第7課：重組DNA_1

1、1重組DNA（recombinant DNA ）23大腸大腸埃希菌埃希菌(Escherichia coli） 俗名大腸桿菌俗名大腸桿菌( (E.coli)E.coli)是人和動(dòng)物腸道中最主要的細(xì)菌之一是人和動(dòng)物腸道中最主要的細(xì)菌之一 是正常菌群的成員是正常菌群的成員- -出生后數(shù)小時(shí)就進(jìn)入腸道，并伴隨終生出生后數(shù)小時(shí)就進(jìn)入腸道，并伴隨終生能合成維生素能合成維生素B B和和K K，供人體利用，供人體利用能抑制腐敗菌及病原菌（如金黃色葡萄球菌、志賀菌能抑制腐敗菌及病原菌（如金黃色葡萄球菌、志賀菌屬）和真菌（如白念珠菌）的過(guò)度增殖屬）和真菌（如白念珠菌）的過(guò)度增殖 異位寄居時(shí)異位寄居時(shí)- -可引起腸

2、外感染可引起腸外感染 某些菌株某些菌株有有致病性致病性消化道感染，導(dǎo)致腹瀉等消化道感染，導(dǎo)致腹瀉等 每個(gè)人每天平均從糞便中排出每個(gè)人每天平均從糞便中排出10101111到到10101313個(gè)個(gè)可作為糞便污染的檢測(cè)指標(biāo)可作為糞便污染的檢測(cè)指標(biāo) 常作為細(xì)菌的模式生物廣泛用于科學(xué)研究常作為細(xì)菌的模式生物廣泛用于科學(xué)研究基因工程的基因工程的工具菌工具菌4生物學(xué)性狀生物學(xué)性狀 形態(tài)與染色形態(tài)與染色 G- 桿菌，桿菌，13m（短桿菌）（短桿菌） 兩端鈍圓、無(wú)芽孢兩端鈍圓、無(wú)芽孢 有周鞭毛有周鞭毛 有普通菌毛有普通菌毛/性菌毛性菌毛 -能運(yùn)動(dòng)能運(yùn)動(dòng)51 1、細(xì)菌培養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)-平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)劃線法培養(yǎng)劃線

3、法培養(yǎng)涂布法培養(yǎng)涂布法培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)6限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I內(nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶（restriction endonuclease）:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。型限制性?xún)?nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性?xún)?nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀分子剪刀7沃納阿爾伯 (Werner Arber) 1929年生于瑞士。蘇黎士工科大學(xué)畢業(yè)后，在日內(nèi)瓦大學(xué)獲得博士學(xué)位。1971年起，任巴塞爾大學(xué)教授。在研究噬菌體的遺傳現(xiàn)象時(shí)，成功地分離出DNA的限制性酶和甲基化修飾酶，為此獲1978年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 8限

4、制限制修飾現(xiàn)象修飾現(xiàn)象K （B） （B）：能夠在大腸桿菌）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長(zhǎng)的菌株上生長(zhǎng)的噬菌體噬菌體第一次感染第一次感染K菌株，菌株，形成的噬菌斑很少，形成的噬菌斑很少，生長(zhǎng)受寄主限制生長(zhǎng)受寄主限制K （K）存活下來(lái)的噬菌體再次感染存活下來(lái)的噬菌體再次感染K菌株，則菌株，則形成的噬菌斑形成的噬菌斑很多，不受限制很多，不受限制9 EOP: Efficiency of plating(生長(zhǎng)在不同寄主中的噬菌體的成斑率成斑率，表示限制程度)。 說(shuō)明說(shuō)明K和和B菌株中存在菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來(lái)一種限制系統(tǒng)可排除外來(lái)的的DNA； 10-4的存活率是由宿主的存活率是由宿主限制系統(tǒng)作用

5、的結(jié)果限制系統(tǒng)作用的結(jié)果10產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因何在產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因何在甲基化酶：甲基化酶：能使細(xì)胞自身核酸的內(nèi)切酶識(shí)別序列的堿基甲基化，從能使細(xì)胞自身核酸的內(nèi)切酶識(shí)別序列的堿基甲基化，從而使自身核酸免受內(nèi)切酶水解而使自身核酸免受內(nèi)切酶水解細(xì)菌的細(xì)菌的“防御防御”系統(tǒng)系統(tǒng)核酸內(nèi)切酶：核酸內(nèi)切酶：識(shí)別并水解外源識(shí)別并水解外源DNA（外來(lái)核酸在內(nèi)切酶識(shí)別序列上沒(méi)外來(lái)核酸在內(nèi)切酶識(shí)別序列上沒(méi)有甲基化修飾作保護(hù)有甲基化修飾作保護(hù)）研究發(fā)現(xiàn)：原來(lái)是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶限制限制修飾修飾11限制修飾體系K （B） （K） （B）：能夠在大腸桿菌）：能夠在大腸桿菌B

