劑量使用原則：以誘變效應(yīng)大，而副反應(yīng)小為原則。注意：90以上的化學(xué)誘變劑都是致癌物質(zhì)或極毒藥品。使用時(shí)注意自身安全，并防止

15、污染環(huán)境。 一、堿基類似物 是一類和天然的嘌呤嘧啶等四種堿基分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)。既能誘發(fā)正向突變，又能誘發(fā)回復(fù)突變。2、 烷化劑 活性烷基易取代DNA分子中活潑的氫原子，從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，引起突變。3、 脫氨基 亞硝酸的誘變機(jī)制 亞硝酸可直接作用于正在復(fù)制或未復(fù)制的DNA分子，脫去堿基中的氨基變成酮基，改變堿基氨氫鍵的電位，引起轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。還可引起DNA兩條單鏈之間交聯(lián)。4、 移碼誘變劑 移碼誘變劑與DNA相互結(jié)合引起堿基增添或缺失而造成突變。五、羥化劑 羥胺（HA）1. 羥胺的誘變機(jī)制：G:CA:T2. 羥胺的處理方法 六、金屬鹽類七、其他化學(xué)誘變劑1. 秋水仙堿：誘變輔助劑 2.

16、 抗生素: 鏈黑霉素、爭光霉素、絲裂霉素、放線菌素、正定霉素、光輝霉素、阿霉素，誘變輔助劑。 16.烷化劑的作用機(jī)制是什么？主要通過烷化基團(tuán)使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對失誤而引起突變。突變的主要位點(diǎn)：鳥嘌呤的N7，鳥嘌呤的O6、胸腺嘧啶O4突變的次要位點(diǎn)：鳥嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3 17. 簡述亞硝基胍誘變育種的原理、過程和安全注意事項(xiàng)。超級誘變劑之稱，適合誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株，還能使多基因并發(fā)突變。NTG在水溶液中隨不同pH將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物。通常在pH 6.0的條件下進(jìn)行誘變處理，常用磷酸緩沖液和Tris緩沖液。 NTG誘變處理

17、方法：步驟： 新鮮斜面制備菌懸液； 配制NTG母液； 菌懸液和NTG溶液混合保溫處理； 以冷的生理鹽水稀釋洗滌菌體終止反應(yīng)。 平皿分離。其他方法：液體培養(yǎng)后直接加入NTG；NTG與瓊脂和菌液混合制平板。 注意：NTG是一種強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，操作時(shí)要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過NTG的器皿必須及時(shí)、單獨(dú)處理，例用自來水大量沖洗或用1-2N的NaOH浸泡過夜，洗凈。18.生物誘變劑按照誘變方式主要分為哪三類? 1）轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)突變2）轉(zhuǎn)化誘發(fā)突變3）轉(zhuǎn)座誘發(fā)突變19. 什么是菌株分離和篩選？菌株分離：就是將一個(gè)混雜著各種微生物的樣品通過分離技術(shù)區(qū)分開，并按照實(shí)際

18、要求和菌株的特性采取迅速、準(zhǔn)確、有效方法對它們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需微生物的過程。 20. 分離篩選的基本步驟有哪些？菌種的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產(chǎn)物鑒別這幾個(gè)步驟。 21. 抑制不需要菌類的常用方法有哪些？通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數(shù)量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達(dá)到富集的目的。 高溫處理抑制不產(chǎn)芽孢菌； 膽鹽和十二烷基磺酸鈉抑制革蘭陽性菌 ；硫乙醇酸鈉 抑制好氧菌；四環(huán)素等抗生素抑制細(xì)菌 ；重鉻酸鉀抑制土壤真菌、細(xì)菌 。22. 好氣微生物分離的常用方法有哪些？它們的原理如何?粗放：菌落純 細(xì)化：菌株純、細(xì)胞純（1） 稀釋涂布法 （二）劃線

