幾丁質(zhì)對(duì)南方根結(jié)線蟲的生物防治研究

1、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)畢 業(yè) 論 文（設(shè)計(jì)） 題 目：刀孢蠟蚧菌LecanicilliumpsalloitaeCFCC84958產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對(duì)南方根結(jié)線蟲卵的破壞作用姓 名：XXXXX學(xué) 院：農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院 專 業(yè)： 植物保護(hù) 班 級(jí)：XXXX學(xué) 號(hào)：XXXXX2011年5月20日目錄中文摘要1Abstract2引言31材料與方法61.1供試菌株61.2供試試劑61.3產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)條件61.4幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定6幾丁質(zhì)降解酶系活性測(cè)定6 N-乙酰葡萄糖胺（NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線7幾丁質(zhì)外切酶活性測(cè)定7對(duì)硝基苯酚（pNP）標(biāo)準(zhǔn)曲線71.5刀孢蠟蚧菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對(duì)根結(jié)線蟲卵的破壞81.5.1根結(jié)線蟲卵懸液

2、的制備81.5.2卵孵化抑制率及破壞率的測(cè)定82結(jié)果與分析92.1幾丁質(zhì)降解酶系活性測(cè)定的結(jié)果92.2幾丁質(zhì)外切酶活性測(cè)定的結(jié)果92.3刀孢蠟蚧菌培養(yǎng)濾液對(duì)卵孵化的影響102.4南方根結(jié)線蟲卵殼的形態(tài)變化112.5結(jié)論123討論與展望133.1討論133.2展望13安全性評(píng)價(jià)13根結(jié)線蟲生物防治展望13致謝15參考文獻(xiàn)16刀孢蠟蚧菌Lecanicillium psalloitaeCFCC84958產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對(duì)南方根結(jié)線蟲卵的破壞作用植物保護(hù)專業(yè) XXXX指導(dǎo)教師 XXX摘要：根結(jié)線蟲卵殼主要是由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成。根結(jié)線蟲卵寄生或產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶活性是評(píng)價(jià)食線蟲菌物生物防治潛力的重要生

3、化指標(biāo)之一。本研究分別采用根結(jié)線蟲卵寄生真菌刀孢蠟蚧菌，測(cè)定其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)降解酶活性，該菌的培養(yǎng)濾液從第2d具有幾丁質(zhì)降解酶系活性，第4-6d就達(dá)到酶活性高峰值3.98 mol /h mL；從第2d開始就產(chǎn)生幾丁質(zhì)外切酶，第4d酶活性為0.26umol/h mL。表明刀孢蠟蚧菌CFCC84958菌株具有較高產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的活性。該菌4d的培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵孵化和破壞作用隨濃度的增加而增強(qiáng)，7d后孵化抑制率和破壞率分別為94.52%和84.32%。顯微觀察線蟲卵殼變形和破壞情況的結(jié)果表明，刀孢蠟蚧菌CFCC84958產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可以引致根結(jié)線蟲卵殼的裂解，抑制根結(jié)線蟲卵的孵化。關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲

4、卵；刀孢蠟蚧菌；幾丁質(zhì)酶；卵破壞；卵孵化The Destructive Effect of Chitinase Activities produced by Lecanicillium psalloitaeCFCC84958 on Meloidogyne incognita eggsStudent majoring in Plant Protection XXXXTutor XXXAbstract: The eggshells of Meloidogyne spp. are mainly composed of chitin and protein. The chitinase activit

5、y of fungi which parasitize eggs or produce toxins for Meloidogyne spp. is one of the most important biochemical characters. It is used for evaluating the biocontrol potential of nematophagous fungi. The endochitinase and exodchitinase of Lecanicillium psalloitae CFCC84958were tested with NAG andpNP

6、.The maximum activity of endochitinase was 3.98 mol/h ml during4d-6d and the activity of exodchitinase was 0.26mol/h ml at the 4 d. The results showed that L.psalloitae CFCC84958 had high chitinase activity. After 7 days of incubation with the chitinase produced byL.psalloitae CFCC84958,rates ofhatc

7、hinginhibitory and destruction of eggs achieved 94.52% and 84.32%,respectively. Microscopic observations demonstrated that the eggshell of Meloidogyne spp. was deformed and destroyed. The reseach indicated that chitinase produced by L. psalloitae CFCC84958 caused the lysis of Meloidogyne spp. eggshe

