遺傳學IV生化遺傳學

1、遺傳學 IV ：生化遺傳學§1. 族群遺傳學族群遺傳學領域在哈帝（ Hardy）和溫柏格（ Weinberg）提出相關的定理後，投身研究的科學家漸增，成果也日益豐富。假設一族群中針對某一性狀由兩個對偶基因和所控制。對偶基因：Aa基因頻率：pq由於僅有這兩個對偶基因來決定此性狀，故pq1而卵細胞獲得 A 基因的機率為 p，而獲得 a 基因的機率為 q。由上表可得 AA p2， Aa 2pq，aaq2，則 AA ： Aa：aap2：2pq： q2。這種平衡分佈情形即稱為哈溫平衡（ Hardy-Weinberg equilibrium）。若知對偶基因的基因頻率，即可計算出相對應的基因型頻率

2、：（pq）2 1 p22pqq2 1達到哈溫平衡時， AA p2、Aa2pq、 aaq2假設平衡時，對偶基因頻率和基因型頻率都不再隨時間而改變，則對偶基因頻率將在族群中“保持不變”。例：在人類族群中平均每 2000 人會有一人得到囊腫纖維癥（ cystic fibrosis，一種體染色體隱性遺傳疾?。?。令 A 為正常對偶基因， a 為致病對偶基因，則q2（即得病機率） 1 / 2000，故 q（ 1 / 2000）1/21 / 44，而 p43 / 44，2pq（帶有致病基因而不發(fā)病的機率） 2（43 / 44）（ 1 / 44） 0.044 1 / 22，這代表人類族群中約有 5%的人口帶有

3、此致病基因而沒有癥狀。為什麼像囊腫纖維癥這類疾病仍舊在某些族群中普遍盛行呢？一般認為帶有此致病基因而不發(fā)病的人（即基因型 Aa）較不易感染霍亂，因此對偶基因“ a”得以在該族群中保留下來。§2. 生化遺傳學最初有科學家 Archibald Garrod 從酵素的缺陷來探討遺傳疾病的發(fā)生情形，而生化遺傳學正是從實驗遺傳學來分析生物化學的一門學問。實驗系統(tǒng)：酵母菌：單細胞真菌，為真核生物（具有細胞核）。取少量的酵母菌培養(yǎng)於培養(yǎng)皿中，經(jīng)過一段時間其中的每個細胞都會長成一群肉眼可見的小聚落，每個聚落都是由同一個細胞發(fā)展而來，該細胞的每個子代都會長在同一個位置。酵母菌的生命週期酵母菌可分為二倍

4、體（ 2n）與單倍體（ n）兩種形態(tài)，其中為染色體數(shù)，酵母菌有16 對染色體。酵母菌的生命週期如下圖所示：生長條件酵母菌可生長的培養(yǎng)皿環(huán)境的最低營養(yǎng)限度為：具有碳水化合物（可醱酵糖，如葡萄糖、果糖、乳糖）、氮鹽、磷鹽，培養(yǎng)皿可為液態(tài)或固態(tài)。酵母菌可將上述這類物質(zhì)透過生物合成的過程來形成它們所需要的養(yǎng)分。酵母菌也可以生長在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)皿中，這類培養(yǎng)皿可能包含一些常見的巨分子，酵母菌會直接從培養(yǎng)皿中汲取它所需要的養(yǎng)分，而不用再另外合成。換言之，酵母菌是透過酵素的控調(diào)來控制它是否需要啟動生物合成的機制來合成它所需要的養(yǎng)分，或是只要進行從外界汲取養(yǎng)分的機制即可。為深入了解其中的生物合成過程，科學家透

