細胞生物學(xué)試驗手冊

1、細胞生物學(xué)實驗手冊這本實驗教材是為高等醫(yī)學(xué)院校細胞生物學(xué)教學(xué)編寫的，適用于五年制本科、七年制 臨床專業(yè)和研究生班。以及細胞生物學(xué)實驗課的教學(xué)目的，主要是通過根本技能訓(xùn)練以及觀察分析實驗結(jié)果，使 學(xué)生了解并掌握有關(guān)的實驗技術(shù)原理和操作方法，進而培養(yǎng)學(xué)生動手實踐、觀察分析和解 決問題的能力。 為到達此目的， 實驗內(nèi)容自成體系，著眼于加強學(xué)生的基末技能訓(xùn)練， 觀察分析問題和科學(xué)思維能力的培養(yǎng)。大多數(shù)實驗采用生活細胞材料，由學(xué)生自己動手取 材和實驗，使學(xué)生能對細胞獲得生動的認(rèn)識。選編了一些生物醫(yī)學(xué)常用的細胞生物學(xué)根本 實驗，如細胞的顯微測量、細胞活力測定、細胞計數(shù)、細胞組分的分級別離、細胞組分的化 學(xué)

2、反響、細胞生理活動、細胞染色體技術(shù)、細胞培養(yǎng)、細胞融合、免疫熒光技術(shù)、電鏡技術(shù) 等，為后續(xù)的課程及醫(yī)學(xué)研究打下一定根底。全書內(nèi)容共 23 個實驗，五年制本科、七年制醫(yī)學(xué)專業(yè)和研究生班教學(xué)根據(jù)具體情況 選擇根本實驗，由學(xué)生自己動手操作，少數(shù)應(yīng)用大型精密儀器的實驗進行參觀示教，另附 實驗報告一冊。本教材由王蕓慶主編、謝榮林副主編，參加編寫的有陳興、謝榮林、寧剛、劉冬杰、黃 東陽、紀(jì)曉輝、時偉紅、朱亞勤、黃集前、王明武、畢衛(wèi)真、張婕、三維琴和王世藩。荊永 顯、李虹、王序繪制插圖，畢衛(wèi)真負責(zé)印刷出版事宜。教材初稿曾于 1989 年?全國醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗課培訓(xùn)班?試用，參加該班的教師提 出許多珍貴的經(jīng)

3、驗及修改意見，謹(jǐn)此致謝?，F(xiàn)在第四版在 1993 年第三版根底上對局部實 驗進行了補充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的顯示實驗。由于經(jīng)驗缺乏，水平有限，本 教材一定還有很多缺點和錯誤，敬請使用者批評指正。目錄、八前言實驗室規(guī)那么 (1)常用實驗動物了解和解剖器械的使用 (2)細胞生物學(xué)實驗繪圖方法與要求(4)實驗一動物細胞的根本形態(tài)觀察和顯微測量(5)實驗二線粒體的活體染色及電鏡照片觀察 (8)實驗三液泡系的活體染色及電鏡照片觀察 (10)實驗四細胞中微絲的染色及微絲與細胞形態(tài)的實驗觀察 (11)實驗五細胞器的光鏡切片和電鏡照片觀察(13)實驗六細胞生理活動的觀察 (16)實驗七細胞組分的化學(xué)反響

4、(20)實驗八細胞核與線粒體的分級別離(23)實驗九細胞分裂的形態(tài)觀察(26)實驗十正常細胞與腫瘤細胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備 (31)實驗一細胞融合(36)實驗十二應(yīng)用細胞融合技術(shù)制備染色體提前凝集標(biāo)本(38)實驗十三培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察和計數(shù) (40)實驗十四細胞的原代和傳代培養(yǎng) (43)實驗十五酸性磷酸酶的顯示(46)實驗十六腫瘤細胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)和測定(48)實驗十七電鏡生物標(biāo)本的制備及鏡下觀察(50)實驗十八整裝培養(yǎng)細胞生物膜系統(tǒng)的光鏡和透射電鏡標(biāo)本制備與觀察(54)實驗十九免疫熒光抗體法檢查細胞外表抗原(56)實驗二十姊妹染色單體互換標(biāo)本制備與分析(58)實驗二一銀染核仁形成區(qū)的光鏡和電

5、鏡標(biāo)本制備及觀察 (60)實驗二十二染色體掃描電鏡標(biāo)本制備及觀察(63)實驗二十三細胞顯微攝影 (65)附錄一 離心機轉(zhuǎn)數(shù)與離心力的換算表(67)附錄二 溶液的配制(68)主要參考資料(77)實驗室規(guī)那么一、遵守實驗紀(jì)律，按時到達實驗室，不得遲到或早退。實驗中途因故需外出時應(yīng)向任 課教師請假。二、進入實驗室之前要換好白大衣及拖鞋。三、保持實驗室安靜，不許在實驗室內(nèi)大聲喧嘩及隨意走動。四、必須嚴(yán)肅認(rèn)真地進行實驗。實驗期間不得進行任何與實驗無關(guān)的活動。五、實驗室內(nèi)各組儀器及器材由各組自已使用，不得互相調(diào)換。要保護儀器、標(biāo)本和設(shè) 備。如遇儀器損壞或不靈，應(yīng)及時報告任課教師，以便修理或更換，不要自行亂

6、修。 損壞器材或設(shè)備者應(yīng)按有關(guān)規(guī)定進行賠償。六、注意節(jié)約實驗材料、藥品和水、電等。七、保持實驗室內(nèi)清潔整齊。實驗結(jié)束后，各組必須認(rèn)真清理各自的實驗臺面，將器材 清洗后點清數(shù)目，然后擺放整齊。班級值日生負責(zé)清掃室內(nèi)衛(wèi)生，關(guān)好水、電開關(guān) 和門、窗等，經(jīng)教師允許前方可離開實驗室。八、動物尸體、紙片及實驗廢物應(yīng)放到指定地點，不得隨意亂丟。九、有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實驗，并取消其當(dāng)堂實驗成績。常用實驗動物的了解和解剖器械的使用一、常用實驗動物 常用的實驗動物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、貓、兔和狗等。在醫(yī)學(xué)實驗中，常常 根據(jù)不同的實驗?zāi)康亩x用不同的動物進行實驗研究。例如， 蟾蜍可以用于觀