8、lls and resulted in the inhibition of egg hatching in vitro.Key words : Meloidogyne spp. ;Lecanicillium psalloitae; Chitinases；egg destruction; egg hatching引言根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是植物根系定居性內(nèi)寄生物, 繁殖力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng),是當(dāng)前我國(guó)主要的農(nóng)作物病原線蟲之一。據(jù)Sasser & Freekman報(bào)道，植物寄生線蟲每年造成世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的損失約1000億美元,其中根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)每年對(duì)世界

9、上經(jīng)濟(jì)作物造成高達(dá)數(shù)百億美元的損失。從世界范圍內(nèi)看，根結(jié)線蟲為害其寄主作物的損失率約10%，發(fā)生嚴(yán)重的田塊損失達(dá)50%-70%以上，個(gè)別地塊甚至整個(gè)植株死亡。迄今已報(bào)道的根結(jié)線蟲達(dá)80余種, 其中有4個(gè)種,即南方根結(jié)線蟲(M.incognita)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)及北方根結(jié)線蟲(M.hapla)發(fā)生較為普遍，它們?cè)斐傻慕?jīng)濟(jì)損失占整個(gè)根結(jié)線蟲所引起的農(nóng)作物損失的90%以上1。由根結(jié)線蟲為害植物根系所引起的根結(jié)線蟲病是一種世界性分布的土傳病害,給許多國(guó)家的農(nóng)林和園藝等產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。近年來(lái)我國(guó)由于根結(jié)線蟲的危害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成了嚴(yán)重?fù)p失，

10、特別是保護(hù)地蔬菜、煙草和花生等作物。根結(jié)線蟲病害防治的難題是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題。根結(jié)線蟲病害傳統(tǒng)主要采用化學(xué)殺線劑、輪作和使用抗病品種等措施進(jìn)行防治，但這些防治措施都有其局限性?；瘜W(xué)殺線劑的長(zhǎng)期和廣泛使用，使土壤和植物產(chǎn)品農(nóng)藥殘留、資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等問(wèn)題日益突出，以及對(duì)人畜的不安全等，化學(xué)殺線劑已經(jīng)或即將被禁用。如非熏蒸性化學(xué)殺線劑如涕滅威、克線磷等對(duì)于土壤和植物產(chǎn)品的殘留毒性，以及對(duì)人畜不安全，已被禁用；熏蒸性化學(xué)殺線劑如溴甲烷（Methyl bromide）雖然對(duì)土壤的殘留毒性不高，但它嚴(yán)重破壞大氣層中的臭氧層，在世界范圍內(nèi)至多能夠應(yīng)用到2010年（Ristaine & Tho

11、mas,1997）2。非寄主植物輪作措施因根結(jié)線蟲的寄主范圍廣而遇到困難，在一些種植區(qū)，特別是蔬菜種植區(qū)很難實(shí)行。加之當(dāng)前廣泛種植的茄科和葫蘆科蔬菜尚無(wú)生產(chǎn)上大面積使用的抗根結(jié)線蟲品種。尋找替代防治根結(jié)線蟲病害安全有效的防治策略,這些措施必須具備無(wú)公害可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求。主要包括應(yīng)用土壤有機(jī)添加劑、植物源殺線物質(zhì)以及引進(jìn)生物防治因子等，調(diào)控栽培土壤中的微生態(tài)環(huán)境，使失衡的微生態(tài)環(huán)境得以逐漸恢復(fù)，創(chuàng)造和誘導(dǎo)土壤的抑線性。生物防治具有可持續(xù)發(fā)展及保持生物多樣性的優(yōu)勢(shì)。采用生物防治對(duì)根結(jié)線蟲病害的治理已上升為國(guó)內(nèi)外研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)，也是根結(jié)線蟲病害可持續(xù)治理的理想途徑之一。生物防治是指將有效的線蟲

12、天敵微生物活體引入釋放至土壤控制線蟲危害，引入生物防治是目前植物病蟲害生物防治的主要方式。生物防治的主要目標(biāo)是增加土壤中線蟲天敵的數(shù)量，來(lái)減少土壤中的線蟲密度3。從植物病害生物防治的角度講，在根際處生存的某些微生物為植物根系免受病原物的侵染提供了最前沿的防線，因此這類生物作為生物防治因子使用很理想。植物病原線蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上一類重要的病原物，在分類學(xué)和生態(tài)學(xué)上具有豐富的多樣性。在自然界中線蟲的天敵生物種類很多，包括真菌、細(xì)菌、病毒、昆蟲和螨類、原生動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、捕食性線蟲和立克次氏體屬的微生物等，其中真菌防治線蟲病害是研究和應(yīng)用最活躍的領(lǐng)域之一，這方面的研究取得了可喜的進(jìn)展。刀孢蠟蚧菌(Lec

