蛋白質(zhì)分離純化

1、第二章蛋白質(zhì)與其它生物分子第二章蛋白質(zhì)與其它生物分子的相互作用的相互作用 糖蛋白的存在膜蛋白類膜蛋白類 血型抗原血型抗原ABO 免疫球蛋白免疫球蛋白 膜受體膜受體分泌蛋白類分泌蛋白類消化道上皮分泌黏液消化道上皮分泌黏液中有中有頜下腺粘蛋白頜下腺粘蛋白胃粘蛋白胃粘蛋白胞外體液中有胞外體液中有:血清清蛋白血清清蛋白血清粘蛋白血清粘蛋白運(yùn)鐵蛋白運(yùn)鐵蛋白血漿銅藍(lán)蛋白血漿銅藍(lán)蛋白凝血酶原凝血酶原免疫球蛋白免疫球蛋白補(bǔ)體補(bǔ)體 結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白膠原蛋白膠原蛋白層粘蛋白層粘蛋白纖連蛋白纖連蛋白糖蛋白的生物學(xué)功能1、參與新生肽的鏈的折疊和締合參與新生肽的鏈的折疊和締合2、參與糖蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)、參與糖蛋白的分泌

2、和轉(zhuǎn)運(yùn)3、參與分子識(shí)別和細(xì)胞識(shí)別（如：受體與配、參與分子識(shí)別和細(xì)胞識(shí)別（如：受體與配體、精子與卵子的識(shí)別、根瘤菌與豆科植體、精子與卵子的識(shí)別、根瘤菌與豆科植物、病原微生物對(duì)寄生植物的感染物、病原微生物對(duì)寄生植物的感染細(xì)胞粘著等）研究糖蛋白的應(yīng)用 利用外源凝集素作為探針鑒別腫瘤細(xì)胞利用外源凝集素作為探針鑒別腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞需要較低濃度的外源凝集素，比正腫瘤細(xì)胞需要較低濃度的外源凝集素，比正常低常低10-20倍倍。（一）組成糖蛋白糖鏈的單糖（一）組成糖蛋白糖鏈的單糖一、糖蛋白的結(jié)構(gòu)一、糖蛋白的結(jié)構(gòu) 常見(jiàn)的單糖及其衍生物常見(jiàn)的單糖及其衍生物 名名 稱稱 英英 文文 名名 縮縮 寫(xiě)寫(xiě) -D- -葡萄糖

3、葡萄糖 -D-glucose ( Glc ) -D- -半乳糖半乳糖 -D-galactose ( Gal ) -D- -甘露糖甘露糖 -D-mannose ( Man ) L- -巖藻糖巖藻糖 L-Fucose ( Fuc )N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺 N-acetylglucosamine ( GlcNAc )N-乙酰半乳糖胺乙酰半乳糖胺 N-acetylgalactosamine ( GalNAc )N-乙酰神經(jīng)氨酸乙酰神經(jīng)氨酸 N-acetylneuraminic acid ( NeuAc )OONHC=OCH3CH2OH NH CH2-CH C=OO O NHN-C-CH2-CH

4、C=O CH2OH Asn -GlcNAcSer(Thr)O-O-連接寡糖連接寡糖N-N-連接寡糖連接寡糖 -GalNAc（二）糖鏈與蛋白質(zhì)連接方式及其分類（二）糖鏈與蛋白質(zhì)連接方式及其分類NHC=OCH3OHN乙酰半乳糖N乙酰葡萄糖N-連接糖蛋白連接糖蛋白（1）糖基化位點(diǎn)）糖基化位點(diǎn) 特異的氨基酸序列（也稱序列子）：特異的氨基酸序列（也稱序列子）：Asn X - Ser/Thr X 可以是可以是 Pro 以外的任何氨基酸。序以外的任何氨基酸。序列中列中X位氨基酸的性質(zhì)可能與合成的糖鏈結(jié)位氨基酸的性質(zhì)可能與合成的糖鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)構(gòu)有關(guān)（2 2）N-N-連接寡糖的基本結(jié)構(gòu)連接寡糖的基本結(jié)構(gòu) Man

