論文研究計(jì)劃

1、論文研究計(jì)劃題 目: 砷脅迫下水稻灌漿期籽粒響應(yīng)的代謝組學(xué)及 蛋白質(zhì)組學(xué)研究 姓 名: 楊 歡 報(bào)考學(xué)院: 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 報(bào)考專業(yè): 作物栽培學(xué)與耕作學(xué) 畢業(yè)院校: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畢業(yè)時(shí)間： 2017年7月 論文研究計(jì)劃一、論文題目：砷脅迫下水稻灌漿期籽粒響應(yīng)的代謝組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、研究目的：從代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的角度來分析不同水稻品種籽粒對砷脅迫的耐受響應(yīng)。大量的代謝和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)可以豐富我們對水稻砷耐性差異分子機(jī)理及水稻應(yīng)答砷脅迫的分子機(jī)制的理解。三、研究背景：水稻是全球主要的糧食作物之一，但其產(chǎn)量與質(zhì)量受到重金屬污染、干旱、高溫等非生物脅迫作用的影響。砷是一種理化性質(zhì)與金屬

2、相似的類金屬元素，在環(huán)境學(xué)中也被歸為重金屬，砷及化合物具有劇毒、致癌、致畸和致突變特性（IARC，2004）。研究表明水稻具有高效的砷吸收、富集和向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，其稻谷中的砷富集量約是其他和谷類作物如小麥、玉米的10倍（Tuli, et al. 2010）。近年來，針對水稻砷形態(tài)、代謝規(guī)律、吸收、富集和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的研究工作取得一定成果。盡管低濃度的無機(jī)砷能夠促進(jìn)部分水稻的發(fā)芽率，但隨著砷濃度的升高多數(shù)水稻的發(fā)芽率下降，甚至不能發(fā)芽（李仁英等, 2014）。但一定濃度的砷脅迫不僅影響發(fā)芽和水稻植株的正常，還會(huì)使水稻穎殼出現(xiàn)重穎、封閉不攏等畸形癥狀，結(jié)實(shí)率僅有3040，結(jié)實(shí)籽粒不飽滿甚至短?。?/p>

3、劉建軍等, 2014）。此外，砷脅迫對稻米的品質(zhì)也存在一定的影響，整精米率、堊白米率、堊白度以及蛋白質(zhì)含量顯著下降，堿消值增加（即稻米蒸煮后口感硬，食味不良）等（曹瑩等, 2013）。在植物體內(nèi)砷的毒性與其存在的形態(tài)有關(guān)。一般將環(huán)境中存在的砷分為兩類： 無機(jī)砷和有機(jī)砷。 砷酸鹽（As）和亞砷酸鹽（As）屬于無機(jī)砷，其中As（）的毒性要大于 As（）；有機(jī)砷包括單甲基砷酸（鹽）（MMA）、二甲基砷酸（鹽）（DMA）、砷甜菜堿和砷糖等， 主要存在于海洋動(dòng)物和食用藻類中（Zhao, et al. 2009）。Verbruggen等（2009）研究表明有機(jī)砷比無機(jī)砷的毒性低， 但當(dāng)五價(jià)的 MMA（As

4、）和 DMA（As）被還原為三價(jià)的 MMA（As）和 DMA（As）， 會(huì)大大增大其毒性。As（）對植物的毒害作用大于 As（），但兩者對植物的毒害作用機(jī)理不同。As（V）主要通過干擾P代謝對植物產(chǎn)生毒害，而 As（）主要干擾植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶，因此不同形態(tài)的砷對植物生長的影響不同。（康瑞娟等, 2005）不同水稻品種對 As 的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和耐性均存在顯著差異。目前對耐砷和砷敏基因型水稻工作集中在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上研究水稻響應(yīng)砷脅迫的生理機(jī)制。Rai等（2011）發(fā)現(xiàn)，水稻品種 Triguna、IR-36 和 PNR-59 比較耐砷，它們在遭受砷脅迫后其基因組中硫同化代謝及抗氧化系統(tǒng)等相關(guān)