19、分離法 （三）利用平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離 1、透明圈法 混濁底物被分解后形成透明圈。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、有機(jī)酸等。 2、變色圈法：直接用顯色劑或指示劑 果膠酶：剛果紅（絳紅色水解圈）谷氨酸：溴百里酚蘭（pH 6.2以下為黃色， pH 7.6以上為藍(lán)色）內(nèi)肽酶：吲羥乙酸酯被產(chǎn)酶菌落水解為3-羥基吲哚，后者氧化成藍(lán)色物質(zhì)）乙醇：藍(lán)色的鹽類物質(zhì)在醇脫氫酶和NAD作用下反應(yīng)產(chǎn)生電子脫色，形成淡白色暈圈。 3、生長圈法 用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。 利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物（營養(yǎng)缺陷型菌株）作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生

20、長，形成生長圈 。 4. 抑菌圈法 常用于抗生素產(chǎn)生菌的 分離篩選。 （四）組織分離 1. 對一般有病組織的分離方法清洗組織表面0.1升汞表面消毒無菌水沖洗適宜溫度培養(yǎng)挑取菌落2. 食用菌孢子分離方法（1）組織塊分離法：組織塊切小塊，斜面直接培養(yǎng)。（2）多孢子分離：表面消毒，孢子采集。（3）單孢子分離：收集到的孢子稀釋涂布培養(yǎng)。（五）單細(xì)胞或單孢子分離法1、顯微挑取法 采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng) 。2. 小滴分離純化培養(yǎng)法（六）特殊菌類環(huán)保降解菌的分離多環(huán)芳烴、有機(jī)染料和顏料、表面活性劑、農(nóng)藥、酚類和鹵代烴。分離篩選這類物質(zhì)的降解微生物時(shí)，通常采用

21、以該物質(zhì)為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)。23. 平皿生化反應(yīng)分離有哪些主要方法？原理如何？見22。24. 如何用焦性沒食子酸法分離厭氣菌？焦性沒食子酸和NaOH互相反應(yīng)除去氧氣。除去100ml空氣中的氧氣需要焦性沒食子酸固體1g和10%NaOH溶液10ml。無菌培養(yǎng)皿一套，在皿蓋內(nèi)到上分離培養(yǎng)基，凝固后，皿底一側(cè)放焦性沒食子酸固體，另一側(cè)放10% NaOH溶液，使二者不相接觸。分離操作后，搖動(dòng)平皿使焦性沒食子酸固體和NaOH溶液混合，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，除去皿內(nèi)的氧氣。 25.初篩和復(fù)篩的要求有什么不同？初篩是指從大量的菌落中隨機(jī)挑取進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)并通過檢測得到一些較優(yōu)菌株。復(fù)篩是指將初篩得到的

22、較優(yōu)菌株再進(jìn)行多次搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其效價(jià)和傳代穩(wěn)定性，并從中得到一兩個(gè)或少數(shù)幾個(gè)最優(yōu)的菌株。 通過定義可以知道，復(fù)篩不僅要將初篩得到的菌種進(jìn)行再次發(fā)酵驗(yàn)證，還需要進(jìn)行傳代驗(yàn)證，就是傳很多代，每代或隔代進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，看齊穩(wěn)定性。25. 育種的準(zhǔn)備工作有哪些？誘變的結(jié)果是產(chǎn)生變異，負(fù)變機(jī)率高于正變。高產(chǎn)突變型是多基因決定，需要多代誘發(fā)突變逐漸積累。誘變育種工作包括：誘發(fā)突變、突變株的篩選和高產(chǎn)突變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整。在誘變育種前，應(yīng)該對大生產(chǎn)的設(shè)備和工藝具有相當(dāng)?shù)闹R和全面的了解。誘變的工作量大，周期長,事先要做好充分的準(zhǔn)備。1、 誘變前對出發(fā)菌株的了解 1. 區(qū)分不同菌落類型 2. 出現(xiàn)不同菌落類