5、Man GlcNAc GlcNAc AsnMan 1,6 1,4 1,3 1,4分型：分型：五糖核心區(qū)：五糖核心區(qū)：1 1、高甘露糖型：、高甘露糖型：只含有只含有Man和和GlcNAc,而且只有而且只有Man 連接在五糖核心區(qū)上的連接在五糖核心區(qū)上的N-糖鏈。糖鏈。2.、復(fù)雜型：、復(fù)雜型：除含有除含有Man和和GlcNAc外，還有外，還有Gal、Fuc 和和NeuAc的的N-糖鏈。糖鏈?；窘Y(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)是由五糖核是由五糖核 心區(qū)上加一些可變數(shù)目的心區(qū)上加一些可變數(shù)目的 N-乙酰氨基乳糖，乙酰氨基乳糖， 即即( Gal 14GlcNAc )n所構(gòu)成的外圍鏈，而所構(gòu)成的外圍鏈，而 Gal可以連接著

6、可以連接著NeuAc。 核心核心Fuc 指以指以 16 糖苷鍵方式連接在五糖核心糖苷鍵方式連接在五糖核心 區(qū)緊靠肽鏈區(qū)緊靠肽鏈 Asn 殘基的殘基的 GlcNAc上的上的Fuc。平分型平分型 GlcNAc 指在五糖核心區(qū)的指在五糖核心區(qū)的 -Man上以上以 14糖苷鍵連接的糖苷鍵連接的 GlcNAc。3 3、雜合型（也稱混合型）：、雜合型（也稱混合型）：指既有高甘露糖型結(jié)構(gòu)特指既有高甘露糖型結(jié)構(gòu)特 點(diǎn)，又有復(fù)雜型結(jié)構(gòu)特征，即點(diǎn)，又有復(fù)雜型結(jié)構(gòu)特征，即N-乙酰氨基乙酰氨基 乳糖重復(fù)單位連接在五糖核心區(qū)上的乳糖重復(fù)單位連接在五糖核心區(qū)上的N-糖糖 鏈。也可含有平分型鏈。也可含有平分型GlcNAc。

7、（3 3）N-N-連接寡糖的生物合成連接寡糖的生物合成 a a、合成場(chǎng)所：、合成場(chǎng)所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，與肽鏈合成，與肽鏈合成同時(shí)進(jìn)行。同時(shí)進(jìn)行。 b b、糖鏈載體：長(zhǎng)萜醇（、糖鏈載體：長(zhǎng)萜醇（dolichol, Doldolichol, Dol） CH3 CH3 O OHCH2-C=CH-CH2CH2-CH-CH2-O-P-O-P-O-糖基糖基 O ON（15-19）異戊烯單位異戊烯單位長(zhǎng)萜醇長(zhǎng)萜醇 c c、糖基供體：、糖基供體： 如：如：UDP-Gal（GlcNAc、GalNAc） GDP-Man（Fuc） Dol-Man（Glc）長(zhǎng)萜醇類長(zhǎng)萜醇類 d、酶：、酶：各種特異性

8、的糖基轉(zhuǎn)移酶各種特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶 核苷酸類核苷酸類e、合成的主要過(guò)程：、合成的主要過(guò)程： （a）長(zhǎng)萜醇焦磷酸寡糖（）長(zhǎng)萜醇焦磷酸寡糖（G-糖）的合成。糖）的合成。（b b）G-G-寡糖轉(zhuǎn)移到肽鏈糖基化位點(diǎn)上并進(jìn)一步寡糖轉(zhuǎn)移到肽鏈糖基化位點(diǎn)上并進(jìn)一步 加工修飾，形成各型糖鏈。加工修飾，形成各型糖鏈。Man-Man ManMan-Man Man-Man ManGlc-Glc-Glc-pp-DolMan-GlcNAc-GlcNAc- 長(zhǎng)萜醇焦磷酸寡糖（長(zhǎng)萜醇焦磷酸寡糖（G-G-糖）的合成糖）的合成膜蛋白中的糖膜蛋白中的糖膜膜蛋蛋白白分分子子中中的的糖糖糖鏈的分支結(jié)構(gòu)糖鏈的分支結(jié)構(gòu)糖蛋白中糖鏈的生物

