荷葉有效成分的開發(fā)利用

1、1 荷葉為睡蓮科植物蓮（Nelumbonucifera Gaertn）的葉，又名蓮葉，藕葉，在我國南北方均有種植。蓮屬植物有兩種，我國僅有一種。荷葉于夏秋兩季采收，曬至七、八成干時，除去葉柄，切制成片狀，干燥即得。1991年11月中華人民共和國衛(wèi)生部衛(wèi)監(jiān)發(fā)的第45號文件中，將荷葉定為為“既是食品又是藥品”，其在食用及藥用兩方面均有較廣泛的應(yīng)用。荷葉作為藥食兩用植物葉，富含多種活性成分，如：-胡蘿卜素、黃酮、揮發(fā)油、皂類、甾體、蓮堿、荷葉堿、維生素C等。含有多種生物堿：荷葉堿、N-去甲荷葉堿、O-去甲荷葉堿、牛心果堿、亞美帕堿、N-甲基衡州烏藥堿、原荷葉堿、鵝掌楸堿及其它抗有絲分裂作用的堿性成分

2、。2 傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為荷葉性味苦寒，具有清暑利濕，生發(fā)清陽，清心去熱，止血利水，健脾的功效。據(jù)本草綱目記載：“荷葉服之，令人瘦劣”、“生發(fā)元氣，裨助脾胃，澀精濁，散淤血，消腫痛，發(fā)痘瘡”。臨床上荷葉已廣泛用于肥胖癥和高脂肪血癥，并取得了較好的療效，但多散在復(fù)方中，而且制劑僅限于粗加工，較少對荷葉的有效部位進行深入研究。近年來各項研究表明，荷葉及其提取物都具有去脂減肥的作用。荷葉的浸劑和煎劑能直接擴張血管，引起中度降壓，證明荷葉有降壓的作用，可輔治繼發(fā)性肥胖癥。荷葉中含有的黃酮化合物和生物堿這兩大類物質(zhì)在藥理研究中顯示具有明顯的降血脂、抑制膽固醇、抗有絲分裂、抑菌和止痙攣等藥理活性。荷葉作為藥食兩用

3、植物，是人們經(jīng)過幾千年的實踐而得出的經(jīng)驗，在經(jīng)過現(xiàn)代大量的毒理學(xué)試驗后，荷葉被定為是無毒的。31.化學(xué)成分1.1：黃酮類 黃酮類化合物泛指兩個苯環(huán)通過中央三碳相互聯(lián)結(jié)的一系列C6-C3-C6化合物，主要指以2-苯基色原酮為基核的一類化合物，是黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃烷酮醇、異黃酮和查耳酮等含氧雜環(huán)化合物的總稱。 資料表明，荷葉中的黃酮類化合物主要是荷葉苷，其次是槲皮素、異棚皮素等常見的黃酮類物質(zhì)。目前在對荷葉黃酮類化合物的研究中，已經(jīng)從荷葉中分離出nympholide A、nympholide B、myricetin-3-0-(6-p-oumaroyl)glucoside、槲皮素、山奈酚、蘆丁

4、、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-丙酯、異槲皮苷及金絲桃苷等至少十種黃酮類成分。通過藥理試驗追蹤和化學(xué)試驗發(fā)現(xiàn)仍有一些有效成分未分離到，其藥理作用的目標(biāo)不是很清楚。4 黃酮類化合物溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑，游離的黃酮類化合物一般難溶于水，而黃酮甙溶于熱水，能溶于吡啶等有機溶劑。荷葉中的黃酮類化合物屬于甙類，故可用乙醇或熱水提取。荷葉黃酮具有抗氧化、抗衰老、降血脂、降膽固醇及治療心腦血管疾病等功能。研究證明槲皮素、蘆丁均有抑制膽堿酯酶的作用，蘆丁還可防止血管破裂及止血的作用，而金絲桃苷則被證明具有清除活性氧的作用，抑制亞油酸及維生素E的氧化。51.2：生物堿 荷葉中的生物