23、型原因 遺傳因素造成的菌落變化 非遺傳因素造成的菌落變化：培養(yǎng)基組成；培養(yǎng)基來源與質(zhì)量；平板厚度；菌落密度；菌的不同的生長階段。2、 全面了解菌種特性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)系 考查生活史：如土霉素菌種原先要培養(yǎng)12d其實(shí)是包含了三代的生活周期。各代高產(chǎn)性能不同。研究菌種的某些生物學(xué)特性與產(chǎn)量合成的相關(guān)性：頂頭孢菌素C的產(chǎn)量，隨著其產(chǎn)生菌頂頭孢霉菌的節(jié)孢子體積增大或數(shù)量增加而提高?？疾炀浯笮『皖伾?，如灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉紫色素越深，灰黃霉素產(chǎn)率越低。 三、了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素 1、培養(yǎng)基的選擇2、培養(yǎng)基斜面制備技術(shù)3、接種密度4、培養(yǎng)溫度5、培養(yǎng)濕度6、試劑和原材料質(zhì)量 四、了解產(chǎn)物各

24、組分與培養(yǎng)條件的關(guān)系 如刺孢小單孢菌產(chǎn)生的慶大霉素，其中的C1是有效的，C2是無效的，培養(yǎng)基中加入適量的磷和蛋白胨及加大通風(fēng)都有利于C1的合成，反之，C2的比例就上升。 五、快速準(zhǔn)確的檢測方法 建立一個(gè)適應(yīng)于大規(guī)模篩選的有效檢測方法是減少誘變選育工作量的關(guān)鍵。 六、最佳的菌種保藏方法事先要建立一個(gè)最佳的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和適宜的保藏方法，否則將前功盡棄。26. 誘變育種的基本路線是怎樣的？誘變育種的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、投資少、收獲大；缺點(diǎn)：缺乏定向性。誘變育種的步驟和方法：出發(fā)菌株的選擇單孢子菌懸液的制備誘變劑及誘變劑量的選擇誘變的處理方法純化分離等。27.試設(shè)計(jì)誘變選育營養(yǎng)缺陷型菌株、產(chǎn)蛋

25、白酶細(xì)菌、產(chǎn)有機(jī)酸霉菌的整個(gè)方案，并做出說明。28.什么是增變菌株？29.誘變劑的最適劑量如何選擇？ 合適劑量：應(yīng)使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大的比例。 最適劑量：能擴(kuò)大變異幅度又能促使變異移向正向突變范圍的劑量。經(jīng)長期誘變的高產(chǎn)菌株：低劑量處理。遺傳性狀不太穩(wěn)定的菌株：用較溫和的誘變劑和較低的劑量處理。要篩選具有特殊性狀或較大幅度提高產(chǎn)量的菌株：可以用強(qiáng)誘變劑和高劑量處理。誘變史較短的野生低產(chǎn)菌株：開始宜采用較高劑量，而后逐步用溫和誘變劑低劑量處理。多核細(xì)胞菌株：較高劑量處理。30. 誘變劑對產(chǎn)量性狀的誘變趨勢是怎樣的？處理劑量大，殺菌率高，在單位存活細(xì)胞中負(fù)變菌株多，正變菌株少。

26、經(jīng)長期誘變的高產(chǎn)菌株，正突變率的高峰多出現(xiàn)在低劑量區(qū)，負(fù)變率在高劑量時(shí)更高。誘變史短的低產(chǎn)菌株，正變株的高峰比負(fù)變株高得多，小劑量誘變處理時(shí)正突變株多。31. 影響突變率有哪幾個(gè)因素？（一）菌種遺傳特性不同 5-BU對靜止或休眠細(xì)胞不起作用；紫外線、電離輻射、烷化基、亞硝酸等對分裂細(xì)胞和靜止孢子都有效。（二）細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)絲狀菌孢子壁較厚，表面蠟質(zhì)也會(huì)阻礙誘變劑滲入?；蛐栌孟匆路邸⒅久?、表面活性劑等處理去除蠟質(zhì)。（3） 環(huán)境條件的影響1、誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)：培養(yǎng)基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、吖啶黃、b重氮尿嘧啶、嘌呤等物質(zhì)能提高突變率。后培養(yǎng)：誘變后的菌懸液不直接分離于平板，而是立