9、學(xué)功能1、參與新生肽的折疊與締合、參與新生肽的折疊與締合例：基因定點(diǎn)突變所得去糖基化抗胰蛋白酶不例：基因定點(diǎn)突變所得去糖基化抗胰蛋白酶不能正確折疊。能正確折疊。2、影響糖蛋白的分泌和穩(wěn)定性、影響糖蛋白的分泌和穩(wěn)定性例：去例：去N-糖鏈的免疫球蛋白不能被分泌到胞外糖鏈的免疫球蛋白不能被分泌到胞外3、參與分子識(shí)別和細(xì)胞識(shí)別、參與分子識(shí)別和細(xì)胞識(shí)別例：精卵識(shí)別、細(xì)胞粘著、淋巴歸巢、血漿老例：精卵識(shí)別、細(xì)胞粘著、淋巴歸巢、血漿老糖蛋白的清除、抗原抗體的結(jié)合、酶底物的糖蛋白的清除、抗原抗體的結(jié)合、酶底物的結(jié)合、激素與受體的結(jié)合等結(jié)合、激素與受體的結(jié)合等4、維持激素活性維持激素活性例：促卵泡激素、促黃體激

10、素等，其中所含例：促卵泡激素、促黃體激素等，其中所含糖鏈與其生物活性及半衰期有關(guān)。糖鏈與其生物活性及半衰期有關(guān)。5、維持、維持IgG的活性的活性如如IgG缺失糖鏈，則自身成為成為抗原產(chǎn)生抗缺失糖鏈，則自身成為成為抗原產(chǎn)生抗體，生成免疫復(fù)合體，沉積于關(guān)節(jié)炎引起體，生成免疫復(fù)合體，沉積于關(guān)節(jié)炎引起炎癥。炎癥。6、 決定血型決定血型 二、糖蛋白寡糖鏈的功能二、糖蛋白寡糖鏈的功能( (一）寡糖鏈對(duì)糖蛋白新生肽鏈的影響一）寡糖鏈對(duì)糖蛋白新生肽鏈的影響1 1、參與肽鏈的折疊和亞基聚合，保障正確構(gòu)象的形、參與肽鏈的折疊和亞基聚合，保障正確構(gòu)象的形 成。成。如：如：運(yùn)鐵蛋白受體（運(yùn)鐵蛋白受體（Asn 251、

11、317 和和 727） Asn-727為高露糖型為高露糖型N-連接糖鏈，與折疊和運(yùn)連接糖鏈，與折疊和運(yùn) 輸關(guān)系密切。輸關(guān)系密切。 Asn-251為三天線復(fù)雜型為三天線復(fù)雜型N-連接糖鏈，與二聚連接糖鏈，與二聚體形成相關(guān)。體形成相關(guān)。2 2、引導(dǎo)糖蛋白在體內(nèi)的分揀和、引導(dǎo)糖蛋白在體內(nèi)的分揀和運(yùn)運(yùn)送送( (二）寡糖鏈對(duì)糖蛋白生物活性的影響二）寡糖鏈對(duì)糖蛋白生物活性的影響 1 1、保護(hù)肽鏈不易被酶水解，延長(zhǎng)其半衰期。、保護(hù)肽鏈不易被酶水解，延長(zhǎng)其半衰期。 2 2、影響酶（蛋白質(zhì)）的生物活性、影響酶（蛋白質(zhì)）的生物活性。 如：如： a a、HMGCoAHMGCoA還原酶去糖鏈后，活性下降還原酶去糖鏈后