5、過某些方法使酵母菌的一些關鍵酵素失去作用，這類酵母菌也因此不能在特定的環(huán)境下生存。舉例來說，如果想要找出參與胺基酸合成過程（如精胺酸的合成）的基因或是蛋白質(zhì)，可以透過無法合成精胺酸的酵母菌來進行研究，那麼讀者可能就需要從培養(yǎng)的酵母菌中找找是否有這類沒有精胺酸就無法生存的酵母菌存在。尋找突變株的方法（ Mutant Hunt Strategy）先準備好正常的酵母菌，以化學藥劑或放射線破壞酵母菌的 DNA，以造成突變，再將各類突變細胞培養(yǎng)於豐富培養(yǎng)皿（ rich medium，即營養(yǎng)素充足的培養(yǎng)皿） ，接著將其中的酵母菌轉移至最基本培養(yǎng)皿（ minimal medium，即僅含有生存所需之最低營養(yǎng)

6、限度的培養(yǎng)皿）中培養(yǎng)，找出其中不能生長的酵母菌落，則這些酵母菌就是某些生物合成路徑出現(xiàn)缺陷的突變株。利用上述過程即可找出研究所需的突變株。一旦找出突變株，接著就必須找出此突變株需要何種營養(yǎng)素才能在最基本培養(yǎng)皿中生存。舉例來說，若要找出不能合成精胺酸的突變株，可按照下列步驟來進行：將酵母菌培養(yǎng)於豐富培養(yǎng)皿上轉移至最基本培養(yǎng)皿中培養(yǎng)轉移至含精胺酸的最基本培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。所有酵母菌都能在豐富培養(yǎng)皿上生存，但生物合成路徑有缺陷的突變株不能在最基本培養(yǎng)皿上生長，比如說，無法正常合成精胺酸的酵母菌就只能在含精胺酸的最基本培養(yǎng)皿上生存，或無法在缺乏精胺酸的豐富培養(yǎng)皿中生存。透過上述方法在豐富培養(yǎng)皿和最基本培養(yǎng)

7、皿中交錯測試，即可找出各類突變株，這些酵母菌稱為營養(yǎng)缺陷體（ auxotroph）。名詞定義原營養(yǎng)體（ prototroph）：能在最基本培養(yǎng)皿中生存的正常菌種。營養(yǎng)缺陷體（ auxotroph）：無法在最基本培養(yǎng)皿中生存的突變菌種。若由這些方法分離出的突變株不能生長於最基本培養(yǎng)皿中，但可生長於含有精胺酸的最基本培養(yǎng)皿中 ，則這類細胞稱為精胺酸營養(yǎng)缺陷體 （arginine auxotroph）。然而，需要一次分析大量細胞時，上述方法卻不適用，此時通常會改用一種稱為複製平皿（ replica plating）的方法來進行突變株的測試與篩檢。此法由一位女科學家Esther Lederberg所發(fā)

8、展出，最初是使用她的面膜（facialcompact cloth）來進行。當科學家要將培養(yǎng)皿上所有的菌落以彼此相對位置不變的情況下轉移至另一培養(yǎng)基時，會以一片絲絨（velvet）輕壓培養(yǎng)皿上的菌落，再將之輕壓至另一乾淨的培養(yǎng)皿上，透過這個方式，即可篩選出功能有缺陷的突變株。（如下圖所示）有兩種方法可找出我們所需要的菌落：1) 遺傳篩選（ Genetic Screen）：透過先前所介紹的方法找出無法在特定培養(yǎng)皿中生長的菌落，再篩檢出喪失某功能就不能在特定環(huán)境條件下生長的突變株。2) 遺傳選擇（ Genetic Seletion）：透過前述方法找出能夠在特定培養(yǎng)皿上生長的菌落，接著篩選出獲得某功能

9、而得以在一般菌株無法生存的環(huán)境下生長的菌株 ，例如帶有盤尼西林抗生素抗性的菌株則可在含有盤尼西林的培養(yǎng)皿中生長。為研究缺乏精胺酸就無法生存的酵母菌突變株，需要準備大量的精胺酸營養(yǎng)缺陷體（ arginine auxotroph），即最基本培養(yǎng)皿至少要含有精胺酸才能使這類突變株生存其上。若要取得這類突變株，需利用到單倍體酵母菌（ haploid yeast），這類酵母菌僅含有每個基因的其中一個複本 （copy）。另外需要特別注意的是，不宜使用二倍體酵母菌（ diploid yeast），因其具有每個基因的兩個複本，即使其中一個複本發(fā)生突變，另一個正常基因複本一樣可產(chǎn)生酵素來維持正常功能。比較單倍體

