生活飲用水微生物指標(biāo)檢驗(yàn)

1、 檢測依據(jù)：GB 5750-2006生活飲用水衛(wèi)生檢驗(yàn)規(guī)范掌握水樣采集規(guī)則及注意事項(xiàng)。熟悉常用水衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)指標(biāo)。熟悉菌落總數(shù)、大腸菌群、耐熱大腸菌群的測定方法及檢測意義。學(xué)會(huì)對所檢測的水樣作綜合分析。項(xiàng)目單位限值說明總大腸菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出一般性污染耐熱大腸菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出指示糞便污染大腸埃希氏菌MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出指示糞便污染菌落總數(shù)CFU/mL100一般性污染賈第鞭毛蟲個(gè)/10 L1腸道原蟲隱孢子蟲個(gè)/10 L1腸道原蟲 水體的微生物污染問題日趨嚴(yán)重。 在各種水體，特別是污染水體中存在有大量的有機(jī)物

2、質(zhì)，適于各種微生物的生長。 水體中微生物污染的來源：土壤，以及人類、動(dòng)物的排泄物污染。 水體中少數(shù)致病微生物（主要來自人或動(dòng)物的糞便污染）可導(dǎo)致某些腸道傳染病傳播。 水微生物檢測可用于評價(jià)水質(zhì)情況，預(yù)報(bào)水質(zhì)的污染趨勢，以保證水質(zhì)的衛(wèi)生安全。 在實(shí)際工作中，對水質(zhì)衛(wèi)生質(zhì)量的評價(jià)和控制，是無法對水體中各種可能存在的致病微生物一一進(jìn)行檢測。 一般選擇有代表性的一種或一類微生物作為指示菌，通過對指示菌的檢測，來了解水體是否受到過的微生物污染，是否有腸道病原微生物存在的可能。 菌落總數(shù)(aerobic bacterial count) 是指1ml水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37經(jīng)48h培養(yǎng)后，所生長的細(xì)菌

3、菌落的總數(shù)。 檢測意義：作為一般性污染的指標(biāo)，即評價(jià)被檢樣品的微生物污染程度和安全性。水樣菌落總數(shù)越多，說明水被微生物污染程度越嚴(yán)重，病原微生物存在的可能性越大，但不能說明污染的來源。 總大腸菌群(coliform bacteria) 是指一群需氧及兼性厭氧的，37生長時(shí)能使乳糖發(fā)酵，在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 檢測意義：作為糞便污染的指標(biāo)。水樣總大腸菌群數(shù)的含量，表明水被糞便污染的程度，而且間接地表明有腸道致病菌存在的可能。耐熱大腸菌群（thermotoletant Coliform Organisms）：在4444.5下具有與大腸菌群相同發(fā)酵及生物化學(xué)性能的菌群。注意：我國

4、習(xí)慣上把耐熱大腸菌群稱為“糞大腸菌群”。水樣采集；菌落總數(shù)的測定；總大腸菌群的測定;耐熱大腸菌群的測定。水樣水樣總大腸菌群總大腸菌群菌落總數(shù)菌落總數(shù)報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告耐熱大腸菌群耐熱大腸菌群或大腸埃希氏菌或大腸埃希氏菌報(bào)告報(bào)告 采樣原則 所采集的樣品具有代表性。 采樣容器：選擇無菌硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。 不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待測組分；不與待測組分發(fā)生反應(yīng)。保證從采樣到分析期間，樣品各組分的濃度不發(fā)生改變。 微生物樣品必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證在運(yùn)送、貯存過程中不受污染。 自來水水樣：先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再開放水龍頭使水流5 min（經(jīng)常用水的水龍

5、頭放水13min）后，采集水樣于無菌玻璃瓶，約占瓶容量80%，以便搖勻水樣。 水源水水樣：選有代表性的地點(diǎn)及可疑地方，一般距水面下1015cm采樣。采樣后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。 注意事項(xiàng) 嚴(yán)格無菌操作。 做好標(biāo)記：采得水樣后應(yīng)立即記錄水樣名稱、地點(diǎn)、時(shí)間等內(nèi)容。 從速送檢。水樣從采集到檢驗(yàn)不應(yīng)超過2h，在4下保存不應(yīng)超過24h。1、滅菌吸管 10mL、1mL刻度吸管分別包好，160干烤2h滅菌2、9mL滅菌生理鹽水3、相應(yīng)的滅菌培養(yǎng)基4、檢驗(yàn)前 ，無菌室及超凈臺(tái)用紫外線燈照射30min定義： 是指水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37培養(yǎng)48h后，所得1mL水樣所含細(xì)菌菌落的總數(shù) 。培養(yǎng)基：營養(yǎng)