27、即轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代。作用是讓突變體重新調(diào)節(jié)代謝平衡，避免突變體表型延遲現(xiàn)象。2、溫度、pH、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響 化學(xué)誘變因子: T，速度。 最適pH：避免誘變劑分解而失去誘變效應(yīng)。 輻射因子、紫外線：氧氣充足有利于突變發(fā)生。3、平皿密度效應(yīng) 密度要適中，不能過密。32. 一般篩選程序是怎樣的？第一輪：一個(gè)出發(fā)菌株誘變處理選出200個(gè)菌株初篩每瓶一株選出50株復(fù)篩每株4瓶選出3-5株第二輪：4個(gè)出發(fā)菌株誘變處理4*100株初篩每瓶一株選出50株 復(fù)篩每株4瓶選出3-5株33. 簡述瓊脂塊大通量篩選方法的過程和特點(diǎn)適用對象：抗生素、酶類產(chǎn)物。 優(yōu)點(diǎn)：效率提高15-20倍

28、。 缺點(diǎn)：產(chǎn)物濃度高時(shí)易漏篩，培養(yǎng)條件與發(fā)酵條件差距大。 方法：瓊脂塊擴(kuò)散圈和溶劑抽提法。 準(zhǔn)確性：較直接分離在平皿上判斷活性法要準(zhǔn)確。10、 什么是正交表？正交表的代號表示什么？正交表的常用分析方法包括哪兩種？ 正交表記為 Ln（mk），m是各因素的水平，k （列數(shù)）是因素的個(gè)數(shù)，n 是安排試驗(yàn)的次數(shù)（行數(shù)）。正交表的記號：L9（34）表示 4 個(gè)因素，每個(gè)因素取 3 個(gè)水平的正交表。 L9（34）4因素3水平正交試驗(yàn)，共做9次試驗(yàn)，而全面試驗(yàn)要做 34=81 次，減少了72次。方差分析和標(biāo)準(zhǔn)差分析。11、什么是營養(yǎng)缺陷型？原養(yǎng)型？野生型？野生型菌株：從自然界分離到的未經(jīng)誘變的原始菌株。營養(yǎng)

29、缺陷型：野生型菌株經(jīng)過人工誘變或自然突變失去合成某種營養(yǎng)（氨基酸、維生素、核酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長。原養(yǎng)型：營養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組變異后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。12、 什么是完全培養(yǎng)基？基本培養(yǎng)基？補(bǔ)充培養(yǎng)基？基本培養(yǎng)基(MM)- 完全培養(yǎng)基(CM)+ 補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)A、B13、 試述營養(yǎng)缺陷型菌株誘變選育的基本過程。一般包括誘發(fā)突變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型、鑒別缺陷種類。14、 營養(yǎng)缺陷型檢出有哪幾種常用方法？原理如何? 1. 點(diǎn)植對照法 2. 影印法 3. 夾層法 4. 限量補(bǔ)充培養(yǎng)法15、 營養(yǎng)缺陷型缺陷類型測定和

30、生長譜測定的基本原理是什么？營養(yǎng)缺陷型的鑒定 確定菌株屬于哪一類營養(yǎng)缺陷型或缺哪一種營養(yǎng)因子.1、鑒定方法 （1）一種營養(yǎng)因子，多株菌； （2）一個(gè)菌株，多種營養(yǎng)因子（生長譜法）。2、鑒定步驟 測定缺陷型菌株所需生長因子的類別 具體測缺陷該類別物質(zhì)中的哪種因子 用單一生長因子復(fù)證試驗(yàn)（1）缺陷型類別的測定 氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨：氨基酸； 酵母浸出液：氨基酸、維生素、堿基混合物； 維生素混合物：維生素； 核酸堿基混合液或酵母核酸水解物：堿基。16、 什么是溫敏突變株？ 特性 TS突變株：對溫度敏感的條件致死突變。 突變類型：錯(cuò)義突變： 生化特性：酶活力受溫度控制，17、 噬菌體分離和