6、菌株上生長(zhǎng)的菌株上生長(zhǎng)的噬菌體噬菌體K （K）再次感染再次感染K菌株，則形成菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了菌株已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了修飾）修飾） （B）噬菌體感染大腸桿菌）噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，其菌株后，其DNA大部分被內(nèi)切大部分被內(nèi)切酶降解了，但有極少部分能在酶降解了，但有極少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成因此有少量噬菌斑形成。12 在限制修飾系統(tǒng)中，限制作用限制作用是指一定類(lèi)型的細(xì)菌可以通過(guò)限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對(duì)生物細(xì)胞的入侵受到限制； 而

7、宿主細(xì)胞自身的DNA分子合成后，通過(guò)修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用修飾作用的含義。 限制修飾體系，其功能功能就是保護(hù)自身的DNA，分解外來(lái)的DNA，以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定，這對(duì)細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。13分類(lèi)分類(lèi)核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶(endonuclease) 核酸酶核酸酶從核酸鏈的一端開(kāi)始，一個(gè)接一個(gè)地消從核酸鏈的一端開(kāi)始，一個(gè)接一個(gè)地消化降解核苷酸化降解核苷酸從核酸鏈分子內(nèi)部切割從核酸鏈分子內(nèi)部切割3，5磷酸二酯鍵，磷酸二酯鍵，使之?dāng)嗔研纬尚∑问?/p>

8、之?dāng)嗔研纬尚∑魏怂醿?nèi)切酶核酸內(nèi)切酶(endonuclease) ：按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情況不同，分三類(lèi)況不同，分三類(lèi)(I， II ，III)，通常指的是通常指的是II型型。 14命名法同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶如從流感嗜血桿菌如從流感嗜血桿菌d菌株（菌株（Haemophilus influenzae d）先后發(fā)）先后發(fā)現(xiàn)現(xiàn)3種限制性酶，則分別命名為種限制性酶，則分別命名為HindI， HindII，HindIIIH i n d III大腸桿菌大腸桿菌R菌菌株株REs

9、cherichia嗜血流感桿嗜血流感桿菌菌d株株dinfflluenzaeHaemophiillus株名株名（型號(hào)）（型號(hào)）種名的頭兩個(gè)字母種名的頭兩個(gè)字母宿主屬名的第一個(gè)字母宿主屬名的第一個(gè)字母coli 前前3個(gè)字母代表來(lái)源的生物個(gè)字母代表來(lái)源的生物 隨后隨后1個(gè)字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株個(gè)字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株 最后最后1個(gè)羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序個(gè)羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序 15基本特征基本特征 識(shí)別并切割雙鏈識(shí)別并切割雙鏈DNA（環(huán)狀或線狀）分（環(huán)狀或線狀）分子中子中4-8bp的特定序列的特定序列 結(jié)構(gòu)特征：結(jié)構(gòu)特征：rotational symmetry-“palindrome

10、s”（旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的回文結(jié)構(gòu)）（旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)的回文結(jié)構(gòu)） 切割后產(chǎn)生的末端：切割后產(chǎn)生的末端：Cohesive terminus or Blunt end（粘性末端或平末端）（粘性末端或平末端）EcoR I的識(shí)別序列的識(shí)別序列5G C T G A A T T C G A G 33C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的切割位點(diǎn)的切割位點(diǎn)16質(zhì)粒(Plasmid) 質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并

11、表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴(lài)于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開(kāi)宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性等。 17萊德伯格（萊德伯格（LederbergLederberg，JoshuaJoshua，192519252008 2008 ），），美國(guó)遺傳學(xué)家。美國(guó)遺傳學(xué)家。細(xì)菌遺傳學(xué)的創(chuàng)始人之一。1925年5月23日生于美國(guó)蒙特克萊市。1944年獲哥倫比哥倫比亞大學(xué)亞大學(xué)學(xué)士學(xué)位，以后曾在醫(yī)學(xué)院學(xué)習(xí)，不久轉(zhuǎn)入耶魯大學(xué)，于1947年獲博士學(xué)位。1959年起任斯坦福醫(yī)學(xué)院斯坦福醫(yī)學(xué)院教授兼遺傳學(xué)系主任。1962年任肯尼