13、anicillium psalliotae)早先被歸為刀孢輪枝菌Verticillium psalliotae（Treschow,1941），后來(lái)根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及ITS序列比較分析，Gams和Zare在2001年將蠟蚧菌從輪枝菌屬中劃分出來(lái)，建立蠟蚧屬(Lecanillium)。分生孢子以直角成簇的著生在瓶梗頂端；瓶梗較纖細(xì)；菌絲產(chǎn)生晶體，多為八面體；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生厚垣孢子。蠟蚧屬現(xiàn)有15個(gè)種。蠟蚧菌最早由Nivter于1861年在斯里蘭卡首次發(fā)現(xiàn),是咖啡蠟蚧( Lecacii coffeae)的寄生菌。目前,西歐、蘇、美等許多國(guó)家對(duì)該菌已有廣泛深入的研究, 并已用于害蟲的生物防治。在我國(guó),蠟蚧

14、菌于1959年臺(tái)灣曾有記載,此后貴州、廣州、湖南、北京等相繼發(fā)現(xiàn)該菌寄生于蚧類、蚜類、蛾類、步行蟲等昆蟲。蠟蚧菌在世界上廣泛分布，寄生于昆蟲。該菌對(duì)于線蟲的生物防治研究，國(guó)內(nèi)未見報(bào)道4。蠟蚧菌的寄主范圍廣, 能寄生蚧類、蚜蟲類、螨類和粉虱, 還可寄生鱗翅目的一些害蟲、薊馬及線蟲等。蠟蚧菌較多的作為昆蟲生防菌被研究，利用昆蟲病原真菌流行病的發(fā)生可自然制約害蟲的種群數(shù)量維護(hù)生態(tài)平衡減少化學(xué)農(nóng)藥的用量因而降低防治成本減少環(huán)境污染。20世紀(jì)70年代以來(lái)，歐洲一些國(guó)家及美國(guó)、日本等國(guó)對(duì)利用刀孢蠟蚧菌防治溫室蔬菜害蟲給予極大重視。刀孢蠟蚧菌的主要形態(tài)特征：該菌菌落在PDA培養(yǎng)基上27，10天直徑可達(dá)24-

15、47mm，白色，棉狀，菌絲很少簇生；背面紅色或紫紅色；氣絲無(wú)色，有隔,自匍匐氣絲上伸出錐形瓶梗，單生或3-4（或6）根輪生，通常在菌絲未分化的末端長(zhǎng)出的瓶梗數(shù)常較多,通常大小為25-351.0-1.5m,基部較粗至尖端逐漸變細(xì)，有時(shí)產(chǎn)生次生菌絲;初生分生孢子鐮刀形，隨后出現(xiàn)的孢子通常為卵圓或橢圓形，鐮刀形的大分生孢子彎曲，一般具有尖銳的末端，具有一個(gè)隔，少數(shù)具有兩個(gè)隔，大小為5-101.2-1.7m。隨后出現(xiàn)小分生孢子卵圓形的大小為2.7-3.71-1.5。該菌產(chǎn)生八面體的晶體。最適生長(zhǎng)溫度：2124（-27）(24-38mm diam.)，33不生長(zhǎng)。相對(duì)濕度對(duì)蠟蚧菌分生孢子萌發(fā)影響很大，當(dāng)

16、相對(duì)濕度低于75%時(shí)，該菌的分生孢子不能萌發(fā)。該菌的有性型至今還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)(Gams,1971,Brady,1979)5。刀孢蠟蚧菌能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，由于線蟲卵殼中含有幾丁質(zhì)（40%左右），幾丁質(zhì)酶對(duì)線蟲卵的存活和發(fā)育產(chǎn)生影響。幾丁質(zhì)是一種不溶解N-乙酰葡萄糖胺的-1,4-聯(lián)聚合物，是自然界中第二豐富的碳水化合物聚合物。幾丁質(zhì)可以被雙酶系統(tǒng)降解，其中包括一種幾丁質(zhì)內(nèi)切酶及幾丁質(zhì)外切酶。降解發(fā)生在兩個(gè)連續(xù)的步驟:首先水解酶,成為低聚物(主要是二聚體)，然后幾丁質(zhì)外切酶將其降解成N-乙酰葡萄糖胺單體6。幾丁質(zhì)酶是一種分解幾丁質(zhì)的水解酶，這些酶廣泛分布于自然界，并已在細(xì)菌、真菌、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊

17、椎動(dòng)物上被發(fā)現(xiàn)。刀孢蠟蚧菌為機(jī)會(huì)和產(chǎn)毒真菌，機(jī)會(huì)真菌能定殖于球形胞囊線蟲( Globodera spp. ) 、胞囊線蟲( Heterodera spp. )和根結(jié)線蟲( Meloidogyne spp. )等固定性內(nèi)寄生線蟲的繁殖體上 ,這類真菌能侵染根內(nèi)和根表以及土壤中的繁殖體7。Galper等報(bào)道, Cuninghamella elegans可以產(chǎn)生膠原蛋白酶,這種真菌在膠原蛋白培養(yǎng)基上的培養(yǎng)濾液可以抑制爪哇根結(jié)線蟲卵的孵化影響幼蟲的活動(dòng)和侵入8。這類真菌并不明顯地寄生胞囊線蟲,但它們可以定殖于胞囊上利用胞囊內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物生長(zhǎng),同時(shí)產(chǎn)生多種酶抑制卵的孵化。蠟蚧菌是一種非?；臋C(jī)會(huì)性真菌種類，

18、能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用來(lái)獲取土壤中包括線蟲在內(nèi)的許多營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。目前，根結(jié)線蟲病的生物防治已經(jīng)成為一種趨勢(shì)，受到越來(lái)越多的關(guān)注。篩選高效菌株和對(duì)已有作為生防資源的機(jī)會(huì)真菌的潛力研究是國(guó)內(nèi)外線蟲學(xué)者共同努力的方向。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，蠟蚧菌作為生防菌株具有明顯的優(yōu)勢(shì)。高效產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶能力是篩選植物病原線蟲卵寄生真菌的重要指標(biāo)之一9。篩選高效產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶活性、產(chǎn)酶條件和對(duì)線蟲卵的作用機(jī)制的研究具有重要意義。本試驗(yàn)應(yīng)用相同來(lái)源的刀孢蠟蚧菌，測(cè)定在不同的外界條件下（如溫度、PH等）其在誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的規(guī)律。測(cè)定產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶系高峰期刀孢蠟蚧菌的培養(yǎng)濾液對(duì)南方根結(jié)線蟲卵的影響，為進(jìn)一步篩選菌系和研制菌劑添

19、加成分提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 供試菌株山東青島城陽(yáng)絲瓜根結(jié)線蟲卵的卵寄生真菌刀孢蠟蚧菌Lecanicillium psalliotaeCFCC84958，保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)線蟲學(xué)研究室。1.2供試試劑幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定所用試劑：膠體幾丁質(zhì)（colloidal chitin）、Schales液、NAG、 pNP-NAG、pNP1.3產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)條件250mL的錐形瓶?jī)?nèi)盛有120mL的液體培養(yǎng)基(0.2%膠體幾丁質(zhì), 0.1% KH2PO4， 0.03% NaCl, 0.001%FeSO4，0.3%KNO3，0.03% MgSO47H2O和0.3% Tryptone(Sigma) ,）

20、調(diào)pH值為5.5。0.15MPa,121滅菌30min備用。將在PDA平板上活化7d的蠟蚧菌菌落邊緣菌塊(直徑6mm)接種于含120mL幾丁質(zhì)液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，每瓶放菌塊3個(gè)，置于搖床25150r/min培養(yǎng)，3次重復(fù)。從第0d到第14d，取1.5mL培養(yǎng)濾液，11000 r/min離心15min，上清液-20保存，供幾丁質(zhì)降解酶測(cè)定，隔天取樣一次。1.4幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定幾丁質(zhì)降解酶系活性測(cè)定幾丁質(zhì)降解酶系活性依據(jù)膠體幾丁質(zhì)生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG，N-acetyglucosamine)含量測(cè)定。酶促反應(yīng)體系包括：0.1mL 菌培養(yǎng)濾液、0.5mL 1.0% 膠體幾丁質(zhì)和