31、效價(jià)測定有哪四種常用方法？烈性噬菌體及其效價(jià)的測定1、重層瓊脂法：彌補(bǔ)平皿底面不平，使噬菌斑較大。2、單層平板法：只求驗(yàn)證是否存在噬菌體，不求計(jì)數(shù)。3、快速測定法：低濃度瓊脂，借助放大設(shè)備，適合工業(yè)發(fā)酵中早期檢測。4、斑點(diǎn)試驗(yàn)法：將宿主菌涂布平板，不同稀釋度待測試樣點(diǎn)于平板，培養(yǎng)后，根據(jù)噬菌斑形成與否判斷噬菌體效價(jià)。34.什么是初級代謝和次級代謝？一、初級代謝和初級代謝產(chǎn)物 1. 分解代謝體系：糖、脂、蛋白質(zhì) 2. 素材性生物合成體系：氨基酸、核苷酸 3. 結(jié)構(gòu)性生物合成體系： 蛋白質(zhì)、核酸、多糖、類脂二、次級代謝和次級代謝產(chǎn)物次級代謝產(chǎn)物是對產(chǎn)生它們的生物本身不需要的一種產(chǎn)物。如抗生素、生長

32、刺激素、生物堿、色素、毒素以及甾體。35.初級代謝調(diào)節(jié)最有效的手段是什么？微生物細(xì)胞內(nèi)的所有生化反應(yīng)都是在酶的催化下進(jìn)行的，因此對酶的調(diào)節(jié)控制是主要的、最有效的調(diào)控方式。1. 反饋?zhàn)瓒簦赫{(diào)節(jié)酶的合成量。2. 反饋抑制：調(diào)節(jié)現(xiàn)成酶分子的催化活力。 36.酶合成調(diào)節(jié)與酶活性調(diào)節(jié)的區(qū)別。酶合成的調(diào)節(jié)：通過調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，這是一種在基因水平上的代謝調(diào)節(jié)。酶活性的調(diào)節(jié)前體激活：后面的反應(yīng)被前面的中間產(chǎn)物所促進(jìn)。反饋抑制：末端代謝產(chǎn)物過量抑制前面的酶活性。37. 反饋?zhàn)瓒艉头答佉种频膮^(qū)別。反饋抑制是通過調(diào)節(jié)變構(gòu)酶的活力得以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)椴簧婕暗鞍踪|(zhì)的合成過程，調(diào)節(jié)的效果比較直接而快速

33、。反饋?zhàn)瓒羰菍γ负铣傻淖瓒?，是基因轉(zhuǎn)錄水平上的代謝調(diào)節(jié)，效果不及反饋抑制那樣迅速。 38. 什么是誘導(dǎo)和阻遏？誘導(dǎo) 組成酶：細(xì)胞固有的酶類，其合成是在相應(yīng)的基因控制下進(jìn)行，“與生俱來”。 誘導(dǎo)酶：細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的一類酶，“后天學(xué)習(xí)” 。 （1）同時(shí)誘導(dǎo)：誘導(dǎo)物加入后，微生物能同時(shí)或幾乎同時(shí)誘導(dǎo)幾種酶的合成，主要存在于短的代謝途徑中。 （2）順序誘導(dǎo)：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達(dá)到對復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。阻遏 通過阻遏作用來阻礙代謝途徑中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的生物合成，從而更徹底地控制代謝和減少末端產(chǎn)物的合成。 末端產(chǎn)物阻遏：由某代

