融合蛋白分離及多克隆抗體的制備

1、Te iR融合蛋白分離及多克隆抗體的制備摘要: 提取睪丸酮叢毛單胞菌(Com am onas testosteroni)基因組DNA, PCR擴(kuò)增teiR基因,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pET28a中,經(jīng)酶切驗(yàn)證后獲得teiR基因表達(dá)載體pET28a2teiR. 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌( Escherichia coli)BL21,添加終濃度為1 mmol·L - 1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),提取細(xì)菌總蛋白進(jìn)行蛋白的SDS2PAGE電泳. 并根據(jù)融合蛋白特性,利用Ni2NTA Sp in Column對(duì)TeiR融合蛋白進(jìn)行分離純化,經(jīng)分離純化后的重組蛋白在SDS2PAGE上呈現(xiàn)出單一條帶. 進(jìn)一步以

2、獲得的TeiR融合蛋白為抗原,制備兔抗TeiR多克隆抗體,經(jīng)EL ISA測(cè)定該抗體的效價(jià)為110000,該抗體與睪丸酮叢毛單胞菌天然TeiR蛋白反應(yīng)良好,說明該抗體特異性良好.關(guān)鍵詞: 睪丸酮叢毛單胞菌; teiR; SDS2PAGE; 多克隆抗體類固醇類物質(zhì)、農(nóng)藥、殺蟲劑等化合物大量排入環(huán)境造成生態(tài)破壞,人類不育、癌癥等各種疾病日益增多. 在眾多的環(huán)境激素物質(zhì)中,類固醇物質(zhì)不但穩(wěn)定而且其激素活性大大高于其他環(huán)境激素類物質(zhì),對(duì)人類的生存和發(fā)展具有巨大威脅.睪丸酮叢毛單胞菌(Com am onas testosteroni)是革蘭氏陰性菌,具有降解類固醇化合物的關(guān)鍵酶32羥基類固醇脫氫酶/碳酰基

3、還原酶(32hydroxysteroiddehydrogenase / carbonyl reductase, 32HSD /CR) ,能夠以各種類固醇化合物作為唯一碳源和能源,通過許多復(fù)雜代謝途徑完全消化類固醇化合物 1 ,因此對(duì)環(huán)境修復(fù)具有重要意義. 近年來睪丸酮叢毛單胞菌的研究備受歐盟、日本等國(guó)家的重視. 在睪丸酮叢毛單胞菌基因組DNA中至少包含2個(gè)編碼類固醇降解酶基因的基因簇, teiR 基因位于基因簇鄰位開裂酶基因tesB下游,對(duì)tesH基因的表達(dá)起調(diào)控作用 2 - 3 . teiR基因編碼391個(gè)氨基酸,蛋白N端有1個(gè)自主誘導(dǎo)物結(jié)合區(qū)域, C端存在1個(gè)LuxR類型的HTH DNA結(jié)

4、合結(jié)構(gòu)域, TeiR蛋白與根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tum efa2ciens)特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白TraR具有很高的相似性,構(gòu)建突變菌發(fā)現(xiàn)teiR基因突變抑制了1 2dehydrogen2ase和32dehydrogenase的表達(dá),同時(shí)突變菌喪失了以睪丸酮作為唯一碳源和能源的能力 4 . 為了更好地利用和改造睪丸酮叢毛單胞菌,本研究構(gòu)建了teiR 基因高效表達(dá)載體,并在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),純化了TeiR融合蛋白,并制備了多克隆抗體.1材料與方法1. 1材料1. 1. 1菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基睪丸酮叢毛單胞菌(C. testosteron i ATCC11996, Ampr

5、 ) 、大腸桿菌( Escherichiacoli)BL21和DH5、質(zhì)粒pET28a (Kanr )均由本實(shí)驗(yàn)室保存. LB 培養(yǎng)基: 10 g·L - 1蛋白胨, 5 g·L - 1酵母粉, 5 g·L - 1 NaCl, pH 7. 0;M8培養(yǎng)基: 12. 8 g·L - 1 Na2HPO4 ·7H2O, 3 g·L - 1 KH2 PO4 , 2. 5 g·L - 1 NaCl, 5g·L - 1 NH4Cl, 0. 5 g·L - 1 MgSO4 , 0. 01 g·L - 1 Ca

6、Cl2 , 0. 2 g·L - 1酵母粉, pH 7. 0. 培養(yǎng)基120 高壓滅菌18 min, 4 保存?zhèn)溆?1. 1. 2酶、生化試劑及試劑盒TaqTM DNA聚合酶、膠回收試劑盒( PCR Fragment Recovery Kit) 、IPTG、限制性內(nèi)切酶和T4 連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司(大連) ;卡那霉素(Kan) 、氨芐青霉素(Amp )購(gòu)自AMERSCO公司(America, Solon) ;瓊脂糖(B iowest agarose) 、質(zhì)粒提取試劑盒(MediBEST Plasmid Purification Kit )和Ni2NTA Sp in Colum