7、察離體心臟搏動情況的實驗， 小白鼠常用于樣本很大的實驗 如藥物的半數(shù)致死量的測定等 ，貓常用于測 定腦內(nèi)電位的實驗，而狗是局解手術(shù)中常用的實驗動物。在我們細胞生物學(xué)實驗中， 除應(yīng)用培養(yǎng)細胞外， 最常用的動物是蟾蜍和小白鼠， 下面對 其特點及根本處置做一簡單的介紹。蟾蜍蟾蜍是兩棲類動物， 由于其取材方便， 常用于各種實驗。 其細胞較哺乳類動物的細胞大 得多，因此常用于觀察細胞形態(tài)的實驗。1 雌雄鑒別通常雄性蟾蜍較雌性的為小，且在其前肢的I3趾基部有被稱為婚墊的黑疣。2 捉拿及處死方法：常用搗髓法處死蟾蜍， 即用解剖針搗毀其腦組織和脊髓。 具體方法是， 左手握住蟾蜍的 身體和四肢， 使其腹部貼著掌

8、心， 食指壓住蟾蜍頭部前端使其盡量腹屈。 在頭與軀干之間可 觸及一凹陷即枕骨大孔所在處，右手持解剖針直插入此凹陷約I2mm隨即將針尖轉(zhuǎn)向頭側(cè)插入顱腔搗毀腦組織。 然后將解剖針抽回并轉(zhuǎn)向尾側(cè)刺入脊椎管內(nèi)搗毀其脊髓。 如此直 至其四肢松軟，呼吸消失為止。小白鼠 小白鼠是哺乳動物，是最為常用的實驗動物。1 捉拿方法： 將小白鼠放在鼠籠蓋鐵網(wǎng)上， 用右手持其尾巴向后拉， 小鼠那么會盡力向前蹬。 用左手的 拇指和食指抓住其頭頂部皮膚，然后用左手小指與手掌之間夾住其尾巴。2 處死方法：處死應(yīng)以安樂死為原那么， 即使之無痛苦而迅速死亡。 常用的方法有頸椎脫位法， 斷頭法 和二氧化碳吸入法等。 斷頭法需用特殊

9、的斷頭器， 二氧化碳吸入法那么將小鼠放入盛有二氧化 碳的容器內(nèi)即可。 頸椎脫位法的具體方法是： 左手拇指和食指按住小白鼠的頭部， 左手捉住 其尾巴迅速向后猛拉，使其頸椎脫位而立即死亡。3 給藥方法：小自鼠的給藥途徑有經(jīng)口給藥、 腹腔內(nèi)注射、 尾靜脈注射、皮下注射、 皮內(nèi)注射和肌肉 注射等。我們常用的是腹腔注射。具體方法是：左手捉住小鼠 如前所述 ，在其腹正中線稍 外側(cè)避開膀胱和血管 用酒精消毒后，首先將注射針頭向頭部方向刺入皮下，進針12mm后，再以 45°角刺穿腹部肌肉而進入腹腔 刺穿腹肌時有一落空感 。針頭刺入腹腔后切勿 左右擺動，以免損傷腸管或肝臟。注意每次注入的液體量應(yīng)為0.

10、10.2ml /10克體重。二、常用手術(shù)器械及操作方法：1 解剖針：用于挑、刺等。常用來搗髓處死蟾蜍，持法如執(zhí)筆法。2 解剖刀 即外科手術(shù)刀 ：用于各種皮膚切口和組織切除等。持法有執(zhí)弓法與執(zhí)筆法 兩種。 前者用于較大力量切開較長距離的堅韌的組織， 如大動物的皮膚切口等； 后者那么用于 小力量的短距離切開，或別離皮膚和肌肉等。3 大剪刀：用于剪毛、皮膚、皮下組織和肌肉等。持法如圖。4 眼科剪刀：用于剪斷神經(jīng)、血管、筋膜等細軟組織。5 眼科鑷子：用于提取神經(jīng)、血管和筋膜等細軟組織。6 鈍頭鑷子：用于提取臟器、組織等。7 有鉤鑷子：用于提取皮膚切口等。常用手術(shù)器械執(zhí)手術(shù)刀的姿勢執(zhí)手術(shù)剪的姿勢執(zhí)手術(shù)鑷

11、的姿勢執(zhí)手術(shù)刀、手術(shù)剪、手術(shù)鑷的姿勢 張之曾編細胞生物學(xué)實驗繪圖方法與要求一、在仔細觀察的根底上，選擇典型結(jié)構(gòu)進行描繪，要求真實、準(zhǔn)確 注意各部結(jié)構(gòu)的比例關(guān)系 。二、用鉛筆繪圖，線條要明確清晰，圖的深淺明暗一律以點的疏密來表示，點要圓而一致， 不得涂暗影或進行其它美術(shù)加工。三、各部結(jié)構(gòu)名稱要在一側(cè)引直線注明。各引線要平行不得交叉。四、每幅圖的大小、位置在紙面上必須安排得當(dāng)并注意紙面的整潔。實驗一 動物細胞的根本形態(tài)觀察和顯微測量【實驗?zāi)康?】制備不同細胞的臨時制片， 觀察、了解細胞的根本形態(tài)， 學(xué)會使用測微尺，通過測量對 紅細胞的進化進行分析。【實驗用品 】一、材料和標(biāo)本 蟾蜍一只，人血液一滴

12、。二、器材和儀器 配有目鏡測微尺的顯微鏡一臺、載片十張、蓋片三張、吸水紙、手術(shù) 器材一套、解剖盤一個、鏡臺測微尺一個、小平皿一個、牙簽。三、試劑 1 甲苯胺蘭、 1甲基蘭、 Ringer 氏液 兩棲類用 ?！緦嶒瀮?nèi)容 】一、細胞的根本形態(tài)觀察 一 原理 細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)是很多細胞的共同特點，在分化程度較高的細胞更為明顯， 這種合理性是生物漫長進化過程所形成的。例如： 具有收縮機能的肌細胞伸展為細長形；具有感受刺激和傳導(dǎo)沖動機能的神經(jīng)細胞有長短不一的樹枝狀突起； 游離的血細胞為圓形、 橢 圓形或圓餅形。不管細胞的形狀如何，細胞的結(jié)構(gòu)一般分為三大局部：細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。 但也 有例外

13、。例如：哺乳類紅細胞成熟時細胞核消失。 二 觀察方法與結(jié)果1 制備蟾蜍脊髓壓片觀察脊髓前角運動神經(jīng)細胞。 取蟾蜍一只，破壞腦和脊髓，在口裂處剪去頭部，除去延腦，剪開椎管，可見乳白色脊 髓，取下脊髓放在平皿內(nèi)，用 Ringer 氏液洗去血液后放在載片上，剪碎。將另一載片壓在 脊髓碎塊上，用力擠壓。將上面的載片取下即可得到壓片。在壓片上滴一滴甲苯胺蘭染液， 染色 10 分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。在顯微鏡下觀察，染色較深的小細胞是神經(jīng)膠質(zhì) 細胞。 染成蘭紫色的、大的、有多個突起的細胞是脊髓前角運動神經(jīng)細胞，胞體呈三角形或星形，中央有一個圓形細胞核，內(nèi)有一個核仁 參照照片 。2 蟾蜍骨骼肌細胞的剝