6、瓊脂 設(shè)備：放大鏡/菌落計(jì)數(shù)器1 m L 飲 用 水 水 樣平皿1 m L 水 源 水 水 樣1 0 倍系列稀釋5 0 營養(yǎng)瓊脂3 6 1 培養(yǎng)4 8 h計(jì) 數(shù)平行樣空白樣方法 水樣搖勻20次左右，使細(xì)菌分散。 傾注培養(yǎng)：無菌吸取1ml水樣分別置于2個(gè)空平皿，另一個(gè)作空白對照。再傾注15ml瓊脂（約45）于平皿中旋轉(zhuǎn)，混勻待瓊脂凝固后倒置3748h。 菌落計(jì)數(shù)：用肉眼或放大鏡檢查，計(jì)數(shù)平皿內(nèi)菌落數(shù)目。 結(jié)果分析與報(bào)告 計(jì)算平均菌落數(shù)： 報(bào)告方式：菌落總數(shù)(cfu/ml)。 cfu：colony forming units 當(dāng)檢樣的菌落數(shù)為l100時(shí)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字

7、報(bào)告。 國家標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-2006）規(guī)定生活飲用水菌落總數(shù)每毫升不得超過100個(gè)。 器材與試劑 無菌1ml吸管6支/組，無菌10ml吸管1支/組。 無菌平皿9個(gè)/組，營養(yǎng)瓊脂。 90ml滅菌鹽水1瓶（內(nèi)置適量玻璃珠），9ml滅菌鹽水管3支。 方法 稀釋水樣： 無菌吸10ml混勻水樣注入90ml滅菌水瓶中,混勻成1:10水樣。 取1:10水樣1ml注入9ml滅菌試管中混勻成1:100水樣。同法稀釋成1:1000, 1:10000水樣。 方法 傾注培養(yǎng)： 用1ml無菌吸管吸取23個(gè)適當(dāng)濃度的稀釋液1ml,分別注入無菌平皿中，每個(gè)稀釋度應(yīng)同時(shí)做2個(gè)平皿，另取一平皿作空白對照。再做傾注培養(yǎng)(方法

8、同飲用水)。 菌落計(jì)數(shù)：方法同飲用水。 結(jié)果分析與報(bào)告 計(jì)算不同稀釋度的平均菌落數(shù)： 稀釋度的選擇和菌落總數(shù)報(bào)告方式： 首先選擇平均菌落在30300之間者進(jìn)行計(jì)算。 計(jì)算方法和報(bào)告方式如表1所示。 由表2可判定水質(zhì)被污染的程度。表2 一般水源水中菌落總數(shù)與水清潔程度的關(guān)系 水的類別最清潔水清潔水不太清潔水不清潔水極不清潔水菌落總數(shù) cfum110100100100010001000010000100000100000注意事項(xiàng) 菌落總數(shù)測定中，應(yīng)選擇合適的稀釋度進(jìn)行。（生活飲用水，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每毫升不得超過100個(gè)，因此可以直接吸取1毫升到平板進(jìn)行培養(yǎng)） 各稀釋管、相應(yīng)平皿做好標(biāo)記。包括：水樣名

9、稱、稀釋度、時(shí)間、小組。 嚴(yán)格無菌操作。進(jìn)行水樣稀釋時(shí)，每一稀釋度均需更換吸管。 傾注時(shí)，要注意營養(yǎng)瓊脂的溫度。 傾入瓊脂后要混勻，待瓊脂凝固后倒置培養(yǎng)。分為三步： 初發(fā)酵試驗(yàn) 平板分離 復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗(yàn)定義： 總大腸菌群指一群在37培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。培養(yǎng)基：乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 二倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基 設(shè)備：顯微鏡二 倍乳 糖蛋 白胨 培養(yǎng) 液 5 管乳 糖蛋 白胨 培養(yǎng) 液 5 管乳 糖蛋 白胨 培養(yǎng) 液 5 管1 0 m L1 m L1 m L水 樣10倍稀釋陰 性報(bào) 告未 檢 出陽 性EM B3 6 1 培 養(yǎng) 2 4 h