21、0.4mL 0.1mol/L pH4.5磷酸鈉緩沖液，3次重復(fù)，以加200l 1mol/L NaOH不反應(yīng)為對(duì)照。置于搖床中37，150r/min反應(yīng)2h，反應(yīng)后立即加200l 1mol/L NaOH終止反應(yīng)，11000r/min離心10min，分別取上清液500l于1mL Schales液，沸水中顯色反應(yīng)15min，420nm波長(zhǎng)測(cè)其吸光度(OD值)。標(biāo)準(zhǔn)曲線以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0-100g)制作，1個(gè)酶活單位(U)以1h產(chǎn)生1mol NAG量計(jì)算。 N-乙酰葡萄糖胺(NAG)標(biāo)準(zhǔn)曲線以5mol/mL 稀釋5倍后，作為母液，按表1測(cè)定其吸光度A420，做標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。表

22、 1 測(cè)定幾丁質(zhì)降解酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備Table 1 The standard curve preparation for determining chitinase activityNAG含量(mol)00.050.10.150.20.250.30.351mol/mlNAG(l)050100150200250300350H2O(l)500450400350300250200150Schales液(l)10001000100010001000100010001000A(420nm)00.1340.2690.4080.5510.6810.8140.934圖1 NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The

23、 standard curve of NAGFig.1 The standard curve of NAG幾丁質(zhì)外切酶活性測(cè)定幾丁質(zhì)外切酶（N-acety-D-glucosaminidase）活性測(cè)定以pNP-NAG為底物，測(cè)定酶促反應(yīng)生成的對(duì)硝基苯酚（pNP，-nitrophenol）的含量。酶促反應(yīng)體系包括：50l菌培養(yǎng)濾液、50l pNP-NAG(1mg/mL)、100L 0.1mol/L pH5.0醋酸緩沖液，3次重復(fù)，以加1mL 1mol/L NaOH不反應(yīng)為對(duì)照。置于搖床中37，150r/min反應(yīng)2h，反應(yīng)后立即加1mL 1mol/L NaOH 終止反應(yīng)?；靹蚝罅⒓丛?05nm下

24、測(cè)量其吸光度（OD值）。標(biāo)準(zhǔn)曲線以已知含量對(duì)硝基苯酚（pNP）制作，1個(gè)酶活單位（U）以1h產(chǎn)生1mol pNP量計(jì)算。對(duì)硝基苯酚（pNP，p-nitrophenol）標(biāo)準(zhǔn)曲線以1mol/mL 作為母液，按表2測(cè)定其吸光度A405，做標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。表 2 測(cè)定幾丁質(zhì)外切酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備Table 2 The standard curve preparation for determining exochitinase activitypNP含量（mol） 0.1 0.05 0.025 0.0125 0.006251mol/mLpNP（l） 100 50 25 12.5 6.25H2O

25、(l) 0 50 75 87.5 93.751 M NaOH（l）10001000 100010001000A(405nm) 1.570 0.815 0.428 0.241 0.144圖 2 pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of pNP1.5刀孢蠟蚧菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對(duì)根結(jié)線蟲卵的破壞1.5.1根結(jié)線蟲卵懸液的制備將感染南方根結(jié)線蟲的新鮮絲瓜根，經(jīng)水沖去土壤后，在OLYMPUS高級(jí)解剖鏡下直接解剖病根，挑出卵囊，置于含2%NaClO的小瓶中，渦旋震蕩，得到卵懸浮液，制成100eggs/mL左右，待用。1.5.2卵孵化抑制率及破壞率的測(cè)定將培養(yǎng)4d的刀孢蠟蚧菌培養(yǎng)濾

26、液和根結(jié)線蟲卵懸浮液（100個(gè)卵左右/mL）加入到24孔板中，將該菌株設(shè)5個(gè)濃度梯度，分別為0%，25%，50%，75%，100%，以0%做對(duì)照，4次重復(fù)，25培養(yǎng)7d（間隔2d輕微晃動(dòng)以保證通氣）。定期觀察卵殼變化情況，7d計(jì)量卵孵化數(shù)，計(jì)算卵孵化相對(duì)抑制率。孵化率（%）=（Jf 100）/(Ei+Ji)破壞率（%）=（Ei-Ef）-（Jf-Ji） / EiEi表示起始成熟卵的數(shù)量；Ef表示最終剩余卵的數(shù)量；Ji表示起始2齡幼蟲的數(shù)量；Jf表示孵化2齡幼蟲的數(shù)量相對(duì)抑制率（%）=（對(duì)照孵化率-處理孵化率）/對(duì)照孵化率2 結(jié)果與分析2.1 幾丁質(zhì)降解酶系活性測(cè)定的結(jié)果在以0.2%膠體幾丁質(zhì)(c