5、基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。Liu 等（2010）對秈稻明恢86 進(jìn)行亞砷酸鹽脅迫處理，在幼苗根系中鑒定到67個(gè)應(yīng)答砷脅迫的miRNA，這些 miRNA 的靶基因主要包括一些轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、DNA或金屬離子結(jié)合蛋白， 它們參與細(xì)胞和代謝過程、色素沉著和應(yīng)激反應(yīng)等。不同形態(tài)的砷在不同基因型水稻籽粒中也存在顯著的差異。在生殖階段，水稻中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)因子（OsABCC1）可減小As轉(zhuǎn)運(yùn)分配至籽粒中。（Song, et al, 2014）眾所周知，蛋白質(zhì)是大多數(shù)生理、生化過程的實(shí)際執(zhí)行者，在蛋白質(zhì)水平上研究可獲得大量有價(jià)值的信息。通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)不同的逆境脅迫能對蛋白質(zhì)組產(chǎn)生一些共同的影響，如抗氧化

6、酶體系活性的上調(diào)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）活性的降低以及熱激蛋白分子的表達(dá)增強(qiáng)（肖清鐵等, 2011）。不同逆境脅迫下蛋白質(zhì)的表達(dá)也會(huì)有所不同，因此研究不同脅迫下響應(yīng)逆境脅迫差異蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，可以幫助我們加深對植物-逆境因子互作關(guān)系的認(rèn)識(shí)。前人采用包括雙向電泳在內(nèi)的多種技術(shù)策略進(jìn)行了大量關(guān)于植物響應(yīng)非生物脅迫因子的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在研究不同重金屬脅迫下對水稻葉片蛋白質(zhì)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)銅、鉻、汞等金屬元素對水稻葉片蛋白質(zhì)表達(dá)的影響很大，重金屬脅迫后水稻體內(nèi)Rubisco酶活性降低，而SOD、OsPR5以及OsPR10等抗性相關(guān)蛋白的表達(dá)增加。對水稻根系響應(yīng)脅迫的蛋白質(zhì)

7、組學(xué)研究表明，SAMS、GSTs、CS、CST-tau和TSPP等調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)量呈上升趨勢。（Ahsan, et al. 2010）砷對水稻葉片的壓力能導(dǎo)致二磷酸核酮糖羧化酶的減少，從而降低光合作用速率。Requejo等（2006）發(fā)現(xiàn)，與對照相比，在As（）或As（）脅迫下，產(chǎn)生的差異蛋白中有7種與細(xì)胞氧化的關(guān)系密切。植物對重金屬等逆境脅迫的調(diào)節(jié)和適應(yīng)是一個(gè)綜合的反應(yīng)，涉及基因調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、翻譯后修飾和代謝反饋等多個(gè)生物學(xué)水平的系統(tǒng)調(diào)節(jié)。生物受到生物或非生物脅迫后導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂，代謝產(chǎn)物是其表達(dá)的最終產(chǎn)物。植物對于外界環(huán)境的刺激所產(chǎn)生的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的代謝反應(yīng)，致使代謝物的種類、含量

8、發(fā)生變化，進(jìn)而造成代謝物所參與的代謝途徑發(fā)生改變。因此，利用代謝組學(xué)技術(shù)來研究植物應(yīng)對逆境脅迫下的代謝活動(dòng)受到越來越多的關(guān)注。2013年，Wu等（2013）利用代謝學(xué)技術(shù)，以野生大麥和培育大麥為研究對象，比較了鹽脅迫下二者的代謝差異，發(fā)現(xiàn)植物受到鹽脅迫后其植物體內(nèi)有82個(gè)代謝物的種類和含量都發(fā)生了變化，并進(jìn)一步探討了耐鹽機(jī)理，為篩選耐鹽性較強(qiáng)的大麥品種提供理論依據(jù)。Morsy等（2007）以耐冷型和冷敏感型的水稻為研究對象，基于高效液相色譜（HPLC）儀器分析探討了二者于低溫脅迫下糖類代謝組學(xué)差異，研究表明耐冷型水稻中積累了較多的半乳糖和棉子糖。Holmes等（2003）利用NMR進(jìn)行了麥瓶草