12、，活性下降90%90%。 b b、脂蛋白脂酶的、脂蛋白脂酶的N-N-糖鏈的五糖核心是活性糖鏈的五糖核心是活性 必需的。必需的。 （三）寡糖鏈與分子識(shí)別作用（三）寡糖鏈與分子識(shí)別作用 1、精、精-卵細(xì)胞的結(jié)合：卵細(xì)胞的結(jié)合： 精子頭部的精子蛋白識(shí)別卵細(xì)胞表面透明帶中精子頭部的精子蛋白識(shí)別卵細(xì)胞表面透明帶中 ZP-3 糖蛋白的糖蛋白的 O-連接糖鏈，產(chǎn)生頂體反應(yīng)。連接糖鏈，產(chǎn)生頂體反應(yīng)。 2、激素受體、激素受體-配體的結(jié)合：配體的結(jié)合： 3、細(xì)胞粘附作用：參與細(xì)胞粘附的分子大多是、細(xì)胞粘附作用：參與細(xì)胞粘附的分子大多是N-糖糖 鏈的糖蛋白。鏈的糖蛋白。 如整合蛋白（如整合蛋白（integrin）可

13、與纖連蛋白（）可與纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)n）結(jié)合，但必須依賴其完整的）結(jié)合，但必須依賴其完整的N-糖鏈；去除糖鏈；去除或改變或改變糖鏈。糖鏈。均可降低其與均可降低其與Fn 的識(shí)別和結(jié)合能力。的識(shí)別和結(jié)合能力。 4、血型與血型物質(zhì)；、血型與血型物質(zhì)；ABO血型的抗原系統(tǒng)血型的抗原系統(tǒng) 抗原抗原 糖鏈非還原末端結(jié)構(gòu)糖鏈非還原末端結(jié)構(gòu) A GalNAc 1,3( Fuc 1,2 )Gal 1,3 GlcNAc- B Gal 1,3( Fuc 1,2 )Gal 1,3 GlcNAc- H Fuc 1,2 Gal 1,3 GlcNAc- 血管內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子，后改稱血管內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞

14、黏附分子，后改稱E E選擇蛋白（選擇蛋白（E Eselectinselectin），能識(shí)別白細(xì)胞），能識(shí)別白細(xì)胞表面的表面的SLexSLex( (一種血型抗原）四聚糖。一種血型抗原）四聚糖。 當(dāng)組織受損或感染時(shí)，白細(xì)胞黏附于內(nèi)皮當(dāng)組織受損或感染時(shí)，白細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，沿血管壁滾動(dòng)并穿過(guò)管壁進(jìn)入受損細(xì)胞，沿血管壁滾動(dòng)并穿過(guò)管壁進(jìn)入受損組織，殺滅入侵病原物，但過(guò)多的白細(xì)胞組織，殺滅入侵病原物，但過(guò)多的白細(xì)胞聚集，則會(huì)引起炎癥及類風(fēng)濕等自身免疫聚集，則會(huì)引起炎癥及類風(fēng)濕等自身免疫疾病。疾病。 美籍華裔科學(xué)家王啟輝首先用酶法合成美籍華裔科學(xué)家王啟輝首先用酶法合成了了SLexSLex，當(dāng)時(shí)該四糖的推算

15、價(jià)格為，當(dāng)時(shí)該四糖的推算價(jià)格為2020億億美元美元/ /千克，經(jīng)他合成后，價(jià)格降低了千克，經(jīng)他合成后，價(jià)格降低了3 34 4個(gè)數(shù)量級(jí)，并已由個(gè)數(shù)量級(jí)，并已由CytelCytel公司生產(chǎn)。公司生產(chǎn)。 GlycomedGlycomed公司則從中藥甘草中，找到了公司則從中藥甘草中，找到了SLexSLex的類似物甘草素，可用于封閉血管的類似物甘草素，可用于封閉血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的內(nèi)皮細(xì)胞表面的E E選擇蛋白，從而達(dá)到抗選擇蛋白，從而達(dá)到抗炎的目的。炎的目的。蛋白聚糖蛋白聚糖(proteoglycans(proteoglycans) ) 由糖胺聚糖于蛋白質(zhì)共價(jià)連接形成由糖胺聚糖于蛋白質(zhì)共價(jià)連接形成 糖胺聚