14、離與觀察 剪開蟾蜍腿部皮膚， 剪下一小塊肌肉， 放在載片上， 用鑷子和解剖針剝離肌肉塊成為肌 束，繼續(xù)剝離，可得到很細的肌纖維 肌細胞 。盡可能拉直肌纖維。在顯微鏡下觀察，肌細 胞為細長形，可見折光不同的橫紋，每個肌細胞有多個核，分布于細胞的周邊參照照片 。3 蟾蜍肝臟壓片的制備與觀察剪開蟾蜍腹腔，取一小塊約23mm3肝放在平皿內(nèi)，用 Rin ger氏液洗凈，用鑷子輕 壓將肝中的血擠出。 然后放在載片上，制片方法同脊髓壓片。 染色用甲基蘭。顯微鏡下觀察 可見肝細胞核染成蘭色，肝細胞緊密排列，擠成多角形 參照照片 。4 蟾蜍血涂片的制備與觀察 取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在載片上將另一載片的一端呈

15、45°角緊貼在血滴的前緣，均勻用力向前推，使血液在載片上形成均勻的薄層。圖I 一 1。晾干。顯微鏡觀察可見蟾蜍紅細胞為橢球形，有核。白細胞數(shù)目少，為圓形。取人血一滴，制片方法同上。顯微鏡觀察可見人紅細胞為凹圓盤形，無核。自細胞數(shù)目 少，為圓形。6 .人口腔上皮細胞標(biāo)本的制備與觀察用牙簽刮取口腔上皮細胞均勻地涂在載片上不可反復(fù)涂沫，滴一滴甲苯胺蘭染液， 染色5分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。顯微鏡下觀察可見復(fù)蓋口腔外表的上皮細胞為扁平橢 圓形，中央有橢圓形核，染成蘭色。二、測微尺的使用一原理測微尺分目鏡測微尺和鏡臺測微尺，兩尺配合使用。目鏡測微尺是一個放在目鏡像平面上的玻璃圓片。圓片中央

16、刻有一條直線，此線被分為假設(shè)干格，每格代表的長度隨不同物鏡的放大倍數(shù)而異。因此，用前必須測定。鏡臺測微尺是在一個載片中央封固的尺，長1毫米1000卩m,被分為100格，每格長度是10微米。二方法1 .將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上夾好，小心轉(zhuǎn)動目鏡測微尺和移動鏡臺測微尺 使兩尺平行，記錄鏡臺測微尺假設(shè)干格所對應(yīng)的目鏡測微尺的格數(shù)圖1 2。2. 按下式求出目鏡測微尺每格代表的長度鏡臺測做尺的假設(shè)干格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長度 卩m=X10三、測量人口腔上皮細胞從顯微鏡載物臺上取下鏡臺測微尺，換上人口腔上皮細胞標(biāo)本，測量細胞、細胞核的長短徑?！咀鳂I(yè)】一、分別求出使用低倍鏡 10X，高倍鏡40X時

17、目鏡測微尺每格代表的長度：低倍鏡：目鏡測微尺每格代表的長度=XlO卩m=卩m高倍鏡：目鏡測微尺每格代表的長度=XlO卩m=卩m二、分別繪制所觀察的 6種細胞并注明根本結(jié)構(gòu)。三、計算蟾蜍紅細胞的核質(zhì)比例。計算細胞、細胞核體積的公式：.3圓 形V=4/3 n r r為半徑橢圓形V=4/3 n ab a、b為長、短半徑核質(zhì)比N / D=Vr Vc VnVn為核的體積，Vc是細胞質(zhì)的體積實驗二 線粒體 Mitochondrion 的活體染色及電鏡照片觀察【實驗?zāi)康?】 掌握一種活體染色方法 , 了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下線粒體根本形態(tài)結(jié)構(gòu)?！緦嶒炗闷?】一、材料和標(biāo)本 兔子一只、線粒體的電鏡照片。二

18、、器材和儀器 顯微鏡、 手術(shù)器材一套、 解剖盤、 小平皿、 載片、 蓋片、 吸水紙、 10ml 注射器、吸管。三、試劑I / 300詹納斯綠B染液、Rin ger氏液哺乳類用?！緦嶒瀮?nèi)容 】一、兔肝細胞線粒體的活體染色一原理 線粒體是細胞內(nèi)一種重要細胞器， 是細胞進行呼吸作用的場所。 細胞的各項活動所需要 的能量， 主要是通過線粒體呼吸作用來提供的。 活體染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真 實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。詹納斯綠B 是線垃體的專一性活體染色劑。 線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)呈藍綠色，而在周圍的細胞質(zhì)中染料被復(fù)原，成為無色狀態(tài)。二方法

19、 用空氣栓塞處死兔子， 置于解剖盤內(nèi)， 迅速翻開腹腔， 取兔肝邊緣較薄的肝組織一小塊23mm,放入盛有Rin ger氏液的平皿內(nèi)洗去血液用鑷子輕壓，用吸管吸去Ringer氏 液，在平皿內(nèi)加1/300詹納斯綠B染液，讓組織塊上外表露在染液外面，使細胞內(nèi)線粒體 的酶系可進行充分的氧化, 這樣才有利于保持染料的氧化狀態(tài), 使線粒體著色。 當(dāng)組織塊邊 緣染成籃色時即可,一般需要染 30 分鐘。染色后, 將組織塊移到載片上, 用鑷子將組織塊拉碎, 就會有一些細胞或細胞群從組織 塊脫離。將稍大的組織塊去掉,使游離的細胞或細胞群留在載片上,加一滴Ringer 氏液,蓋上蓋片,吸去多余水分。 三結(jié)果 顯微鏡觀

