半抗原免疫分析全面ppt課件

1、半抗原免疫分析半抗原免疫分析ABCABC內(nèi)容內(nèi)容l一、根本概念一、根本概念l抗原抗原l抗體抗體l二、免疫分析方法二、免疫分析方法l分類分類lELISAELISA原理與方法原理與方法l方法建立方法建立- -蘇丹紅為例蘇丹紅為例 抗原抗原 antigen,Ag antigen,Ag( (一一) )抗原的概念抗原的概念 抗原抗原(Antigen,Ag) (Antigen,Ag) 是一類能刺激機(jī)體免是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)對(duì)疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)對(duì), ,并能與相應(yīng)并能與相應(yīng)的免疫應(yīng)對(duì)產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性的免疫應(yīng)對(duì)產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì). .( (二二) )

2、完全抗原與半抗原完全抗原與半抗原1.1.完全抗原完全抗原complex antigen):complex antigen): 既具免疫原性又有免疫反響性的既具免疫原性又有免疫反響性的物質(zhì)物質(zhì). . 如如: :大多數(shù)蛋白質(zhì)大多數(shù)蛋白質(zhì). .2.2.半抗原半抗原(hapten):(hapten): 僅有免疫反響性而無免疫原性的僅有免疫反響性而無免疫原性的物質(zhì)物質(zhì). .如如: :大多數(shù)多糖、類脂、某些大多數(shù)多糖、類脂、某些藥物藥物. . 半抗原半抗原+ +載體載體( (蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)) ) 完全抗完全抗原原農(nóng)藥、獸藥、生物毒素、重金屬、維生素、防農(nóng)藥、獸藥、生物毒素、重金屬、維生素、防腐劑、植物激素等

3、半抗原腐劑、植物激素等半抗原 在食品平安、植物學(xué)、環(huán)境檢測等領(lǐng)在食品平安、植物學(xué)、環(huán)境檢測等領(lǐng)域，主要是半抗原類物質(zhì)。域，主要是半抗原類物質(zhì)。 抗體抗體 antibody,Ab antibody,Ab抗原與抗體是天生的一對(duì)，誰也離不了誰；抗原與抗體是天生的一對(duì)，誰也離不了誰； 兩者既是好朋友，又是一對(duì)冤家。兩者既是好朋友，又是一對(duì)冤家。 一、根本概念一、根本概念 1. 1. 抗體抗體AntibodyAntibody，AbAb 指指B B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后活化、增殖淋巴細(xì)胞受抗原刺激后活化、增殖、分化成為漿細(xì)胞，產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原、分化成為漿細(xì)胞，產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。

4、發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。 存在方式：存在方式： 膜型膜型membrane immunoglobulin, mIgmembrane immunoglobulin, mIg B B細(xì)胞膜上的抗原受體；細(xì)胞膜上的抗原受體； 分泌型分泌型(secreted immunoglobulin, (secreted immunoglobulin, sIg) sIg) 分泌進(jìn)入體液分泌進(jìn)入體液, , 介導(dǎo)體液免疫應(yīng)介導(dǎo)體液免疫應(yīng)對(duì)。對(duì)。一免疫球蛋白的根本構(gòu)造：一免疫球蛋白的根本構(gòu)造： 由四條多肽鏈組成，呈由四條多肽鏈組成，呈“Y Y或或“T T型型 1. 1.組成：組成： 2 2條長鏈，又稱重鏈條長鏈，又稱

5、重鏈Heavy chainHeavy chain，H H鏈：鏈： 含含450-550aa450-550aa，分子量為，分子量為55-75KD55-75KD。 2 2條短鏈，又稱輕鏈條短鏈，又稱輕鏈Light chainLight chain，L L鏈：鏈： 含含214aa214aa，分子量為，分子量為25KD25KD。l2.2.分類、分型：分類、分型：l1 1根據(jù)重鏈氨基酸組成、序列及構(gòu)造的根據(jù)重鏈氨基酸組成、序列及構(gòu)造的差別，將差別，將Ig Ig 分為五類：分為五類：l IgM ( IgM () ) 、IgG()IgG()、IgA()IgA()、IgD()IgD()、 IgE() IgE()

6、 l 亞類：亞類：IgGIgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 l IgA IgA：IgA1, IgA1, IgA2IgA2l IgM: IgM1, IgM: IgM1, IgM2IgM2l2 2分兩型：分兩型：l 根據(jù)輕鏈氨基酸組成、序列及構(gòu)造的差根據(jù)輕鏈氨基酸組成、序列及構(gòu)造的差別，可將輕別，可將輕l 鏈分為兩型：鏈分為兩型：和和型型 l 每一每一IgIg單體分子兩條重鏈必需同類，兩單體分子兩條重鏈必需同類，兩條輕鏈必需條輕鏈必需l 同型。同型?？贵w的制備方法抗體的制備方法l3.3.基因工程抗體基因工程抗體(GeAb):(GeAb

7、):l 第三代抗體第三代抗體l 由基因重組技術(shù)制備的抗體由基因重組技術(shù)制備的抗體, ,稱為基因工程抗體。稱為基因工程抗體。l 嵌合抗體嵌合抗體 (chimeric Ab) (chimeric Ab) l 人源抗體人源抗體humanized Ab)humanized Ab)l 雙特異性抗體雙特異性抗體bispecific bispecific Ab) Ab) l Fab/ScFV Fab/ScFVsingle chain single chain l FV FV fragment)fragment)l 單域抗體單域抗體single chain single chain Ab) Ab) 抗體的構(gòu)造