16、糖是由己糖醛酸、己糖胺二糖單位糖胺聚糖是由己糖醛酸、己糖胺二糖單位重復(fù)構(gòu)成重復(fù)構(gòu)成 蛋白聚糖的功能：維持皮膚、關(guān)節(jié)、軟骨蛋白聚糖的功能：維持皮膚、關(guān)節(jié)、軟骨等結(jié)締組織形態(tài)和功能。等結(jié)締組織形態(tài)和功能。 糖胺聚糖，又稱為糖胺多糖、粘多糖糖胺聚糖，又稱為糖胺多糖、粘多糖 、氨、氨基多糖、酸性糖胺聚糖等。糖胺聚糖通過(guò)共基多糖、酸性糖胺聚糖等。糖胺聚糖通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)相連接構(gòu)成蛋白聚糖價(jià)鍵與蛋白質(zhì)相連接構(gòu)成蛋白聚糖 其代表性物質(zhì)有透明質(zhì)酸、軟骨素其代表性物質(zhì)有透明質(zhì)酸、軟骨素4-4-或或6-6-硫硫酸酸 、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素 、肝素及硫、肝素及硫酸乙酰肝素等。酸乙酰肝素等

17、。粘粘多多糖糖的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)硫酸軟骨素硫酸角質(zhì)素透明質(zhì)酸細(xì)胞壁多糖細(xì)胞壁多糖細(xì)胞壁多糖細(xì)胞壁多糖五甘氨酸橋胞壁酸N乙酰葡糖胺細(xì)胞細(xì)胞壁多壁多糖與糖與蛋白蛋白的連的連接接透明質(zhì)素硫酸角質(zhì)素硫酸軟骨素透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸(hyaluronic(hyaluronic acid) acid) 透明質(zhì)酸是糖胺聚糖中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一種，它透明質(zhì)酸是糖胺聚糖中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一種，它的結(jié)構(gòu)中含有重復(fù)的二糖結(jié)構(gòu)單位如下：的結(jié)構(gòu)中含有重復(fù)的二糖結(jié)構(gòu)單位如下：軟骨素軟骨素4-4-或或6-6-硫酸硫酸(chondroitin(chondroitin 4-or 4-or 6-sulfate)6-sulfate) 硫酸皮膚素硫酸皮

18、膚素(dermatan(dermatan sulfate)sulfate) 硫酸皮膚素最初是從豬皮中分離出來(lái)，后發(fā)現(xiàn)它存硫酸皮膚素最初是從豬皮中分離出來(lái)，后發(fā)現(xiàn)它存在于許多動(dòng)物組織，如豬胃粘膜、臍帶、肌腱、脾、在于許多動(dòng)物組織，如豬胃粘膜、臍帶、肌腱、脾、腦、心瓣膜、鞏膜、腸粘膜、關(guān)節(jié)囊、纖維性軟骨腦、心瓣膜、鞏膜、腸粘膜、關(guān)節(jié)囊、纖維性軟骨等中。等中。 它的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)都與硫酸軟骨素的相似，其二精單它的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)都與硫酸軟骨素的相似，其二精單位結(jié)構(gòu)如下：位結(jié)構(gòu)如下： 硫酸角質(zhì)素硫酸角質(zhì)素(keratan (keratan suIfatesuIfate) ) 首先從角膜的蛋白水解液中分離出來(lái)，后證首先從角膜的蛋白水解液中分離出來(lái)，后證明它也存在于人的主動(dòng)脈和人、牛的髓核中。明它也存在于人的主動(dòng)脈和人、牛的髓核中。嬰兒幾乎不合硫酸角質(zhì)索，隨著年齡的增大嬰兒幾乎不合硫酸角質(zhì)索，隨著年齡的增大逐漸增加，直到逐漸增加，直到20203030歲時(shí)，它的含量約占?xì)q時(shí)，它的含量約占肋軟骨中粘多糖總量的肋軟骨中粘多糖總量的50%50%。 硫酸角質(zhì)素的重復(fù)二糖單位結(jié)構(gòu)如下硫酸角質(zhì)素的重復(fù)二糖單位結(jié)構(gòu)如下： 肝素肝素(heparin)(heparin) 肝中肝素含量最為豐富，因此得名。實(shí)際上，它廣肝中肝素含量最為豐富，因此得名。實(shí)際上，它廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織和體液中