20、察,肝細胞質(zhì)中許多線粒體被染成藍綠色,呈顆粒狀。二、線粒體的光鏡切片觀察用詹納斯綠B染色的兔肝細胞光鏡切片，肝細胞中的線粒體呈藍綠色的顆粒。 三線粒體的電鏡照片觀察 不同細胞中線粒體的形態(tài)和數(shù)目不同。線粒體的外形多樣,如圓形、橢圓形、啞鈴形和桿狀。線粒體的數(shù)目與細胞類型和細胞的生理狀態(tài)有關(guān), 線粒體多聚集在細胞生理功能旺盛 的區(qū)域。線粒體脊的數(shù)目與分布方式是多種多樣的。 一般與線粒體長軸垂直排列, 但也可見到與 線粒體長軸平行排列的脊。 脊的橫切面呈囊狀或管狀。 脊的數(shù)量與細胞呼吸機能的強度有很 大關(guān)系。這有三張線粒體超薄切片的電鏡照片： 第一張是小鼠腎小管上皮細胞中線粒體的電鏡照 片,可見線

21、粒體呈橢圓形和桿狀,由雙層膜包圍, 內(nèi)膜向內(nèi)突起成平板狀脊,脊與線粒體長 軸垂直排列， 腎小管上皮細胞重吸收作用需要能量， 線粒體數(shù)目多。 第二張是恒河猴脊髓突 觸內(nèi)線粒體。可見線粒體體積小、數(shù)目多，脊與線粒體呈同心圓排列。 第三張是小鼠睪丸間 質(zhì)細胞線粒體，線粒體的脊為分支的管，在照片上呈單層膜泡狀?！咀?業(yè) 】 繪制光鏡下肝細胞活體染色所見的線粒體及電鏡下腎小管上皮細胞中線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 時偉紅編 實驗三 液泡系 Vacuolar system 的活體染色 及電鏡照片觀察【實驗?zāi)康?】 掌握一種活體染色方法，了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下液泡系的根本形態(tài)結(jié)構(gòu)?！緦嶒炗闷?】一、材料和標(biāo)本

22、蟾蜍一只，軟骨細胞電鏡照片。二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡一臺、 手術(shù)器材一套、 解剖盤一個、 載片、蓋片、 吸水紙。三、試劑 l 3000 中性紅染液、 Ringer 氏液兩棲類用 ?！緦嶒瀮?nèi)容 】一、蟾蜍胸骨劍突軟骨細胞液泡系活體染色及觀察 一 原理在動物細胞內(nèi)， 但凡由膜所包圍的小泡和液泡除線粒體外都屬于液泡系， 包括高爾基器、 溶酶體、微體、消化泡、自噬小體、 殘體、胞飲液泡和吞噬泡， 都是由一層單位膜包圍而成。 軟骨細胞內(nèi)含有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和興旺的高爾基復(fù)合體， 能合成與分泌軟骨粘蛋白及膠原 纖維等，因而液泡系興旺。中性紅是液泡系特殊的活體染色劑， 只將液泡系染成紅色， 在細胞處于生活

23、狀態(tài)時， 細 胞質(zhì)及核不被染色，中性紅染色可能與液泡中的蛋白有關(guān)。(二 方法取一只蟾蜍，破壞腦和脊髓，剪開胸腔，取胸骨劍突軟骨最薄局部的一小片，放在載片上，滴兩滴1/3000中性紅染液，染色 810分鐘，用吸水紙吸去染液，加一滴Ringer 氏液，蓋上蓋片，吸去多余 Ringer 氏液。(三 結(jié)果顯微鏡下觀察， 可見軟骨細胞為橢圓形，細胞核周圍有許多染成玫瑰紅色大小不一的小泡，即軟骨細胞液泡系。二、大白鼠脛骺軟骨細胞電鏡照片的觀察動物細胞液泡很小， 即使是活體染色也只能看出是一個小點， 為了進一步看清液泡的結(jié) 構(gòu)我們有必要觀察軟骨細胞的電鏡照片。大白鼠脛骺骨細胞電鏡照片， 細胞核與核仁很清楚，

24、 細胞質(zhì)中有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 液 泡系興旺，液泡由單層膜包圍，細胞周邊有液泡釋放?！咀?業(yè) 】繪制光鏡下軟骨細胞液泡系。 時偉紅編 實驗四 細胞中的微絲染色及微絲與細胞形態(tài)的實驗觀察【實驗?zāi)康?】 掌握微絲的染色方法，了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下微絲的根本形態(tài)結(jié)構(gòu)?！緦嶒炗闷?】一、材料和標(biāo)本 蓋片培養(yǎng)的成纖維細胞三片。二、 器材和儀器光學(xué)顯微鏡一臺、鑷子一把、小平皿六個、載片三個、吸水紙、37C恒溫箱。三、試劑 PBSpH7.2、2% Trit on X 100 液、M緩沖液、3%戊二醛固定液、0.2 % 考馬斯亮蘭染液、100卩g/ml的細胞松馳素 B DMEM培養(yǎng)液?！緦嶒瀮?nèi)容 】一、

25、成纖維細胞微絲的染色及其對細胞松馳素B的反響一原理微絲普遍存在于多種細胞， 對細胞的形狀和運動有一定作用。細胞松馳素B可與微絲的亞單位肌動蛋白結(jié)合，從而破壞微絲，改變細胞的形狀。二細胞松馳素B處理成纖維細胞與染色觀察 1在平皿中有三張成纖維細胞貼壁生長的蓋片，在超凈工作臺內(nèi)將一張蓋片移入另一 皿中繼續(xù)培養(yǎng)，用作對照。2在有兩片的平皿內(nèi)加 100卩g/ml的細胞松弛素 B 4滴繼續(xù)培養(yǎng)半小時。3. 將用細胞松弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養(yǎng)液洗五次在平皿內(nèi)換五次培養(yǎng)液，每次都要搖動 ，繼續(xù)培養(yǎng)、觀察。兩小時后細胞形狀恢復(fù)，接近正 常。4 對恢復(fù)的蓋片與第一張沒用藥的蓋片一同做

26、染色處理。5.染色處理 將需染色的蓋片放入盛有 PBS的平皿內(nèi)用吸管輕輕吹洗蓋片，換液三次，每次3分鐘， 洗去培養(yǎng)液。 將蓋片移入2% Trit on X 一 100液，置37C恒溫箱內(nèi)處理 2030分鐘，以提取骨 架以外的蛋白質(zhì)，使骨架圖像清晰。 立刻將蓋片移入 M緩沖液，換洗三次，每次 3分鐘。M緩沖液有穩(wěn)定細胞骨架的 作用。 將蓋片移入 3%戊二醛固定 15分鐘。 將蓋片移入 0.2 %考馬斯亮蘭染液中，染色 15 分鐘。然后小心地用自來水沖洗，空 氣枯燥。 三結(jié)果光鏡觀察， 微絲聚集成的張力纖維束被染成藍色。 在沒用藥的標(biāo)本上， 成纖維細胞多數(shù) 有突起，微絲沿突起規(guī)那么排列； 用細胞松