9、懸浮細(xì)胞在Cd 脅迫條件下的代謝組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)Cd處理的麥瓶草懸浮細(xì)胞內(nèi)的蘋果酸和醋酸鹽類的代謝產(chǎn)物含量均升高，而谷氨酸及其支鏈氨基酸的含量均降低。Navarro等（2017）以水稻日本晴品種為試驗(yàn)材料，利用HPLC Q-Exactive分析日本晴在重金屬Cd脅迫下的代謝物及代謝途徑發(fā)生的變化，所鑒定到74個(gè)代謝物含量均發(fā)生變化，涉及到的代謝途徑主要為氨基酸代謝、嘌呤代謝、碳代謝以及甘油脂代謝。目前，關(guān)于關(guān)于砷脅迫水稻的蛋白質(zhì)研究主要集中在根莖葉等其他組織，但系統(tǒng)將水稻灌漿期的籽粒代謝變化和蛋白質(zhì)差異綜合分析的研究還鮮有報(bào)道。因此，開展砷脅迫下水稻灌漿期籽粒的代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究

10、，有可能為砷在籽粒富集提供有價(jià)值信息，從而為培育低砷水稻品種提供理論基礎(chǔ)。四、研究內(nèi)容：1、為研究水稻籽粒耐砷性蛋白質(zhì)的響應(yīng)，本試驗(yàn)利用同位素標(biāo)記的相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）標(biāo)記技術(shù)與GO功能注釋的生物信息學(xué)相結(jié)合，分析低砷突變體和野生型灌漿期籽粒中的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。鑒定在砷處理后籽粒中的蛋白質(zhì)含量變化和變化蛋白質(zhì)參與的代謝途徑。2、利用Q-TOF LC/MS結(jié)合代謝組學(xué)分析砷脅迫籽粒響應(yīng)的代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行KOBAS（KEGG Orthology Based Annotation Sys

11、tem），分析低砷突變體和野生型水稻籽粒灌漿期砷處理后的差異代謝物可能參與的代謝途徑，可能包括氨基酸代謝、有機(jī)酸代謝等代謝途徑，這些代謝途徑的變化可能與低富集品種的耐性相關(guān)。五、創(chuàng)新點(diǎn)：本研究將代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)地結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對水稻籽粒在砷脅迫后的蛋白質(zhì)和代謝物的差異性研究，為籽粒富集砷的機(jī)理研究提供技術(shù)支持。六、研究技術(shù)方案：1、材料選擇及培養(yǎng)采用采用低砷突變體（low arsenic, las）和野生型（9311，WT）為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)，設(shè)置一系列濃度梯度處理。水稻播種前將種子在蒸餾水中浸泡4h后用2%的次氯酸鈉消毒30min，再用清水反復(fù)沖洗數(shù)次。種子催芽在35黑暗條件下的

12、人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行。待種子露白后均勻播撒在1L塑料黑色桶的培養(yǎng)網(wǎng)中，培養(yǎng)箱的條件設(shè)置為：第一段溫度為35，相對濕度75%，光照強(qiáng)度80%，時(shí)間14h；第二段溫度為25，相對濕度75%，光照強(qiáng)度0%，時(shí)間10h。待水稻培養(yǎng)至三葉一心時(shí)，選取長勢健壯一致的水稻幼苗移栽至容積6L，內(nèi)裝有5L培養(yǎng)液的塑料黑色桶中，每桶5穴，每穴3株，用樹脂塑料板將各穴分隔開來，并用海綿進(jìn)行固定。水培所用營養(yǎng)液按照國際水稻研究所（IRRI）推薦的配方配制，并選擇用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)p H值至5.56.0。在幼苗移栽兩周后，向培養(yǎng)液中加入一系列濃度梯度的砷溶液，對照組CK即為不加砷處