5、堿堿性較弱，不能直接溶解于水中，但生物堿與酸作用生成鹽類后，則可溶于水中，故荷葉堿可用偏酸性的水溶液提取。至今已從荷葉中分離出眾多生物堿化合物。根據(jù)母核結(jié)構(gòu)不同可將荷葉生物堿分為以下三類：（1）去氫阿樸啡類：去氫荷葉堿（Dehydronuciferine）， 去氫蓮堿（Dehydroroemerine）。（2）阿樸啡類：荷葉堿（Nuciferine），N-去甲基荷葉堿（N-Nomuciferine）， O-去甲基荷葉堿（O-Nomuciferine），番荔枝堿（Anonaine）， 鵝掌揪堿（Lirioderine），N-去甲基亞美罌粟堿（N-Norarmepavine）， 2-羥基-1-甲氧

6、基阿樸啡（2-hydroxy-l-methoxyaporphine）。（3）單芐基異喹啉類：亞美罌粟堿（Armepavine）， N-甲基異衡州烏藥堿（N-Methylisococlaurine）， N-甲基衡州烏藥堿（NMethylcoclaurine）。6荷葉中5種主要的生物堿結(jié)構(gòu)：71.3：揮發(fā)性精油 荷葉中揮發(fā)性精油成分多樣，主要為單萜類、飽和脂肪酸、生物堿及脂肪烴類。成分主要有反式石竹烯、反式異檸檬烯、白菖油萜等。1.4：多糖 生物多糖是由單糖基以糖苷鍵相連而形成的高聚物。是重要的生物高分子化合物和重要信息分子，參與細胞各種生命活動調(diào)節(jié)。有些多糖具有特殊生物活性，是免疫調(diào)節(jié)劑，它可以

7、影響網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、巨噬細胞、淋巴細胞、白細胞以及蛋白質(zhì)的合成等，且無毒副作用。被但是目前尚未見對荷葉的生物多糖的研究報道，對于荷葉多糖的研究發(fā)現(xiàn)荷葉干葉片中含有8-10%的可溶性多糖。81.5：其他化合物 現(xiàn)代已經(jīng)從荷葉中得到?jīng)]食子酸，正二十八烷，正十八烷酸，苯甲酸，鄰羥基苯甲酸，酒石酸，檸檬酸，蘋果酸，草酸等有機酸。 鬼臼類植物的化學(xué)成分具有多種生理活性，主要活性有抗腫瘤、抗病毒、抗細胞有絲分裂、抑制某些酶的活性等。南方山荷葉為小檗科山荷葉屬植物，分布于陜、甘、川、滇等省，用于治療蛇咬傷、癰癤腫毒、跌打、風(fēng)濕筋骨痛及氣管炎等癥。其所含鬼臼毒素抗腫瘤活性強、毒副作用小。為一系列人工合成抗癌新藥

8、的前體。9 荷葉中還含有蛋白質(zhì)、脂肪及礦物質(zhì)元素。有試驗結(jié)果表明，荷葉粗脂肪含量為4.11%，脂肪酸組分有31種，其中但不飽和脂肪酸占總脂肪酸的15.00%，多不飽和脂肪酸為29.88%，飽和脂肪酸為55.15%；荷葉粗蛋白質(zhì)含量為3.37%；部分微量元素含量見表。102.藥理活性2.1：抗氧化 用化學(xué)發(fā)光法測定荷葉提取液對黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子，F(xiàn)enton體系產(chǎn)生的羥自由基及用過硫酸銨-N，N，N，N-四甲基乙二胺體系產(chǎn)生的氧自由基的清除作用，結(jié)果顯示荷葉對超氧陰離子，羥自由基，氧自由基的有效半清除濃度分別為70g/g，370g/g，5g/g分別與0.1 g/g，3.5

9、g/g，0.4 g/g維生素C的清除能力相當(dāng)，說明荷葉是一種有效的自由基清除劑。11 以0.1%荷葉提取液喂養(yǎng)果蠅觀察其對果蠅壽命的影響。結(jié)果顯示，雌性果蠅平均壽命延長17.8%，雄性果蠅平均壽命延長18.3%，對果蠅最高壽命也有明顯延長，說明荷葉具有延緩果蠅衰老和延長壽命的功效。 用荷葉提取物對食用大豆油進行抗氧化活性的研究表明，荷葉的甲醇提取物有很強的抗氧化活性，其抗氧化性與BHA相當(dāng)，略高于生育酚，可抑制約74%的亞麻酸氧化。 另外，有學(xué)者通過體外培養(yǎng)實驗證明荷葉的甲醇提取物具有清除自由基、羥自由基的能力，說明荷葉的甲醇提取物具有保護細胞免受氧化損壞的能力。122.2：降脂減肥作用 研究