7、n購(gòu)自Qiagen公司(上海) ; PCR引物和BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sangon公司(上海). 其余藥品為國(guó)產(chǎn)分析純生化試劑.1. 2方法1. 2. 1細(xì)菌培養(yǎng)以含60g·mL - 1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基和M8培養(yǎng)基培養(yǎng)睪丸酮叢毛單胞菌,培養(yǎng)條件為30 、180 r·min- 1 ;大腸桿菌以LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 、180 r·min- 1.1. 2. 2睪丸酮叢毛單胞菌基因組DNA提取按照Frederick et al 5 的方法從振蕩過夜培養(yǎng)的睪丸酮叢毛單胞菌中提取細(xì)菌總DNA.1. 2. 3轉(zhuǎn)化按照Sambrook et al

8、 6 的方法制備感受態(tài)細(xì)胞及細(xì)菌轉(zhuǎn)化操作.1. 2. 4teiR 基因PCR擴(kuò)增根據(jù)已發(fā)表的teiR 基因序列(GenBank登錄號(hào): AY363220)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物如下.5端引物P1: 52 CCGGAATTCATGTGCCCATATTTCGACACC23; 3端引物P2: 52 CCCAAGCTTTCACTT2GTTCCCCAG23.P1、P2引物分別添加了EcoR、Hind酶切位點(diǎn)(劃線處)及保護(hù)堿基. PCR反應(yīng)條件為: 94 預(yù)變性5 min; 94 變性45 s, 60 退火45 s, 72 延伸1 min 20 s, 30個(gè)循環(huán); 72 延伸10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)1.

9、 0%瓊脂糖凝膠電泳后,膠回收試劑盒回收目的片段.1. 2. 5質(zhì)粒pET28a2teiR的構(gòu)建質(zhì)粒和PCR回收產(chǎn)物分別經(jīng)EcoR和Hind雙酶切后,在常溫下以T4 連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5. 在含30g·mL - 1卡那霉素的固體培養(yǎng)基上37 培養(yǎng)過夜,挑選單克隆. 將挑選的單克隆在含30g·mL - 1卡那霉素的液體培養(yǎng)基上37 、180 r·min- 1振蕩培養(yǎng)進(jìn)行繁殖,提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoR和Hind雙酶切驗(yàn)證,即獲得teiR 基因表達(dá)載體pET28a2teiR.1. 2. 6融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)參照黃天培等 7 的方法,將重組質(zhì)粒pET28a2teiR

10、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,在含30g·mL - 1卡那霉素的液體培養(yǎng)基中37 、180 r·min- 1進(jìn)行培養(yǎng). 當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)至D595 nm = 0. 6時(shí),加入終濃度為1 mmol·L - 1 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h. 取1 mL細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)物, 13000 r·min- 1離心30 s,去掉上清液,加入20L PBS溶液渦旋. 取5L渦旋液沸水浴加熱5 min后,進(jìn)行SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳.1. 2. 7TeiR融合蛋白的柱純化利用Qiagen公司的Ni2NTA Sp in Column進(jìn)行TeiR融合蛋白的分離純化. 用含0 - 0. 5 m

11、ol·L - 1咪唑的0. 05 mol·L - 1磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)進(jìn)行梯度洗脫,將含有純化的重組TeiR蛋白收集后,進(jìn)行SDS2PAGE.1. 2. 8多克隆抗體的制備參照張正坤等 8 的方法,取100g純化的TeiR融合蛋白用適當(dāng)體積生理鹽水稀釋后,加等體積完全福氏佐劑充分乳化,于新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射,此為預(yù)免疫. 預(yù)免疫7 d后,取50g純化的TeiR蛋白,加等體積不完全福氏佐劑進(jìn)行免疫,每隔14 d加強(qiáng)免疫1次. 最后一次免疫后7 - 10 d,頸動(dòng)脈取血分離血清.1. 2. 9抗體效價(jià)分析將制備的TeiR多克隆抗體梯度稀釋至150000,以Tei

12、R融合蛋白為抗原包被,包被濃度為25 ng·mL - 1 ,以免疫前兔子血清為對(duì)照,采用EL ISA法檢測(cè)血清的效價(jià). EL ISA檢測(cè)參見Fred2erick et al 5 的方法.1. 2. 10抗體特異性分析將睪丸酮叢毛單胞菌培養(yǎng)于LB 或M8培養(yǎng)基中,取3 mL 細(xì)菌過夜培養(yǎng)物13000 r·min- 1離心30 s,去掉上清液,用PBS洗3遍后加入150L PBS溶液和150L“B”溶液(8 mol·L - 1尿素, 0. 1 mol·L - 1 NaH2 PO4 , 0. 01 mol·L - 1 Tris2Cl, pH 8. 0