13、理。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，培養(yǎng)液每三天更換一次營養(yǎng)液。待培養(yǎng)至水稻灌漿期再對籽粒進(jìn)行取樣。2、水稻籽粒中蛋白的提取及iTRAQ標(biāo)記參考An等（2015）的方法，稱取0.5 g經(jīng)液氮研磨的水稻灌漿籽粒樣品于50 mL離心管中，加入5 mL PBS緩沖液（100mmol/L, pH 7.4），冰浴下高速勻漿超聲30s，于4、10000 g條件下離心30 min。取上清液分別加入50 L 1mol/L DTT使其終濃度為10 mmol/L，于56條件下反應(yīng)30 min；加入適量125 L1mol/L IAA使其終濃度為25 mmol/L，于37條件下避光30 min。 先加入等體積（5 mL）的預(yù)冷

14、丙酮混勻至無可見顆粒狀物質(zhì)，再加入5倍體積的預(yù)冷丙酮?jiǎng)×艺鹗幒笾糜?20 條件下靜置3 h，4離心機(jī)中10000 g離心45 min，倒掉上清液后再加入等體積的有丙酮:水=6:1清洗沉淀一次，離心30 min后將上清液倒掉后置于空氣中自然晾干。用1mL 50mM NH4HCO3（pH 8.0）溶解，于4、10000 g條件下離心30 min，取上清液測定蛋白質(zhì)濃度。取200 L蛋白溶液后按酶:蛋白=1:50的比例加入Trypsin酶在轉(zhuǎn)速為500 rpm 37的金屬浴中酶解2 h，加入20 L甲酸終止酶解反應(yīng)。將固相萃取小柱（MILI-SPE Exctractiondisk Cartridge

15、, 3 mL, C18-SD）裝入15mL離心管中，加入1 mL甲醇，1500 g離心1min；加入0.5 mL70%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），1500 g離心1 min；加入0.5 mL 0.1%甲酸水溶液，1500 g離心1 min；將酶解后的肽段樣品加入小柱中，200 g離心5 min；加入0.5 mL甲酸溶液，以200 g離心3 min；將固相萃取小柱取出置于新的15 mL離心管中，加入0.5 mL 70%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），200 g離心5 min，再加入0.5 mL 70%乙腈水溶液（含0.1%甲酸），重復(fù)洗脫一次，洗脫液即為脫鹽后的混合肽段溶液。采用8-plex i

16、TRAQ kit（Applied Biosystems, Framingham, MA）按說明書進(jìn)行標(biāo)記。將脫鹽后的樣品凍干后重新溶解于30 L 0.5 M 三乙基碳酸氫銨（TEAB），pH 8.0中。將每份 iTRAQ試劑溶解于70 L無水乙醇，再八份每份均為100 g的樣品中分別加入iTRAQ試劑，在室溫放置1小時(shí)后加入10 L 1M Tris-HCl （pH 8.5）終止反應(yīng)。因樣品中含有的各種緩沖液會(huì)影響后續(xù)的質(zhì)譜分析，所以在進(jìn)行液相質(zhì)譜分析前需要在Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)上用離子交換色譜法純化所得到的樣品。3、代謝物提取參照 Li 等（2015）的方法：稱取經(jīng)液氮研磨的

17、水稻籽粒樣品粉末400 mg，加入4 m L 預(yù)冷（20°C）的甲醇溶液，渦旋混勻1 min，加入10.8 m L MTBE，渦旋混勻1 min，加入7.2 m L水，渦旋混勻1 min，室溫放置10 min，在4°C以12000 r/min離心20 min，分層后分別取上下層溶液，其中上層為非（弱）極性代謝物，下層為極性代謝物，離心濃縮后用初始流動(dòng)相復(fù)溶，待測。4、數(shù)據(jù)采集及分析代謝物分析利用 Agilent Mass Hunter 四極桿飛行時(shí)間采集軟件（B.06.00）和定性分析（B.07.00）軟件進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。將整個(gè)數(shù)據(jù)集加載到 Agilent Mass