27、olloidal chitin)作為主要C源和N源的半液體培養(yǎng)基內(nèi)，在不同的溫度和PH值下刀孢蠟蚧菌表現(xiàn)的幾丁質(zhì)降解酶系活性特性存在明顯差異。其中在溫度為37、PH為4.5條件下刀孢蠟蚧菌表現(xiàn)的活性最強(qiáng)（圖3），在此條件下刀孢蠟蚧菌L. psalloitaeCFCC84958從第1d開始就表現(xiàn)出降解酶活性，酶活性上升迅速，第3d達(dá)到酶活性高峰為 3.98 mol/h ml,之后緩慢下降。圖3 刀孢蠟蚧菌的培養(yǎng)濾液在PH為4.5、溫度為37下的幾丁質(zhì)降解酶活性Fig.3 Chitinolytic activity in culture filtrate of Lecanicillium psal

28、liotaeCFCC84958 at PH4.5 and 372.2幾丁質(zhì)外切酶活性測(cè)定的結(jié)果圖4刀孢蠟蚧菌培養(yǎng)濾液幾丁質(zhì)外切酶活性Fig.4 Exochitinase activity in culture filtrate of Lecanicillium psalliotaeCFCC84958刀孢蠟蚧菌L. psalloitaeCFCC84958的培養(yǎng)濾液也表現(xiàn)出外切酶活性。從第2d開始就產(chǎn)生幾丁質(zhì)外切酶，在第4d達(dá)到酶活性為0.26umol/h mL，從第8d到第16d一直保持高水平活性，穩(wěn)定在0.18-0.38mol/h ml之間（圖4）。2.3刀孢蠟蚧菌培養(yǎng)濾液對(duì)卵孵化的影響由實(shí)驗(yàn)

29、結(jié)果可知：刀孢蠟蚧菌Lecanicillium psalliotaeCFCC84958的幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵具有一定的孵化抑制和破壞作用。刀孢蠟蚧菌四個(gè)濃度的幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵都具有不同程度的孵化抑制和破壞作用。37下培養(yǎng)，該菌的培養(yǎng)濾液在濃度遞增的情況下，對(duì)根結(jié)線蟲卵孵化抑制率和破壞率隨時(shí)間的增加而遞增。其中培養(yǎng)7d，100%濃度的培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵孵化抑制率和破壞率最大。（圖5、圖6）圖 5 刀孢蠟蚧菌培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵殼的破壞率Fig 5 Damage rate of Lecanicillium psalliotaeCFCC84958 on incubation o

30、f Meloidogyne incognita eggs比較培養(yǎng)這7d各濃度下該菌培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵殼的破壞率，由圖5可知:25%濃度的培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵殼的破壞率最小,100%濃度的最大，最終達(dá)到84.32%。第1d，50%、75%、100%濃度間對(duì)卵殼的破壞率差異不顯著，而這三個(gè)濃度與25%濃度之間差異顯著。從3d到第7d，25%、50%、75%濃度間對(duì)卵殼的破壞率差異不顯著，該三個(gè)濃度與100%濃度間差異顯著，并且在第7d隨濾液濃度升高破壞率也相應(yīng)依次增大。在第7d各濃度培養(yǎng)濾液對(duì)卵殼的破壞率均比前幾天大，由此可知培養(yǎng)濾液濃度越高，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)卵殼的破壞效果越明顯。說(shuō)明該菌的培養(yǎng)濾

31、液對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化具有破壞作用。圖6 刀孢蠟蚧菌培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵孵化的抑制率Fig 6 Inhibition rate of Lecanicillium psalliotaeCFCC84958 on incubation of Meloidogyne incognita eggs比較培養(yǎng)這7d各濃度下該菌培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵孵化的抑制率，由圖6可知，25%濃度的培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵孵化的抑制率最小,100%濃度的最大，最終達(dá)到。第1d，25%、50%濃度間對(duì)根結(jié)線蟲卵孵化的抑制率差異不顯著，而這兩個(gè)濃度與75%、100%濃度間都差異顯著，75%與100%濃度間差異顯著。從第3d到第7d

32、,25%、50%、75%三種濃度對(duì)卵孵化的抑制率持續(xù)升高并且差異顯著，而100%濃度的培養(yǎng)液對(duì)卵孵化的抑制率則幾乎沒(méi)變，但從這7d總體來(lái)看，卵孵化抑制率是持續(xù)升高的，說(shuō)明培養(yǎng)濾液濃度越高，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)卵孵化的抑制效果越明顯。說(shuō)明該菌的培養(yǎng)濾液對(duì)南方根結(jié)線蟲卵的孵化有抑制作用。2.4 南方根結(jié)線蟲卵殼的形態(tài)變化由顯微鏡下觀察的圖片可知根結(jié)線蟲卵殼有不同程度的變化。第1dLecanicillium psalliotaeCFCC84958處理的卵殼有稍微的縊縮；3d后可以看到菌株Lecanicillium psalliotaeCFCC84958處理的卵內(nèi)含物聚集，卵殼變空，對(duì)照可以清晰的看到卵內(nèi)的