27、馳素 B 處理的標(biāo)本， 由于微絲被破壞突起縮回，多 數(shù)細胞形狀變圓； 用藥處理后又洗去藥的標(biāo)本， 由于解除了藥的作用， 肌動蛋白重新聚臺形 成微絲，細胞形狀恢復(fù)正常。二、 麗藻細胞內(nèi)胞質(zhì)環(huán)流及其對細胞松弛素B的反響 一原理麗藻細胞大， 整個細胞的中央為大液泡占據(jù)。 靠近液泡是一層溶膠樣流動的內(nèi)質(zhì)， 在內(nèi) 質(zhì)與質(zhì)膜之間， 為靜止的外質(zhì)， 其中含有葉綠體。 內(nèi)質(zhì)中含有許多顆粒，可以清楚地看到胞 質(zhì)環(huán)流。在麗藻細胞中的微絲與胞質(zhì)環(huán)流有密切關(guān)系。 成束的微絲出現(xiàn)在外質(zhì)與內(nèi)質(zhì)接口 溶 膠和凝膠接口并交織一起，與環(huán)流方向平行。用細胞松弛素B處理后，就可抑制胞質(zhì)的環(huán)流運動。 二 方法1 .剪下一小塊麗藻葉片

28、12cm,置于載片上，蓋上蓋片。2 觀察陽光充足時效果較好 。3 .再取一塊麗藻葉片，滴一滴細胞松弛素B， 1015分鐘后蓋上蓋片，觀察。4 .洗去藥物，再觀察。 三 結(jié)果在麗藻內(nèi)質(zhì)中可以看到胞質(zhì)環(huán)流，用細胞松弛素B處理后，胞質(zhì)環(huán)流停止，洗去藥物，又出現(xiàn)胞質(zhì)環(huán)流。三、微絲的電鏡照片觀察恒河猴脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維中微絲電鏡照片，可見微絲是實心結(jié)構(gòu)，直徑58cm,它均勻地分散于細胞基質(zhì)中，或排列成束和網(wǎng)狀?！咀?業(yè) 】 繪出三種不同情況下細胞中微絲的分布。 時偉紅編 實驗五細胞器的光鏡切片和電鏡照片觀察【實驗?zāi)康摹坑^察除了實驗二五以外的其它細胞器在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下的根本形態(tài)結(jié)構(gòu)?！緦嶒瀮?nèi)容】一、

29、三種細胞器的光鏡切片一高爾基復(fù)合體 Golgi Complex用鍍銀法染色的豚鼠脊神經(jīng)節(jié)光鏡切片：神經(jīng)細胞因合成運輸大量的蛋白質(zhì)而含有興旺的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體， 在低倍鏡下觀察，神經(jīng)節(jié)的假單極細胞體被神經(jīng)束分隔成群。神經(jīng)細胞的胞體呈圓形或橢圓形。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，細胞中央不著色的圓形區(qū)為細胞核。在核的周圍有黑褐色顆粒狀或呈不規(guī)那么的條索狀結(jié)構(gòu)即為高爾基復(fù)合體。圖5 一 l神經(jīng)節(jié)細胞示高爾基復(fù)合體二尼氏小體Nissl ' s Body甲苯胺蘭染色的牛脊髓涂片， 尼氏小體即光鏡下的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 在低倍鏡卡觀察，染成藍色 的大三角形、星形細胞就是脊髓前角神經(jīng)細胞， 染色較深的小細胞為神經(jīng)膠質(zhì)

30、細胞。 轉(zhuǎn)換高 倍鏡觀察，可見脊髓前角神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)中許多藍色顆粒或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即為尼氏小體。圖5 2脊髓前角神經(jīng)細胞的尼氏小體三中心體Centrosome鐵蘇木素染色的馬蛔蟲子宮切片, 卵殼，細胞與卵殼之間的腔叫卵殼腔。 它與周圍致密的細胞質(zhì)中心球，在低倍鏡下觀察可見許多受精卵細胞，細胞的外面有在某些卵細胞內(nèi)，于核附近有圓形的小粒一一中心粒， 組成中心體。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察， 可見中心體的外圍還有星狀的放射細絲即星體。染色體中心體圖53馬蛔蟲受精卵細胞、分裂中期示中心體二、六種細胞器的電鏡照片一高爾基復(fù)合體 Golgi Complex人體胃粘膜細胞高爾基復(fù)合體電鏡照片：細胞質(zhì)中有散在的高爾基復(fù)合體

31、，其結(jié)構(gòu)要由三局部組成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它們共同構(gòu)成緊密重疊的囊泡結(jié)構(gòu)。扁平囊約38層，它們平行排列，略彎曲成弓形。凸出的一側(cè)為形成面，可見許多小囊泡，凹入的一側(cè) 為成熟面，可見扁平囊末端呈球形膨大，在分泌細胞中膨大局部不斷脫離扁平囊，形成分泌泡。 二內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Endoplasmic Reticulum人胃壁細胞、恒河猴脊髓前角運動神經(jīng)細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)電鏡照片：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在分泌蛋白質(zhì)的細胞中較興旺，在細胞核周圍可見有較密集的膜層結(jié)構(gòu)即為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它們大都呈片狀排列，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可與細胞核膜相通連。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜外外表附著許多小顆粒，即核糖體。人胃粘膜鹽酸細胞、 小鼠睪丸間質(zhì)細胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)電

32、鏡照片：鹽酸細胞分泌鹽酸， 細胞中密集的圓泡，無核糖體附著即滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參加鹽酸的合成。小鼠睪丸間質(zhì)細胞中含有豐富的分支管狀滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，合成固醇類的雄激素。 三中心粒Centriole白血病細胞的中心粒電鏡照片：中心粒是相互垂直的兩個短筒狀小體，從橫切面看，每個短簡由9組三聯(lián)體微管組成。 四溶酶體Lysosome小鼠肝細胞、人胃癌細胞溶酶體電鏡照片：溶酶體為一層單位膜包圍的囊狀結(jié)構(gòu)。溶酶體呈球形，質(zhì)地均勻，吞噬性溶酶體依結(jié)合物不同而呈不同形態(tài)，溶酶體主要含酸性水解酶。 五核糖體Ribosome小鼠腎細胞核糖體電鏡照片： 核糖體是由核糖核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成的大小亞基組成的橢圓形顆粒，附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的