10、酵母菌與二倍體酵母菌：-單倍體酵母菌：精胺酸合成酵素基因發(fā)生一個突變即可造成精胺酸營養(yǎng)缺陷（ arg auxotrophy）。-二倍體酵母菌：精胺酸合成酵素基因發(fā)生一個突變不能造成精胺酸營養(yǎng)缺陷，因為另一個基因複本仍可發(fā)揮正常功能。二倍體酵母菌要成為精胺酸營養(yǎng)缺陷體，必須精胺酸合成酵素基因中的兩個複本都發(fā)生突變，但二倍體的同一個基因的兩個複本皆產(chǎn)生突變的例子並不常見。§3. 突變株的特異性（ Charaterization of Mutants）先準備好各類酵母菌的精胺酸營養(yǎng)缺陷體，分別命名為 Arg1、Arg2、 Arg3等，接著我們需要了解這些突變是否發(fā)生在同一基因中，此時會先檢

11、測這些突變是否造成隱性表現(xiàn)型（ recessive phenotype）。1) 隱性測試（ Test of Recessivity）：-酵素功能的喪失通常相對於正常表現(xiàn)型為隱性。-兩個基因複本中只要有一個複本是正常的，就可以產(chǎn)生正常表現(xiàn)型。使兩個單倍體酵母菌彼此交配：如Arg1 和 wt（ wild type，即正常酵母菌）可產(chǎn)生二倍體酵母菌，若此二倍體酵母菌的表型正常，就表示 Arg1 的突變情形相對於正常狀況為隱性。2) 互補測試（ Test of Complementation）：互補測試可用以決定兩個不同的突變是否發(fā)生於同一基因中。首先先將兩個單倍體酵母菌彼此交配以產(chǎn)生二倍體酵母菌，接

12、著觀察此二倍體酵母菌的表型。a) 若兩者的突變發(fā)生於同一基因中 ，比如 Arg1 的突變與 Arg2 的突變皆位於同一基因中，則產(chǎn)生的二倍體酵母菌將無法生長於最基本培養(yǎng)皿中。這是因為兩者產(chǎn)生的二倍體酵母菌的精胺酸合成酵素基因的兩個複本都有缺陷，故無法製造出正常的酵素，此二倍體酵母菌在沒有精胺酸的情況下自然無法生長於培養(yǎng)皿上。 當 Arg1 和 Arg2 所帶有的突變位置皆位於同一基因上時，兩者交配形成的二倍體酵母菌會產(chǎn)生突變的表現(xiàn)型，因為 Arg1 和 Arg2 彼此不能補足對方的不足，此時 Arg1 和 Arg2 會被歸類到同一互補群中。b) 若突變發(fā)生於不同基因中 ，比如 Arg1 的突變

13、位置與 Arg2 的突變位置位於不同基因中，則兩者交配產(chǎn)生的二倍體酵母菌將能夠生長於最基本培養(yǎng)皿上。因為突變發(fā)生的位置不在同一基因中，兩者交配後每個突變對應的正?；蜓}本皆可產(chǎn)生正常的酵素，因此能夠生長於最基本培養(yǎng)皿上。 Arg1 和 Arg2 所帶有的突變位於不同的基因中，兩者交配後可彼此補足對方的不足，而得以形成正常的二倍體酵母菌，此時Arg1 和 Arg2 會被歸類到不同的互補群中。一般說來，不同基因中的突變由於其對應的正?；蜓}本皆可產(chǎn)生正常的酵素，而能夠彼此補足對方的不足，使得二倍體酵母菌可以維持原營養(yǎng)體（ protoph，即正常的營養(yǎng)體），即每個突變體彼此互相修補缺陷。對各個不同的單倍體酵母菌進行互補測試的結果可製表如下所示：WtArg1Arg2Arg3Arg4WtArg1Arg2Arg3Arg4“”表示彼此互補，二倍體酵母菌有正常表型。“”表示彼此不互補，二倍體酵母菌有突