10、表明荷葉具有調(diào)節(jié)血脂的功能，主要活性成分為黃酮和生物堿，作用特點主要是促進膽固醇的代謝。 有研究結(jié)果顯示，荷葉水提物對人體高脂血癥有顯著的降脂作用，治療后血清總膽固醇（TC）及甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）平均水平明顯低于治療前，而HDL-C明顯升高。表示荷葉水提物能有效降低TG和TC，而且有較好的升高HDL-C的作用，具有較好的調(diào)脂效果。亦有研究結(jié)果表明：荷葉生物總堿能明顯抑制肥胖大鼠的體重增長，且可使肥胖高脂血癥大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及動脈粥樣硬化指數(shù)下降。13 以急性高脂血癥小鼠為整體模型觀察荷葉水提物對TC、TG的影響，體外給藥觀察藥物對肝細胞合

11、成膽固醇的影響，結(jié)果表明荷葉生物堿及黃酮均有調(diào)脂作用，小劑量荷葉黃酮對體外肝細胞合成膽固醇有抑制趨勢。 荷葉水煎劑能降低全血比粘度，紅細胞壓積，從而改善血液濃粘狀態(tài)，具有明顯降脂作用，這對防治高脂血癥、肥胖及動脈粥樣硬化等并發(fā)癥具有重要意義。 近20年來，以荷葉為主要成分的降脂減肥食療制品的應(yīng)用越來越廣泛，已有各種以荷葉為主要成分的各類減肥茶上市。主要用于減肥及冠心病、高血壓病、糖尿病、腦血管疾病的預(yù)防。且具有降脂護肝，改善肝臟代謝的功效，而無激活脂蛋白酶類西藥損肝的弊病。142.3：抑菌抗病毒作用 荷葉中含較多的堿性成分，如蓮堿、荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、D-N-甲基烏藥堿、番茄枝堿等，這些

12、堿性成分能抑制有絲分裂，具有較強的抑菌效果。另外，荷葉中的黃酮、揮發(fā)油、皂類，甙類物質(zhì)也具有一定的抑菌活性。 用80%乙醇荷葉提取液對常見的幾種食品微生物進行抑菌活性研究。結(jié)果表明，對各種供試菌種均有抑菌活性。其中對細菌及酵母菌，特別是大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最為顯著，但對米根霉抑制作用較弱。實驗結(jié)果同時表明荷葉提取物在中、弱堿性條件下抑菌活性最強，并能耐受超高溫瞬時的熱處理。荷葉提取物有效成分（金絲桃苷）能明顯抑制引起牙齦炎的致病菌，其有效抑菌濃度為5mg/mL。目前荷葉提取物已應(yīng)用于牙膏產(chǎn)品中，并建立了其有效成分（黃酮類化合物）在牙膏中的定性定量檢測方法。15 Kashiwada

13、Y等研究了荷葉中主要生物堿的抗HIV活力，結(jié)果表明：衡州烏藥堿、O-去甲基衡州烏藥堿、荷葉堿這三種荷葉生物堿可以進一步發(fā)展成為抗艾滋病病毒的新前導(dǎo)物。柏田良樹首次確認荷葉中的芐基喹啉生物堿具有抗HIV活性。Boustie J等研究結(jié)果表明荷葉堿在體外具有顯著的抗脊髓灰質(zhì)炎病毒的活力。163.荷葉活性成分的提取及檢測3.1：黃酮的提取及檢測 荷葉中的黃酮類化合物屬于苷類，呈弱酸性，讓其與堿作用生成鹽類后可溶于水溶液中，故荷葉中黃酮類化合物可用偏堿性的水溶液提取。利用黃酮類化合物與混入的雜質(zhì)極性不同，選用不同溶劑萃取，可達到純化的目的。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等，一般采取乙醇為提取溶劑。目

14、前在黃酮類化合物的提取方法中，溶劑提取法、熱水提取法等傳統(tǒng)方法仍占主導(dǎo)地位。大孔吸附樹脂現(xiàn)也應(yīng)用于荷葉黃酮的吸附純化。 黃酮類化合物測定的主要方法有近紅外光譜，HPLC，紫外分光光度法，氣相色譜法，熒光光度法。如利用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系絡(luò)合化學(xué)吸光法測定荷葉黃酮類化合物含量。酸性溶液中黃酮類化合物含量的測定也可采用三氯化鋁顯色法進行，以及采用HPLC法測定。173.2生物堿的提取及檢測 游離狀態(tài)的生物堿根據(jù)溶解性能分為親脂性生物堿和水溶性生物堿兩大類。親脂性生物堿數(shù)目較多，絕大多數(shù)叔胺堿和仲胺堿都屬于這一類。易溶于苯、乙醚、氯仿、鹵代烷烴等極性較低的有機溶劑，在丙酮、乙醇