33、稱附著核糖體，此外還有散在于細胞質(zhì)中的游離核糖體，而多個核糖體由mRNA串連在一起叫多聚核糖體。 六細胞核Cell Nucleus豚鼠肝細胞核、人胃癌細胞核電鏡照片：可見核膜由雙層單位膜構(gòu)成。內(nèi)外核膜相距一定的距離結(jié)合形成核孔。核膜外層也附著核糖體并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相通。核中的海綿狀球形結(jié)構(gòu)就是核仁，它由纖維和顆粒構(gòu)成。在核膜內(nèi)面和核仁四周，著色較深的為異染色質(zhì)，其余著色較淺的是常染色質(zhì)。三、觀察恒河猴脊髓前角運動細胞的電鏡照片，總結(jié)細胞的超微結(jié)構(gòu)照片中是一個多角形的脊髓前角運動細胞，細胞外表以非常細的線條與周圍分界，就是細胞膜。中央有圓形的細胞核，核膜密布核孔，核膜內(nèi)側(cè)少量著色深而致密的是異染色質(zhì)，

34、 色淺的是常染色質(zhì)。核中央海綿狀的一團深色結(jié)構(gòu)是核仁。細胞膜與核膜之間為細胞質(zhì)。其扁平囊細中有許多膜性結(jié)構(gòu)形成扁平囊狀或管泡狀，密集成排的膜上附有顆粒，這就是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 分散于細胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間的許多圓形或棒狀膜結(jié)構(gòu)是線粒體。 在核的四周可見小泡， 等集合形成的高爾基復(fù)合體。 在細胞質(zhì)中還可見一些不規(guī)那么形的黑色致密結(jié)構(gòu)是脂褐質(zhì)， 胞質(zhì)基質(zhì)中分散存在纖細的微絲和微管是細胞骨架成份。 時偉紅編 實驗六 細胞生理活動的實驗觀察【實驗?zāi)康?】通過制片與觀察加深理解細胞的運動、吞噬等生理活動?！緦嶒炗闷?】一、材料和標(biāo)本 雄性蟾蜍、小白鼠、 l 雞血懸液、 6淀粉肉湯、草履蟲。二、器材和儀器 光鏡、

35、2ml 注射器、載玻片、蓋玻片、解剖器材、滴管、移液管、試 管、玻璃片、黑紙。三、試劑 0.3 臺盼蘭、 1剛果紅?！緦嶒瀮?nèi)容 】一、細胞的吞噬活動 一 原理 白細胞是機體防御系統(tǒng)中能游走的單位。它分為粒細胞系、單核細胞系、淋巴系三類。它們有許多生理功能， 如游走性、 變形運動、 趨化性、 吞噬異物等。 在白細胞中， 以粒細胞、 單核細胞的吞噬活動較強， 故稱此二類細胞為吞噬細胞。 單核細胞由血液進入組織后逐漸演 變成巨噬細胞。 吞噬細胞主要靠吞噬來處理異物。 吞噬細胞首先由于趨化作用而向異物游走， 然后伸出偽足包圍異物， 并發(fā)生內(nèi)吞作用形成吞噬泡將異物吞入細胞， 繼而溶酶體與吞噬泡 融合消化

36、異物。( 二 l 小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬活動的觀察 實驗前二天，每天向小鼠腹腔注射6淀粉肉湯0. 5 1ml(含 0.3臺盼蘭，起標(biāo)記作用 ，以刺激腹腔產(chǎn)生較多的巨噬細胞 此步由教師在實驗前進行完畢。2 實驗時，每組取一只經(jīng)上述處理的小鼠，腹腔注射1 雞血懸液 0.51ml，注射后輕揉小鼠腹部以使紅細胞懸液分散均勻。3 1 小時后，用頸椎脫位法處死小鼠，迅速剖開小鼠腹壁，向腹腔注入05ml1ml生理鹽水，用牙簽輕輕攪拌使生理鹽水與腹腔液混勻。4用注射器抽取腹腔液，滴片，然后蓋上蓋片。5鏡檢，高倍鏡下畫圖記錄所見結(jié)果。二、暗視野觀察細胞的纖毛和鞭毛運動(一 原理暗視野照明法是一種不使照射被檢物體

37、的光線直接進入物鏡的照明方法。常常用它來觀察沒有染色的活體細胞或膠體粒子。 利用此照明法， 在鏡檢時不能直接看到通過標(biāo)本的照明 光線，只有被檢物體反射或衍射的光線進入物鏡可以提高分辨率， 在暗視野中可以看到明亮 的被檢物體的存在和運動，但它們的內(nèi)部結(jié)構(gòu)卻看不清楚。 二 自制遮光板變普通顯微鏡為“簡單的暗視野顯微鏡。步驟：1將顯微鏡聚光器調(diào)到最高位，用低倍鏡調(diào)焦至清楚。 2取下目鏡，從鏡筒中觀察并調(diào)節(jié)光圈的大小，使其與鏡筒中所見物鏡的視野相等。 3放一塊透明玻璃于載物臺透光孔上，用尺子測量光圈孔徑。4按照圖 6-1 的形狀，用黑紙剪成與調(diào)節(jié)后光圈孔徑一樣大小的中央遮光板。5將中央遮光板放置在顯微

38、鏡的濾光框上，即可進行標(biāo)本的暗視野觀察。 注：如果使用高倍鏡觀察標(biāo)本時，應(yīng)按高倍鏡調(diào)焦的視野大小重新制作中央遮光板。a.光圈孔徑b .濾光片直徑三觀察蟾蜍上頜粘膜上皮細胞的纖毛運動步驟：1 .用搗毀腦脊髓的方法處死蟾蜍。2 .腹部向上將蟾蜍固定在蠟盤上。3 .沿蟾蜍二側(cè)口角向后剪開約I厘米，將下頜翻轉(zhuǎn)固定在腹部。4 .在上頜中線距喉頭 1厘米處放置臘屑，觀察臘屑向什么方向移動？記錄臘屑開始移動到消失的時間見圖6-2蟾蜍口腔內(nèi)面圖。5 .然后，用眼科剪刀剪取咽頭前部的上頜粘膜約2X 2cm2小塊，用牙簽挑取剪下的粘膜，將縱切面貼于載片上。6 .加一滴生理鹽水于載玻片標(biāo)本上，加蓋玻片，鏡檢。丄曲溝