33、1齡幼蟲。7d后，該菌株培養(yǎng)濾液處理的卵殼能看到卵的變形和破損，對(duì)照能看到孵化的2齡幼蟲。圖 7 刀孢蠟蚧菌Lecanicillium psalliotaeCFCC84958對(duì)卵孵化率的影響 A.水處理；B. CFCC84958菌培養(yǎng)濾液 A1,B1.第1天的卵；A2,B2.第3天的卵；A3,B3.第7天的卵Fig 7 Effect of Lecanicillium psalliotaeCFCC84958 on morphology of Meloidogyne incognita eggsA. Water; B. CFCC84958A1,B1.M.incognita eggs on the

34、first day;A2,B2. M.incognita eggs on the third day;A3,B3. M.incognita eggs on the seventh day2.5結(jié)論刀孢蠟蚧菌Lecanicillium psalliotaeCFCC84958能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，其培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲的卵具有抑制孵化和破壞作用。在溫度為37、PH為4.5條件下刀孢蠟蚧菌表現(xiàn)的活性最強(qiáng)。在適宜的外界條件下（如溫度、PH、培養(yǎng)天數(shù)等），該菌的培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵的抑制孵化和破壞作用隨濃度的增高而增大，100%濃度的培養(yǎng)濾液對(duì)根結(jié)線蟲卵的孵化抑制率和破壞率最大。3 討論與展望3.1 討論根結(jié)

35、線蟲卵寄生真菌對(duì)根結(jié)線蟲病害生物防治具有很大潛力10。篩選對(duì)根結(jié)線蟲卵具有高效生物防治活性微生物是生物防治的基礎(chǔ)。幾丁質(zhì)酶在卵寄生真菌穿透線蟲卵殼的寄生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，特別是寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)中含有幾丁質(zhì)成份，線蟲卵殼中的幾丁質(zhì)層位于卵殼的中部，為50-400nm厚的結(jié)構(gòu)，是卵寄生真菌侵入卵的過(guò)程中最難穿透的屏障2/6。分離自胞囊類和根結(jié)線蟲卵寄生真菌約一半種類具有產(chǎn)生幾丁質(zhì)降解酶系活性11，產(chǎn)生幾丁質(zhì)降解酶系活性的強(qiáng)弱與抑制根結(jié)線蟲卵孵化率呈正相關(guān)1/8,1/9。表明幾丁質(zhì)降解酶系活性的強(qiáng)弱是篩選和評(píng)價(jià)線蟲卵寄生或產(chǎn)毒真菌生物防治潛力的重要指標(biāo)之一。3.2展望安全性評(píng)價(jià)隨著人們風(fēng)險(xiǎn)分析意識(shí)的增

36、強(qiáng)，人為獲得的抗藥性線蟲生防菌釋放到環(huán)境后，很可能給生態(tài)環(huán)境中其他生物群體包括微生物、植物、動(dòng)物群體，包括人帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)，可能成為新的有害生物12。因此，務(wù)必在釋放前進(jìn)行全面深入地風(fēng)險(xiǎn)分析與安全性評(píng)價(jià)。在線蟲的生防中，大多數(shù)的生防真菌對(duì)人類的健康是沒(méi)有威脅的，但淡紫擬青霉（P.lilacinus）卻是個(gè)例外13。該種生防菌對(duì)哺乳動(dòng)物具有一定的毒性，它除能侵染人的眼睛，引起人面部發(fā)生病變外，也能對(duì)家畜進(jìn)行侵染，尤其是在哺乳動(dòng)物的眼睛受到生理脅迫、或在侵染前受到傷害、或由于先前的外科手術(shù)使組織衰弱時(shí)，上述情況就比較容易發(fā)生13/14。有鑒于此，在對(duì)生防因子正式施用到環(huán)境中或在使用前必須對(duì)它們進(jìn)行測(cè)