34、謝途徑末端產(chǎn)物過量累積而引起的阻遏。 分解代謝物阻遏：有兩種碳源（或氮源）分解底物存在時(shí)，細(xì)胞利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的低物的有關(guān)分解酶合成的現(xiàn)象。39.什么是末端產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏？見上。40.反饋抑制有哪6種基本類型？1、直線式代謝途徑中的反饋抑制2、分支代謝途徑中的反饋抑制(1) 協(xié)同反饋抑制 (2)累積反饋抑制(3)增效反饋抑制 （4）順序反饋抑制（5）同工酶調(diào)節(jié)41. 什么是代謝調(diào)節(jié)控制育種？其常用方法有哪些？通過定向選育某種特定的突變型，改變代謝通路、降低支路代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)生或切斷支路代謝途徑及提高細(xì)胞膜的透性，以達(dá)到大量積累有益產(chǎn)物的目的。42. 組成型突變株和抗分

35、解調(diào)節(jié)突變株選育的基本方法有哪些？1、限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)將菌種誘變后移接到低濃度誘導(dǎo)物的衡化器中連續(xù)培養(yǎng)。2、 循環(huán)培養(yǎng) 在含誘導(dǎo)物和不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上交替連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)。3、 鑒別性培養(yǎng)基的利用 以甘油為唯一碳源，菌落上噴O-硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG），通過顯示來判斷半乳糖苷組成型突變株。 4、篩選 用誘導(dǎo)能力低，但能作為良好碳源的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，突變體良好生長，野生型不能生長。如利用苯-半乳糖苷酶組成型突變株。 （一）解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育1、 循環(huán)培養(yǎng)法：快速利用和慢速利用的碳源交替培養(yǎng)2、鑒別性培養(yǎng)基：菌落上噴O-硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG），顯色篩選半乳糖苷酶解

36、除碳源調(diào)節(jié)的突變株。3、特殊氮源：用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物為惟一氮源配制成培養(yǎng)基。4、葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物 如2-脫氧葡萄糖（2-dG）和3-O-甲基葡萄糖（3-mG），不被微生物利用，不被代謝，但可以阻遏誘導(dǎo)酶的合成。 篩選方法：低濃度葡萄糖類似物及一種生長碳源。 抗性突變株的性質(zhì)：抗分解阻遏突變型。（2） 解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的選育含氮底物的酶受到快速利用的氮源阻遏，銨鹽和其他快速利用的氮源對抗生素的生物合成具有分解調(diào)節(jié)作用。（三）解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育1、磷酸鹽對次生產(chǎn)物的調(diào)節(jié)機(jī)制 通過初級代謝的變化影響次級代謝；可以加強(qiáng)初級代謝，或者改變糖類的分解代謝途徑，或者限制抗生素合成的

37、誘導(dǎo)物。 發(fā)酵中，添加濃度要控制在亞適量水平。2、抗磷酸突變株的篩選方法 43.抗反饋調(diào)節(jié)突變株選育有哪三種常用方法？（1） 回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株（2） 耐自身產(chǎn)物突變株選育（3） 抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育44. 真正的回復(fù)突變和基因抑制突變有何不同？回復(fù)突變株*野生菌株突變型（抑制基因回復(fù)突變株）+野生型（真正的回復(fù)突變）45.代謝控制育種的常用手段有哪些？酶合成和酶活性的調(diào)節(jié)。46.什么是雜交？雜交育種主要包括哪三類方法？微生物雜交的本質(zhì)是什么？雜交的意義 優(yōu)點(diǎn)：1、使兩親株的優(yōu)良性狀集中于重組體內(nèi)，獲得新品種。2、重組體不僅可克服因長期誘變造成的生活力下降，代謝緩慢等缺陷