15、等親水性有機溶劑中也有較好的溶解度，而在水中溶解度較小或幾乎不溶。水溶性生物堿主要有季銨型生物堿，數(shù)目較少，它們易溶于水，在甲醇和正丁醇等極性較大的有機溶劑中也可溶解，但不溶于無極性或極性低的有機溶劑。荷葉中的生物堿堿性較弱，不溶于水，但與酸生成鹽后，可溶于水中，故荷葉堿可用偏酸性的水溶液提取?，F(xiàn)在新的提取技術(shù)有：（1）超臨界萃取法；（2）色譜柱法；（3）高速逆流色譜法；（4）分子印跡法。18生物堿的檢測方法有：（1）紫外分光光度法 用紫外分光光度法測定荷葉中荷葉堿的含量，以荷葉堿為對照，溴甲酚綠為顯色劑，在415nm波長下進行測定。結(jié)果顯示，吸光度與含量線性關(guān)系良好，回收率為98.82%，R

16、SD%為2.94%。樣品在5h內(nèi)測定穩(wěn)定（RSD%為1.38%）。（2）薄層掃描法 采用薄層掃描法測定荷葉中荷葉堿的含量，采用0.5%NaOH溶液制備的硅膠GF254薄層板，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水（30:40:20:10）為展開劑，檢測波長272nm。結(jié)果顯示，荷葉堿在0.55 g范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，平均回收率為97.4%，RSD=3.83%（n=5）。19（3）HPLC法 采用HPLC法測定荷葉中生物堿的含量。色譜條件：Hypersil-C18（5 m，4.6x150mm）色譜柱；流動相：乙腈-水-磷酸-三乙胺（40:60:0.4:0.6，pH6.0）；流速為1mL/min；檢測波長

17、為272nm。荷葉堿在0.0020.071mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限為38ng；樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定，其RSD值為1.3%；樣品的精密度良好；其RSD值為1.4%；樣品的重復(fù)性較好，RSD值為2.4%。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到荷葉中荷葉堿的含量為0.06%，RSD為1.3%；總生物堿提取物中荷葉堿含量為5.12%，RSD為0.56%。203.3多糖的提取和檢測 多糖的提取方法多為水提沉醇法，剛提取出的荷葉粗多糖溶液中存在蛋白質(zhì)、色素、低聚糖等雜質(zhì)。因此，荷葉多糖的色澤深，呈黑褐色，影響了化學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機理及構(gòu)效關(guān)系的研究，需進行分離純化處理。除去粗多糖中蛋白質(zhì)的常用方法有：Sevag法、

18、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法等。色素可用樹脂、DEAE-纖維素或Duolite A-7來吸附，也可進行氧化脫色。低聚糖等小分子雜質(zhì)可用流水透析的方法除去。脫色方法有活性炭法、樹脂法、雙氧水法等。 經(jīng)脫蛋白、脫色、透析后的多糖仍是混合物，須對其進一步純化才能得到性質(zhì)、組成較為均一的多糖。多糖的純化方法很多，有分部沉淀法、鹽析法、金屬絡(luò)合法、季胺鹽沉淀法、柱層析法和制備性區(qū)域電泳法等，粗多糖是混合物，一般用柱層析法進行純化。21 多糖的純度鑒定有超離心法、高壓電泳法、旋光測定法、凝膠過濾法及高壓液相法等。分子量測定是研究多糖性質(zhì)的一項較為重要的工作。多糖的性質(zhì)往往與它的分子量大小有關(guān)。常用于多糖分子量測定的方法有滲透壓法、蒸氣壓滲透計法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法和超濾法等。 多糖結(jié)構(gòu)分析方法有紫外-可見光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜、旋光光譜。單糖組成分析要將多糖的糖苷鍵完全斷裂，方法有鹽酸水解、硫酸水解、甲酸解及三氟醋酸催化水解等，再將單糖進行分離、定性和定量。單糖檢測方法有HPLC、CZE、GC等