10、3 6 1 培 養(yǎng) 2 4 h革 蘭 氏 染 色顯 微 鏡 檢報(bào) 告陰 性無 典 型菌 落無 典 型 細(xì) 菌報(bào) 告陰 性G -無 芽 孢 桿 菌乳 糖蛋 白胨 培養(yǎng) 液3 6 1 培養(yǎng)2 4 h無 產(chǎn) 酸 產(chǎn) 氣報(bào) 告陰 性陽 性M P N 表結(jié) 果 報(bào) 告 乳 糖 發(fā)酵 試 驗(yàn)2 4 h 分 離培 養(yǎng)2 4 h 證 實(shí)試 驗(yàn)2 4 h1 5 管 法 檢 測 步 驟 初發(fā)酵試驗(yàn)：采用乳糖蛋白胨培養(yǎng)液37培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。 平板分離：對陽性管培養(yǎng)物，接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，觀察菌落特征，并進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。 復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗(yàn)：對典型和可疑菌落，接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，進(jìn)行復(fù)發(fā)酵證實(shí)試

11、驗(yàn).， 結(jié)果報(bào)告（MPN）：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)所附檢索表報(bào)告結(jié)果（MPN”最可能數(shù)”）。 初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果多管發(fā)酵法結(jié)果大腸菌群在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的典型菌落特征大腸菌群革蘭氏染色顯微鏡下的形態(tài) 多管發(fā)酵法 耐熱大腸菌群（thermotoletant Coliform Organisms）：在4444.5下具有與大腸菌群相同發(fā)酵及生物化學(xué)性能的菌群。1.1基本性質(zhì) 培養(yǎng)溫度提高到4444.5，在此條件下仍能生長和發(fā)酵乳糖的菌群。 埃希氏菌屬：糞源特異性 耐熱大腸菌群 克雷伯菌屬 腸桿菌屬總大腸菌群 檸檬酸菌屬 其它(陰溝腸桿菌和弗氏檸檬酸桿菌) 注意：耐熱大腸菌在配水系統(tǒng)中是不

12、能繁殖的，除非管網(wǎng)中有充足的營養(yǎng)物質(zhì)（升華需氧量超過10/mgL）,以及管網(wǎng)中沒有余氯。1.2 主要用途 埃希氏大腸菌是最準(zhǔn)確和專一的糞便污染指示 。 耐熱大腸菌的檢出，可認(rèn)為近期水體直接或者間接地受到了糞便污染。注意：GB/5749-2006規(guī)定，如果飲用水檢出總大腸菌群，就必須檢測耐熱大腸菌或者埃希氏大腸菌。 定義： 用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5仍能生長的大腸菌群，稱為耐熱大腸菌群。培養(yǎng)基：1. EC培養(yǎng)基 2. 伊紅美藍(lán)瓊脂 設(shè)備：無特殊設(shè)備 初發(fā)酵（同總大腸菌群），24h 耐熱培養(yǎng)：陽性管接種（44.5度），24h 平板培養(yǎng)：陽性管接種EMB平板，24h乳 糖蛋 白胨 培養(yǎng) 液 5 管乳 糖蛋 白胨 培養(yǎng) 液 5 管二 倍乳 糖蛋 白胨 培養(yǎng) 液5 管1 0 m L1 m L1 m L水 樣10倍稀釋陰 性報(bào) 告未 檢 出陽 性EM B3 6 1 培 養(yǎng) 2 4 h36 1培 養(yǎng) 24h報(bào) 告陰 性結(jié) 果 報(bào) 告 乳 糖發(fā) 酵試 驗(yàn)24h 證 實(shí)試 驗(yàn)24h多 管 發(fā) 酵 法 檢 測 步 驟EC 培養(yǎng) 液44.5 培養(yǎng) 24h不 產(chǎn) 氣產(chǎn) 氣有 典 型 菌 落檢 索 M PN表 耐 熱培 養(yǎng)24h無 典 型 菌 落報(bào) 告陰 性菌落總數(shù)細(xì)菌學(xué)指標(biāo)總大腸菌群耐熱大腸菌群大腸埃