8、與功能的關(guān)系，抗體的構(gòu)造與功能的關(guān)系，所展現(xiàn)出的生物學(xué)功能是其構(gòu)造的所展現(xiàn)出的生物學(xué)功能是其構(gòu)造的完美扮演者。完美扮演者。免疫分析技術(shù)免疫分析技術(shù)內(nèi)內(nèi) 容容分析方法分類分析方法分類幾種常用免疫分析技術(shù)幾種常用免疫分析技術(shù)ELISAELISA側(cè)流免疫層析側(cè)流免疫層析分析方法的建立分析方法的建立分析數(shù)據(jù)的擬合分析數(shù)據(jù)的擬合常用的免疫標(biāo)志物質(zhì)常用的免疫標(biāo)志物質(zhì)類別類別 標(biāo)志物標(biāo)志物 用途用途熒光素?zé)晒馑?FITC、RB200、TRITC 免疫組化免疫組化 鑭系元素螯合物鑭系元素螯合物 免疫分析測定免疫分析測定放射性核素放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定免疫分析測定 125I、1

9、31I酶酶 HRP、AP 免疫組化免疫組化 免疫分析測定免疫分析測定化學(xué)發(fā)光物化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定免疫分析測定金屬顆粒金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白膠體金、鐵蛋白 免疫組化免疫組化 免疫分析測定免疫分析測定 1 1按標(biāo)志物的種類分按標(biāo)志物的種類分(1)(1)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay(radioimmunoassay，RIA)RIA)(2)(2)酶免疫分析酶免疫分析(enzyme immunoassay(enzyme immunoassay，EIA)EIA)(3)(3)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemilumine

10、scent enzyme immunoassay(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA)CIZIA)(4)(4)熒光免疫分析法熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)FIA)。 2按能否參與分別劑分按能否參與分別劑分(1)均相免疫分析均相免疫分析(homogeneous lmmunoassay) 在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反響到達(dá)平衡后，反響液中在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反響到達(dá)平衡后，反響液中結(jié)合的標(biāo)志藥物與游離的標(biāo)志藥物之中有一種不產(chǎn)生信號(hào)或信結(jié)合的標(biāo)志

11、藥物與游離的標(biāo)志藥物之中有一種不產(chǎn)生信號(hào)或信號(hào)消逝，因此無需將反響液分作兩相，即可在均相溶液中進(jìn)展號(hào)消逝，因此無需將反響液分作兩相，即可在均相溶液中進(jìn)展測定，故稱為均相免疫分析。如酶放大免疫測定技術(shù)測定，故稱為均相免疫分析。如酶放大免疫測定技術(shù)(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT) 。(2)非均相免疫分析非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay) 在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反響到達(dá)平衡后，只需在反在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反響到達(dá)平衡后，只需在反響液中參與分別劑，將游離標(biāo)志藥物和結(jié)合標(biāo)志藥物分開之后，響液中

12、參與分別劑，將游離標(biāo)志藥物和結(jié)合標(biāo)志藥物分開之后，才干測出各自部分的標(biāo)志藥物濃度。否那么，測定的是兩者的才干測出各自部分的標(biāo)志藥物濃度。否那么，測定的是兩者的總濃度。由于這種信號(hào)的測定需將反響液分成液總濃度。由于這種信號(hào)的測定需將反響液分成液-固兩相后，才固兩相后，才干分別測定，故稱為非均相免疫分析。如干分別測定，故稱為非均相免疫分析。如ELISA(Enzyme linked immunosorbent immunoassay)ELISAELISA簡介簡介一一 ELISA技術(shù)的原理技術(shù)的原理間接法間接法 夾心法夾心法 競爭法競爭法夾心法夾心法Sandwich競爭法競爭法二二 ELISA所用試劑

13、資料所用試劑資料l1、固相l(xiāng)2、酶l3、底物l4、緩沖液l5、儀器1、固定相、固定相聚次亞乙烯1 1辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP):(HRP):約有約有5050的的EIAEIA運(yùn)用此酶。運(yùn)用此酶。2 2堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶(AP):AP(AP):AP標(biāo)志的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，其標(biāo)志的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，其活性可用分光光度計(jì)或熒光計(jì)丈量?；钚钥捎梅止夤舛扔?jì)或熒光計(jì)丈量。3 36-6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD): (G-6-PD): 通常用于均相通常用于均相EIAEIA。4 4-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-Gal): (-Gal): 適用于均相適用于均相EIAEIA和非均相和

14、非均相EIAEIA。5 5蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶(MDH): (MDH): 多用于尿樣的均相多用于尿樣的均相EIAEIA。3、最常用的底物、最常用的底物l鄰苯二酚(OPC)l四甲基聯(lián)苯胺(TMB)4、緩沖液、緩沖液lPBS(T)lTris-HCllNa3N是HRP辣根過氧化物酶的抑制劑酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀4、儀器、儀器酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀三三 免疫分析方法建立免疫分析方法建立蘇丹紅為例蘇丹紅為例Step 1: Hapten and conjugateStep 2: characterization of conjugateStep 3: chessboard tiatrion and calibration curveStep 4: optimizationnonessential 例例1、標(biāo)志抗原濃度對(duì)檢測的影響、標(biāo)志抗原濃度對(duì)檢測的影響例，例，pH影響影響Step 5: sample analysisStep 6: validation一個(gè)難點(diǎn)：基質(zhì)效應(yīng)一個(gè)難點(diǎn)：基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)l基質(zhì)：樣品中除了目的分析物外還含有其他的基質(zhì)：樣品中除了目的分析物外還含有其他的物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠會(huì)對(duì)檢測結(jié)果呵斥干擾，物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠會(huì)對(duì)檢測結(jié)果呵