38、，也可以提高對誘變劑的敏感性。3、總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，豐富并促進(jìn)遺傳學(xué)理論的發(fā)展。雜交育種方法1、常規(guī)雜交育種 利用有性生殖、準(zhǔn)性生殖、接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶源轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)染等自然過程完成。2、原生質(zhì)體融合育種 酶解破除細(xì)胞壁后制備原生質(zhì)體，然后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合雜交，雙親本不受親和力限制，甚至可打破種屬間遺傳障礙，獲得遠(yuǎn)緣雜交重組體。47. 霉菌的雜交主要是通過什么途徑來實(shí)現(xiàn)？酵母的雜交主要通過什么途徑？霉菌雜交育種（一）異核體的形成和獲得方法1. 選擇直接親本 選擇親和力強(qiáng)又?jǐn)y帶明顯營養(yǎng)標(biāo)記和輔助標(biāo)記的菌株作為雜交直接親本。 銜接法或混合法測定親和力。2. 異核體形成的方法（1）完全培養(yǎng)

39、基的混合培養(yǎng)法 配對菌株孢子混合接種于液體完全培養(yǎng)基中，長出年輕菌絲后撕碎攤布于基本培養(yǎng)基平板上，挑取異核體菌絲叢上的孢子。（2） 基本培養(yǎng)基銜接法 蘸取孢子相向劃線，部分銜接。（3） 有限培養(yǎng)基培養(yǎng)法 有限培養(yǎng)基液體培養(yǎng)長出菌絲后撕碎攤布于基本培養(yǎng)基平板上。3. 異核體的檢出在基本培養(yǎng)基平板上長出的菌絲叢，異核體菌絲、同核菌絲、互養(yǎng)菌絲混雜在一起，要進(jìn)行復(fù)證。酵母菌的雜交（一）標(biāo)記菌株的選擇：營養(yǎng)缺陷型或抗性突變標(biāo)記（二）酵母雜交方法 1. 子囊孢子的制備：饑餓培養(yǎng)獲得子囊孢子，采用蝸牛酶或勻漿法破除子囊壁。 2. 雜交：啞鈴狀的接合子48. 微生物雜交的基本程序是怎樣的？選擇原始親本誘變篩

40、選直接親本直接親本之間親和力鑒定雜交分離到基本培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選重組體重組體分析鑒定 49.什么是原始親本和直接親本？1、原始親本（1）具有優(yōu)良性狀：高產(chǎn)、代謝快，產(chǎn)孢子能力強(qiáng)等。（2）具有野生型遺傳標(biāo)記：如孢子顏色等。2、直接親本直接用于雜交配對的菌株，由原始親本菌株經(jīng)誘變劑處理后選出。（1）性狀優(yōu)良（2）利于篩選的遺傳標(biāo)記雜交育種最好采用具有明顯遺傳性狀差異大的近親菌株為直接親本。50. 什么是有限培養(yǎng)基？完全培養(yǎng)基（CM）：天然有機(jī)物基本培養(yǎng)基（MM）：無機(jī)化合物有限培養(yǎng)基（LM）：MM或蒸餾水10%20%CM補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）：MM特定物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基：適合產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基51

41、. 雜交育種常用的遺傳標(biāo)記有哪些？1. 營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記：可選單缺、雙缺或多缺型，通常用雙缺； 2. 抗性標(biāo)記：抗逆性（耐高溫、高鹽和高pH等）和抗藥性；3. 溫度敏感性標(biāo)記：許可溫度下生長，非許可溫度下不生長。4. 其他性狀標(biāo)記：孢子顏色、菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)、色素等52.細(xì)菌雜交育種主要通過哪三種途徑？53.什么是致育因子？什么是F+、F-和hfr?細(xì)菌接合與F性因子接合是指兩個(gè)性別不同的微生物細(xì)胞之間接觸，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移、交換、重組，形成一個(gè)新個(gè)體。細(xì)菌結(jié)合時(shí)的遺傳物質(zhì)為單向轉(zhuǎn)移，并且要具有性別（ F性因子）。a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面