39、外孔圖62蟾蜍口腔內(nèi)面圖結(jié)果：1 .在低倍鏡下觀察上頜粘膜細胞纖毛運動的現(xiàn)象。2 .換高倍鏡仔細觀察纖毛有規(guī)律的運動。四暗視野觀察蟾蜍精子的鞭毛運動步驟：1 .將前面實驗所用蟾蜍沿腹中線開腹，暴露出黃色圓柱狀精巢。2 .剪取一側(cè)精巢于盛有自來水的平皿中，用鑷子夾住精巢的一端，清洗去血污。3 .移取洗凈的精巢于另一干凈的平皿上，用眼科剪將精巢充分剪碎后，參加數(shù)滴自來 水混勻。4 .用吸管吸取平皿內(nèi)液體， 滴一滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，稍待23分鐘于鏡下觀察。結(jié)果：1 在低倍鏡下可見到視野中有許多精子：頭部呈長錐形，尾為細長的線狀結(jié)構(gòu)。2 置高倍鏡下觀察：可見有許多靠尾部鞭毛彎曲擺動驅(qū)使而運動的精

40、子，測量鞭毛長 度。三、草履蟲纖毛運動及食物泡的形成圖63 草履蟲草履蟲是一種單細胞動物。蟲體由一個細胞組成，能執(zhí)行復(fù)雜的生理功能。其體表，均勻密布纖毛，為運動細胞器。身體的前部有口溝，由前端斜向伸至體中部，口溝的底部為胞口， 下部一短管斜向后部而入胞質(zhì)， 稱胞咽。纖毛有規(guī)律的擺動使食物在胞 咽聚結(jié)形成食物泡吞噬泡，最后脫離胞咽入胞質(zhì)。 食物泡隨細胞質(zhì)由體后端到前端不停環(huán) 流，并與溶酶體含酸性水解酶融合，行使細胞內(nèi)消化。根據(jù)食物泡中剛果紅指示劑的顏色變化酸性時，為紅色；近中性時，為黃色；堿性時，為藍色?？梢杂^察到消化過程。實驗步驟：1 取一滴草履蟲培養(yǎng)液于載玻片上，放上幾根棉花纖維，以減慢草履

41、蟲的運動。加蓋 玻片，制成臨時裝片。2 觀察草履蟲的運動方式觀察時光線可調(diào)暗些：可見鏡下有許多樣似倒置鞋底的草 履蟲，體表纖毛不斷擺動，蟲體以其中軸左旋前進，假設(shè)遇阻力那么試觸后即刻回避而轉(zhuǎn)向。3 .觀察草履蟲的食物泡的形成：1在蓋玻片一側(cè)加一滴I %的剛果紅指示劑，用吸水紙從另一側(cè)吸引使指示劑進入蓋片 下方，選一運動較緩慢的草履蟲，移入高倍鏡觀察吞噬活動。2幾分鐘后可見草履蟲體內(nèi)出現(xiàn)許多紅色食物泡，隨著食物泡不停的在胞質(zhì)中環(huán)流，食物不斷消化，泡內(nèi)酸性減弱或近中性，顏色漸漸呈黃色，食物泡漸小，最后食物泡顏色呈藍 色，不能被消化的殘渣，環(huán)流到身體后部的胞肛排出，不排出時不易見到胞肛。 【作 業(yè)

42、】1 畫圖記錄細胞吞噬實驗所見結(jié)果，小鼠巨噬細胞吞噬實驗如何解釋細胞內(nèi)臺盼蘭的 著色？2 在觀察細胞纖毛和鞭毛運動實驗中 , 記錄一下臘屑從開始運動到消失的時間。3 鞭毛和纖毛有何異同？ 朱亞勤編 實驗七 細胞組分的化學(xué)反響【實驗?zāi)康?】了解核酸、 蛋白質(zhì)、 糖及酶的細胞化學(xué)反響原理， 掌握 Brachet 反響及堿性蛋白、 酸性 蛋白、糖原和過氧化物酶的細胞化學(xué)染色方法?！緦嶒炗闷?】一、材料和標(biāo)本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝臟石臘切片、培養(yǎng)的 Hela 細胞。二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡、解剖器材、蠟盤、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、 水浴箱。三、試劑PBS緩沖液pH7.2、甲基綠一呱咯寧醋酸

43、緩沖液、純丙酮、1/2丙酮+1/2二甲苯、 純二甲苯、 70乙醇、 5三氯醋酸、 0.1 堿性固綠、 0.1 酸性固綠、 0.5 硫酸銅、 聯(lián)苯胺混合液、 1 番紅、 無水乙醇、過碘酸酒精液、 Schiff 氏酒精液、亞硫酸水、 Ehrlieh 蘇木精、 95乙醇、 Carnoy 固定液 甲醇：冰醋酸 =3:1 ，體積比 【實驗內(nèi)容 】細胞的組織化學(xué)方法， 是研究細胞成分常用的方法之一。 它是利用化學(xué)試劑與細胞內(nèi)的 某些物質(zhì)進行化學(xué)反響， 從而在細胞局部形成有色沉淀物， 再通過顯微鏡對組織內(nèi)的生物化 學(xué)成分進行定性、定位、定量研究。一、Brachet反響一顯示細胞內(nèi)的 DNA和RNA 一原理細

44、胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反響， 一般認(rèn)為這是由于帶有負電荷的核酸對堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的 DNA呈藍綠色，呱咯寧染低聚分子的 RNA呈紅色。由此對細 胞中的DNA和RNA進行定位、定性、和定量分析。 二方法1 .接種Hela細胞于蓋片上并培養(yǎng) 2448小時，使長成單層。2 取出蓋片，用 PBSpH7.2 輕輕沖洗蓋片外表去除殘渣。3 .放入Carnoy固定液中固定I小時。4 浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中 30 分鐘染色。5 取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗 23次23秒鐘左右 ，吸去水分。放入純丙

45、酮 中分色 2 3 秒鐘。6. 放入l / 2丙酮+1/2二甲苯中5秒鐘。7 放入純二甲苯中透明 5分鐘。8滴一滴中性樹膠于載玻片上，將蓋片標(biāo)本面朝下封片。9鏡下觀察三結(jié)果細胞質(zhì)被染成淺紅色，細胞核被染成藍綠色，而其中核仁被染成紫紅色參照照片。二、細胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示一原理由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團的數(shù)目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。 如在生理條件下， 整個蛋白質(zhì)所帶負電荷多， 那么為酸性蛋 白質(zhì)；帶正電荷多，那么為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用不同 pH值的固綠染液分別染色，細胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來。二