12、迪分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任。 他在耶魯大學(xué)期間，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的遺傳重組細(xì)菌的遺傳重組。1946年，他和E.L.E.L.塔特姆塔特姆發(fā)現(xiàn)遺傳重組的普遍性。1952年發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的F F因子因子。1952年發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌中的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)，1953年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的溫和噬菌體在染色體上占有一定位置。1956年發(fā)現(xiàn)噬菌體能進(jìn)行局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。他們的研究工作還包括應(yīng)用細(xì)菌的有性生殖和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行細(xì)菌的免疫學(xué)和代謝作用等方面的研究。1958年他和G.W.比德?tīng)柡虴.L.塔特姆共同獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 18接合（接合（conjugation）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) 接合：接合：指通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞的直接接觸，遺傳物質(zhì)從指通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞的

13、直接接觸，遺傳物質(zhì)從供體供體(donor)轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到受體受體(receptor) 并發(fā)生重組的過(guò)程。并發(fā)生重組的過(guò)程。1946年年萊德伯格萊德伯格(Lederberg, J.) 和塔特姆和塔特姆 (Tatum) 發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的接合。細(xì)菌的接合。19細(xì)菌的雜交實(shí)例細(xì)菌的雜交實(shí)例（Lederberg & Tatum, 1946）不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌（不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌（K12K12）：）： A菌株：菌株：met- bio- thr+ leu+ thi+，B菌株：菌株：met+ bio+ thr- leu- thi- 20這種野生型細(xì)胞如何出現(xiàn)的？這種野生型細(xì)胞如何出現(xiàn)的？U型管實(shí)驗(yàn)

14、：型管實(shí)驗(yàn)：A、B菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上 一邊加壓一邊加壓和吸引使培養(yǎng)液充分混合和吸引使培養(yǎng)液充分混合 結(jié)果任何一臂的培養(yǎng)基上均未長(zhǎng)結(jié)果任何一臂的培養(yǎng)基上均未長(zhǎng)出野生型細(xì)菌。出野生型細(xì)菌。結(jié)論：菌株結(jié)論：菌株A A與菌株與菌株B B細(xì)胞直接接細(xì)胞直接接觸觸( (接合接合) )是野生型細(xì)胞出現(xiàn)的必是野生型細(xì)胞出現(xiàn)的必要條件；兩菌株直接接觸后導(dǎo)致要條件；兩菌株直接接觸后導(dǎo)致遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而發(fā)生基因重遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而發(fā)生基因重組，產(chǎn)生野生型細(xì)菌。組，產(chǎn)生野生型細(xì)菌。21試驗(yàn)證明：試驗(yàn)證明：接合過(guò)程是一種接合過(guò)程是一種單向轉(zhuǎn)移單向轉(zhuǎn)移，A菌株遺傳物質(zhì)菌株遺傳物質(zhì) B菌

15、株，從菌株，從供體供體“donor”到受體到受體“receptor”。用大腸桿菌K12的菌株A和菌株B，首先用高劑量的鏈霉素鏈霉素處理菌株A或菌株B ，把處理過(guò)的菌株A跟未處理過(guò)的菌株B混合，或把處理過(guò)的菌株B跟未處理過(guò)的菌株A混合，發(fā)現(xiàn)結(jié)果大不相同： 22 F 因子：致育因子（因子：致育因子（ fertility factor ）或稱(chēng)性因子）或稱(chēng)性因子（ sex factor ），是一種附加體。），是一種附加體。攜帶攜帶F F因子的菌株稱(chēng)為供體菌或雄性，用因子的菌株稱(chēng)為供體菌或雄性，用F F表示。表示。未攜帶未攜帶F F因子的菌株為受體菌或雌性，用因子的菌株為受體菌或雌性，用F F表示。表示

16、。F F因子及因子及F F向向F F的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移 F F 因子的結(jié)構(gòu)因子的結(jié)構(gòu)染色體外遺傳物質(zhì)（質(zhì)粒），環(huán)狀染色體外遺傳物質(zhì)（質(zhì)粒），環(huán)狀DNADNA，9 9104 bp，大約為，大約為大腸桿菌環(huán)狀染色體的大腸桿菌環(huán)狀染色體的2%，具有，具有40-60個(gè)蛋白質(zhì)基因。個(gè)蛋白質(zhì)基因。每個(gè)細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞( (F) ) 有有2-42-4個(gè)。個(gè)。 23F因子分為三個(gè)區(qū)域：自主復(fù)制區(qū)：有轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)和2個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)Ori T是在染色體轉(zhuǎn)移時(shí)進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制時(shí)的復(fù)制起點(diǎn)；Ori V是在營(yíng)養(yǎng)時(shí)期，即游離在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立復(fù)制獨(dú)立復(fù)制時(shí)的復(fù)制起點(diǎn)。轉(zhuǎn)移區(qū)：主要有合成性傘毛性傘毛即F纖纖毛毛（F pili）的