18、 Hunter Profinder（6.0 版）軟件，對色譜峰進(jìn)行峰提取、峰匹配、峰對齊、峰識(shí)別、基線矯正以及歸一化處理，并導(dǎo)出為 cef 文件，導(dǎo)入 Mass Profiler Professional（MPP, Agilent）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置：基線噪音水平600 counts，絕對峰高6000 counts，質(zhì)量窗口0.5 Da，時(shí)間窗口0.5 min，代謝物提取算法類型：小分子化合物（色譜）。蛋白質(zhì)分析通過LTQ-Orbitrap和Xcalibur（Version 2.07,美國Thermo公司）軟件進(jìn)行樣品采集，數(shù)據(jù)分析在Proteome Discover軟件（Ver

19、sion 2.0,美國Thermo公司）中利用SEQUEST軟件在水稻數(shù)據(jù)庫（Oryza sativa subspJaponica (ice). fasta）中檢索鑒定。檢索設(shè)置參數(shù)為：所有肽段設(shè)置為胰蛋白酶酶切，最大允許2個(gè)漏切位點(diǎn)，前體離子的質(zhì)量容忍度設(shè)置為10 ppm，碎片離子的質(zhì)量容忍度設(shè)置為0.6 Da；設(shè)定半胱氨酸殘基C端為固定修飾+57 Da，Met（M）+15.995 Da設(shè)為可變修飾；使用precolator卡值，使所有肽段鑒定信息的假陽性率控制在1%以內(nèi)，確保鑒定結(jié)果更為可靠。5、砷含量測定參照鞏佳第等人（2014）的方法，取待測稻米樣品于磨粉機(jī)中研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取1.0

20、 g置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 0.3 mol/L硝酸水溶液，渦旋混勻，再置于石墨消解儀中在95下提取90 min。將提取液冷卻至室溫，在8000 r/min下離心15 min，取上清液過0.22 m濾膜后，用LC-ICP-MS分析。六、研究階段：第一階段：認(rèn)真學(xué)習(xí)代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的基本知識(shí)，包括對KEGG代謝途徑和GO功能注釋等生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫的學(xué)習(xí)。掌握LC-QTOF-MS、LC-QTRAP-MS和LC-ICP-MS等大型儀器的使用和維護(hù)。系統(tǒng)地翻閱與砷脅迫研究相關(guān)的文獻(xiàn)，摸索確定實(shí)驗(yàn)方案和研究內(nèi)容。（預(yù)計(jì)第一年完成）第二階段：按照建立的實(shí)驗(yàn)方案，種植水稻并進(jìn)行砷

21、脅迫處理，用水培的方法培養(yǎng)至灌漿期。對灌漿期籽粒取樣，并預(yù)處理后進(jìn)行代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)和砷提取并測定。對所測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析關(guān)聯(lián)（預(yù)計(jì)第二年完成）第三階段：收集相關(guān)的研究資料，初步確定論文課題的思路和寫作結(jié)構(gòu)，待課題開題和中期考核通過后開始論文的寫作。（預(yù)計(jì)第三年完成）七、預(yù)期達(dá)到的效果：1、運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合GO功能注釋等生物信息學(xué)分析技術(shù)找到砷脅迫下水稻灌漿期籽粒中的蛋白質(zhì)變化，并找出變化的蛋白質(zhì)參與的功能信息。2、對籽粒中代謝產(chǎn)物分析結(jié)合KEGG代謝途徑分析注釋變化的代謝產(chǎn)物參與的重要代謝途徑，并定位至代謝途徑的一個(gè)環(huán)節(jié)。3、結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和籽粒中砷含量變化的信息關(guān)聯(lián)性，分析砷脅

22、迫后灌漿期籽粒的響應(yīng)機(jī)制，為研究籽粒富集砷的機(jī)理提供參考。八、參考文獻(xiàn)：1. IARC, Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Some drinking-water disinfectants and contaminants, including arsenic. Monographs on chloramine, chloral and chloral hydrate, dichloroacefic acid, trichloroacetic acid and 3-chloro-4-(dichlo

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