46、方法 1以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤中，剪開胸腔，翻開心包。小心將 心臟剪一小口， 取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫晾 干。2. 將涂片作好標(biāo)記放在 70乙醇中固定 5 分鐘，室溫晾干。3. 放入5%三氯醋酸中60C 30分鐘，抽提出核酸。4清水沖洗屢次 3分鐘以上，以沖去痕跡的三氯醋酸。5. 濾紙吸干玻片上水分。6. 一張片放入0.1 %堿性固綠pH8.08.5中染色1015分鐘，另一張片放入0.1 %酸 性固綠pH2.02.5染色510分鐘。7. 清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。三結(jié)果 經(jīng)堿性固綠染色片中，胞質(zhì)、核仁不著色，細胞核大局部被染成綠色，是為

47、堿性蛋白質(zhì)存在處參照照片 。經(jīng)酸性固綠染色片中，因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白，被染成綠色。三、細胞內(nèi)過氧化物酶的顯示一原理過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物， 用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本， 細胞內(nèi)的過氧化物酶 能把聯(lián)苯胺氧化為藍色的聯(lián)苯胺藍， 進而變?yōu)樽厣a(chǎn)物， 因而可以根據(jù)顏色反響來判定過氧 化物酶的有無或多少。二方法1. 取小鼠一只，以頸椎脫位法將其處死，迅速剖開其后肢暴露出股骨，將股骨一端斜 向剪斷，用PBS緩沖液濕潤過的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上。2. 推片，室溫晾干。3. 將涂片放入 0.5 %硫酸銅中浸 30 秒1 分鐘。4. 取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反響6分鐘。5. 清水沖洗

48、，放入 1%番紅溶液中復(fù)染 2分鐘。6. 清水沖洗，室溫晾干。7. 鏡檢或封片后鏡檢。三結(jié)果 涂片中可見一些細胞中存在著藍色或棕色顆粒，為過氧化物酶所在位置。四、過碘酸雪夫反響PAS顯示細胞內(nèi)糖原參照照片和示教片 一原理組織、細胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS法來顯示，其化學(xué)根底是利用過碘酸 的氧化作用，翻開碳鏈形成醛，生成的醛基與 Schiff 試劑中的無色品紅反響形成紫紅色化 合物。 二方法1 .取I 2mn厚的肝組織塊，用 Carnoy氏液4C固定46小時。2 .乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋，切片。3 .用 70%乙醇展片。4 .脫蠟：二甲苯15分鐘t二甲苯25分鐘t 100%

49、乙醇5分鐘t含1 %火棉膠的乙 醇液1分鐘t 70%乙醇1分鐘。5 .直接浸入過碘酸酒精液反響 515分鐘，經(jīng) 70%乙醇洗片刻。6.浸入 Schiff 氏酒精液反響 15分鐘。7 亞硫酸水洗三次，以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素，以及擴散的染料。8 .流水沖洗35分鐘。9 蒸餾水洗。10 .浸入 Ehrlich 蘇木精復(fù)染 2030 秒，使細胞核著色。10分鐘二次。11 .脫水：95 %乙醇3分鐘二次t 100%乙醇3分鐘二次t二甲苯透明12 .加蓋片鏡檢或樹膠封固后鏡檢。 三 結(jié)果 細胞中呈紫紅的顆粒即為糖原 參照照片 。五、蘇丹川染色一一顯示細胞內(nèi)脂肪 示教片作 業(yè) 】1. 用彩色筆繪出B

50、rachet反響及PAS反響的鏡下所見。2. 說明著色的堿性蛋白可能是什么物質(zhì) ? 紀(jì)曉輝編 實驗八 細胞核與線粒體的分級別離【實驗?zāi)康?】通過細胞勻漿和離心的方法分級別離細胞的組分，以了解其原理及過程。 【實驗用品 】一、材料和標(biāo)本 小白鼠、冰塊。二、器材和儀器 玻璃勻漿器、 普通離心機、 臺式高速離心機、 普通天平、 光學(xué)顯微鏡、 載玻片、蓋玻片、刻度離心管、高速離心管、滴管、 10ml 量筒、 25ml 燒杯、玻璃漏斗、解 剖剪、鑷子、吸水紙、紗布、螬盤、平皿、牙簽。三、試劑0.25mol / L蔗糖一 0.003mol / L氯化鈣溶液、1 %甲苯胺蘭染液、0.02 %詹 納斯綠B染液

51、、0.9 % NaCI溶液。【實驗內(nèi)容 】一、原理細胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同， 在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同， 根據(jù)這 一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細胞內(nèi)各種組分分級別離出來。別離細胞器最常用的方法是將組織制成勻漿， 在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進行分 離，其過程包括組織細胞勻漿、 分級別離和分析三步， 這種方法已成為研究亞細胞成分的化 學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。勻漿 Homogenization 低溫條件下，將組織放在勻漿器中，參加等滲勻漿介質(zhì) 即0.25mol / L蔗糖一 0.003mol /L氯化鈣進行破碎細胞使之成為各種細胞器及其包含物的勻 漿。分級別離

52、Fractionation 由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀， 再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來，從而使各種細胞結(jié)構(gòu)，如細胞核、 線粒體等得以別離。 由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時均勻分布在整個離心管 中，所以每級離心得到的第一次沈淀必然不是純的最重的顆粒， 須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純 化。分析 分級別離得到的組分，可用細胞化學(xué)和生化方法進行形態(tài)和功能鑒定。二、細胞核的別離提取 一 操作步驟1 用頸椎脫位的方法處死小白鼠后， 迅速剖開腹部取出肝臟， 剪成小塊 去除結(jié)締組織 盡快置于盛有0.9 %NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去外表

53、的液體。2 將濕重約 1g 的肝組織放在小平皿中，用量筒量取 8ml 預(yù)冷的 0.25mol L 蔗糖一 0.003mol L 氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部參加。3 剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨35次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片，做好標(biāo)記，自然枯燥。4 .將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機，以2500rpm,離心15分鐘； 緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待別離線粒體用；2 同時涂一張上清液片做好標(biāo)記，自然枯燥；3余下的沉淀物進行下

54、一步驟。5 .用6ml0.25mol/L 蔗糖一 0.003mol / L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清， 將殘留液體用吸管吹打成懸液， 滴一滴于干凈的載玻片上， 涂片， 自然枯燥。6 將、涂片用I %甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。 二 結(jié)果分別于高倍鏡下觀察三張涂片，描述鏡下所見。三、高速離心別離提取線粒體 一 操作步驟1 .將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以 17000rpm離心20 分鐘，棄上清，留取沉淀物。2 .參加0.25mol/ L蔗糖一 0.003mol /L氯化鈣液Iml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm 離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，參加0.1ml 0.25mol/ L蔗糖一 0.003mol /L 氯化鈣溶液混勻成懸液 可用牙簽 。3 取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上 分別標(biāo)記、 涂片 ，各滴 一滴0.02 %詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20分鐘。 二