13、)重懸沉淀,加入3L 1 mg·mL - 1的溶菌酶. 反復(fù)凍融3次( - 20 30 min, RT 30 min) ,每次30 min以上, 然后13000 r·min- 1離心20 min, 取上清液用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,并將細(xì)菌蛋白濃度調(diào)整為1 mg·mL - 1. 將制備純化的TeiR蛋白(10g·mL - 1 )用包被液稀釋成200、100、50、25、12. 5、6. 25 ng·mL - 1后進(jìn)行包被,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線;將濃度調(diào)整好的細(xì)菌蛋白用包被液稀釋100倍后進(jìn)行EL ISA測(cè)定 5 .M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.

14、 PCR產(chǎn)物.圖1睪丸酮叢毛單胞菌teiR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1The amp lification of teiR gene from C. testosteroni2結(jié)果與分析2. 1teiR基因PCR擴(kuò)增以睪丸酮叢毛單胞菌總DNA為模板,以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳顯示單一的條帶,且該條帶大小與GenBank登錄的基因大小一致(圖1) ,用Kit回收該目標(biāo)條帶.2. 2teiR基因表達(dá)載體pET28a2te iR的構(gòu)建質(zhì)粒pET28a和目的片段酶切連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5. 挑選單克隆進(jìn)行振蕩培養(yǎng)后,分別以P1、P2為引物進(jìn)行PC

15、R擴(kuò)增,篩選正確的克隆子. 提取PCR檢測(cè)陽性的克隆子重組質(zhì)粒,以EcoR和Hind進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證(圖2). 從圖2可見,重組質(zhì)粒pET28a2teiR的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳有2個(gè)條帶,且大小與預(yù)期結(jié)果一致,說明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確. 將質(zhì)粒pET28a2teiR (圖3)送大連寶生物公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與已報(bào)道序列一致.2. 3重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pET28a2teiR轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)至D595 nm = 0. 6時(shí),加入終濃度為1 mmol·L - 1 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h. 誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)12% SDS2PAGE電泳,結(jié)果如圖4

16、 所示. 從圖4 可見,誘導(dǎo)后pET28a2teiR的TeiR產(chǎn)物為一個(gè)大約45 ku的蛋白. 該蛋白為融合蛋白,具有6個(gè)組氨酸尾巴,進(jìn)一步可將這種蛋白通過特殊的Ni柱進(jìn)行純化.2. 4融合蛋白的分離純化利用Qiagen公司的Ni2NTA Sp in Column進(jìn)行TeiR融合蛋白的分離純化. 用含0 - 0. 5 mol·L - 1咪唑的0. 05 mol·L - 1磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)進(jìn)行梯度洗脫,將含有純化的重組TeiR蛋白收集后進(jìn)行SDS2PAGE (圖5). 從圖5可見,純化的蛋白在SDS2PAGE中呈現(xiàn)單一條帶,表明已成功獲得了TeiR融合蛋白,其純

17、度高,可以進(jìn)行下一步多克隆抗體的制備.2. 5多克隆抗體效價(jià)及特異性分析將制備的TeiR多克隆抗體梯度稀釋,以TeiR融合蛋白為抗原進(jìn)行包被,采用EL ISA法檢測(cè)血清的效價(jià), 當(dāng)陽性與陰性的比值( P /N)大于2. 1時(shí),相對(duì)應(yīng)抗體稀釋度即為該抗體的效價(jià). 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該抗體可以與制備的TeiR融合蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng),其效價(jià)可達(dá)110000 (圖6). 以不同培養(yǎng)條件下的睪丸酮叢毛單胞菌細(xì)菌總蛋白為抗原,制備的TeiR多克隆抗體進(jìn)行EL ISA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該抗體能夠與睪丸酮叢毛單胞菌天然TeiR蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng)(圖7). 從圖7檢測(cè)發(fā)現(xiàn),以LB培養(yǎng)基和M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)的睪丸酮叢毛單胞菌其teiR 基因的表達(dá)量存在明顯差異,而在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),睪丸酮叢毛單胞菌在M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度明顯低于在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度. 以兩種基本培養(yǎng)基為培養(yǎng)條件的睪丸酮叢毛單胞菌teiR 基因表達(dá)量差異的原因可能是由睪丸酮叢毛單胞菌在兩種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不一致而引起.3小結(jié)與討論睪丸酮叢毛單胞菌teiR基因編碼蛋白與根癌農(nóng)桿菌(A. tum efaciens)特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白TraR具有很高的相似性,屬于Lux