37、試，以保證它們的施用不會(huì)對(duì)人類健康和其它非靶標(biāo)生物的生存造成威脅。 根結(jié)線蟲生物防治展望生物防治是植物寄生線蟲的一項(xiàng)重要防治措施，因其符合現(xiàn)代環(huán)保與健康理念，受到普遍重視。但離大規(guī)模應(yīng)用還有距離，還有許多需加強(qiáng)的基礎(chǔ)研究和亟待解決的問(wèn)題：一、進(jìn)一步開展線蟲天敵資源的種類調(diào)查與高效菌株篩選；二、加強(qiáng)對(duì)線蟲種群動(dòng)態(tài)及天敵動(dòng)態(tài)模型的研究，加強(qiáng)生防菌定殖、消長(zhǎng)規(guī)律及土壤抑菌作用等生態(tài)學(xué)問(wèn)題研究；三、對(duì)生防資源進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)價(jià)；四、解決劑型研制是生防菌劑商品化的難點(diǎn)15。分子生物學(xué)技術(shù)在生防中具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其是在線蟲生防資源調(diào)查、高效生防菌株的選育、基因改良、菌劑研制、抗病育種，以及線蟲與植物的相

38、互作用等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。植物寄生線蟲的生物防治仍需要廣泛深入研究，隨著研究的不斷深入，線蟲的生防必將取得長(zhǎng)足的發(fā)展和輝煌的成就。根結(jié)線蟲病的防治雖然取得了較大進(jìn)展，但也存在一定的問(wèn)題。主要表現(xiàn)在綜合防治的意識(shí)淡薄，片面強(qiáng)調(diào)化學(xué)農(nóng)藥的重要性，忽視了其它防治措施的合理運(yùn)用；單一作物連作、復(fù)種指數(shù)高，或化肥的不合理施用，導(dǎo)致根結(jié)線蟲病的發(fā)生呈逐年加重的趨勢(shì)；到目前為止，國(guó)內(nèi)外形成商品化生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用于大田的線蟲生防制劑甚少。因此，根結(jié)線蟲病的綜合防治依然任重道遠(yuǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，綜合防治的概念必定得到普及和認(rèn)同。同時(shí)分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等手段，勢(shì)必使抗病育種研究工作取得新的突破?；蚬こ碳夹g(shù)

39、也在為生物性殺線蟲劑的研發(fā)與生產(chǎn)提供著強(qiáng)有力的技術(shù)支持。在不久的將來(lái)，以化學(xué)農(nóng)藥為主要防治手段的傳統(tǒng)措施必將被以各種防治手段并重的新型綜合防治體系所取代。在世界各國(guó)科學(xué)工作者的不懈努力下，根結(jié)線蟲的生物防治工作已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，呈現(xiàn)出較好的發(fā)展趨勢(shì)。根結(jié)線蟲生物防治天敵資源在世界不同國(guó)家和地區(qū)被廣泛調(diào)查和篩選，目前至少已有6個(gè)用于防治根結(jié)線蟲的商品化制劑15。特別值得一提的是，在國(guó)內(nèi)幾家單位的長(zhǎng)期合作研究下，我國(guó)在根結(jié)線蟲生物防治領(lǐng)域取得了重要的進(jìn)展，已開發(fā)出國(guó)內(nèi)唯一的線蟲生防商品制劑，并獲多項(xiàng)發(fā)明專利。隨著人們對(duì)根結(jié)線蟲、寄主植物和生防資源之間生物學(xué)和生態(tài)學(xué)知識(shí)的不斷積累和理解，根結(jié)線蟲

40、生物防治必將取得更大的突破。致謝：本論文是在XX的悉心指導(dǎo)下完成的。在實(shí)習(xí)期間，XXX不但在學(xué)習(xí)上耐心的指導(dǎo)，而且在生活上給予無(wú)微不至的關(guān)懷，尤其是XX嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、淵博的專業(yè)知識(shí)、為人師表、無(wú)私奉獻(xiàn)的精神令我終生難忘。他不但教會(huì)我如何學(xué)習(xí)，也教會(huì)我如何做人。在此我向XXX表示衷心的感謝，感謝他們無(wú)私的指導(dǎo)、嚴(yán)格的要求、熱忱的鼓勵(lì)和親切的關(guān)懷！在論文的整理和寫作過(guò)程中，得到了XX還有XXX同學(xué)等多人的大力支持和幫助。同時(shí)在這四年的學(xué)習(xí)和生活上，學(xué)院和學(xué)校的各位領(lǐng)導(dǎo)和老師都給予我大力的支持和幫助。在此表示忠心的感謝！參考文獻(xiàn):1 Sasser J N, Freekman D W. A worl

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