17、操縱子。F纖毛是由性傘毛蛋白構(gòu)成，呈管狀，又叫接合管。通過(guò)接合管可將供體和受體細(xì)胞相聯(lián)。共30kb長(zhǎng)，有40個(gè)基因與DNA的轉(zhuǎn)移有關(guān)。重組區(qū)：有4個(gè)插入順序（insertion sequence, IS），通過(guò)和宿主染色體上的IS同源重組或通過(guò)轉(zhuǎn)座，F(xiàn)因子可以整合到宿主不同位點(diǎn)上。24 F F 因子的三種狀態(tài)因子的三種狀態(tài) 有一個(gè)自主狀態(tài)的有一個(gè)自主狀態(tài)的F F因子，即因子，即F F細(xì)胞；細(xì)胞； 帶有一個(gè)整合的帶有一個(gè)整合的F F因子的細(xì)胞叫因子的細(xì)胞叫高頻重組細(xì)胞高頻重組細(xì)胞，HfrHfr細(xì)胞。細(xì)胞。 沒(méi)有沒(méi)有F因子，即因子，即F細(xì)胞；細(xì)胞；25 F與與F菌菌（1）有）有F因子的細(xì)菌稱(chēng)為因子

18、的細(xì)菌稱(chēng)為F，細(xì)菌增殖時(shí)可把，細(xì)菌增殖時(shí)可把F 因子傳遞給后代細(xì)胞（通過(guò)自主復(fù)制）。因子傳遞給后代細(xì)胞（通過(guò)自主復(fù)制）。（2）沒(méi)有）沒(méi)有F因子的細(xì)菌稱(chēng)為因子的細(xì)菌稱(chēng)為F，F(xiàn)細(xì)菌經(jīng)吖啶細(xì)菌經(jīng)吖啶 橙處理而丟失，成為橙處理而丟失，成為F。F因子一經(jīng)丟失，因子一經(jīng)丟失， 細(xì)胞中便不再出現(xiàn)；細(xì)胞中便不再出現(xiàn)；（3）F可以和可以和F雜交，而不能和雜交，而不能和F雜交；雜交；（4）F菌與菌與F菌混合（即菌混合（即FF）1小時(shí)后，約小時(shí)后，約95%的的F菌轉(zhuǎn)變?yōu)榫D(zhuǎn)變?yōu)镕菌，而原來(lái)的菌，而原來(lái)的F仍然保留有仍然保留有F因子。因子。26(1) F纖毛合成：由性傘毛蛋白構(gòu)成，接合管接合管使供體和受體細(xì)胞接觸。(

19、2) 轉(zhuǎn)移啟動(dòng)：F因子從轉(zhuǎn)移復(fù)制起點(diǎn)(Ori T)開(kāi)始向F 轉(zhuǎn)移（ 5端首先進(jìn)入受體）。(3) 單鏈轉(zhuǎn)移，滾環(huán)復(fù)制。F F纖毛與接合管纖毛與接合管FF27Hfr Hfr 是是F F因子整合到因子整合到E.coliE.coli 染色體上的結(jié)果染色體上的結(jié)果E.coli染色體上有染色體上有20個(gè)以上的整合位點(diǎn)；個(gè)以上的整合位點(diǎn)；整合通過(guò)整合通過(guò)IS等同源重組或轉(zhuǎn)座實(shí)現(xiàn)；等同源重組或轉(zhuǎn)座實(shí)現(xiàn)；F因子有多個(gè)整合位點(diǎn)，主要在因子有多個(gè)整合位點(diǎn)，主要在IS3處。處。28分子克隆分子克隆29pUC18pUC19含四個(gè)部分：含四個(gè)部分：（1 1）來(lái)自）來(lái)自pBR322pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（

20、oriori）；）；（2 2）ampampr r ; ; （3 3）大腸桿菌）大腸桿菌半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（lacZlacZ）的啟動(dòng)子及其編碼）的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的肽鏈的DNADNA序列；序列；（4 4）多克隆位點(diǎn)（）多克隆位點(diǎn)（MCSMCS）lacZOriAmprMCS30藍(lán)白斑篩選重組子的原理：藍(lán)白斑篩選重組子的原理： lacZ 編碼編碼半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽，在異丙基硫代肽，在異丙基硫代- -D-半乳半乳糖苷（糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，使呈色底物）的誘導(dǎo)下，使呈色底物5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚- -D-半乳糖苷（半乳糖苷（X-gal) 被分解產(chǎn)生藍(lán)色。因此攜帶空載被分解產(chǎn)生藍(lán)色。因此攜帶空載體的大腸桿菌呈藍(lán)色菌落。體的大腸桿菌呈藍(lán)色菌落。外