第二章-基因工程制藥-新版5課件

1、六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點(diǎn)六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點(diǎn)（一）基因工程菌質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（一）基因工程菌質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（二）質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法（二）質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法（三）質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因（三）質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因（四）提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法（四）提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法（五）基因工程菌的生長速率（五）基因工程菌的生長速率（六）蛋白質(zhì)產(chǎn)量（六）蛋白質(zhì)產(chǎn)量/ /菌體數(shù)量比菌體數(shù)量比（七）能量供應(yīng)與菌體生長的關(guān)系（七）能量供應(yīng)與菌體生長的關(guān)系（八）小分子前體、催化劑供應(yīng)與菌體生長的關(guān)系（八）小分子前體、催化劑供應(yīng)與菌體生長的關(guān)系（一）基因工程菌質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（一）基因工程菌質(zhì)粒的不穩(wěn)定

2、性n基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，有穩(wěn)定的現(xiàn)象，有分裂不穩(wěn)定分裂不穩(wěn)定和和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。定。 由于質(zhì)粒不穩(wěn)定導(dǎo)致的質(zhì)粒丟失菌與含有由于質(zhì)粒不穩(wěn)定導(dǎo)致的質(zhì)粒丟失菌與含有質(zhì)粒的菌之間質(zhì)粒的菌之間生產(chǎn)速率生產(chǎn)速率不一致導(dǎo)致可能不一致導(dǎo)致可能的生長優(yōu)勢，進(jìn)而能在培養(yǎng)基中逐漸取的生長優(yōu)勢，進(jìn)而能在培養(yǎng)基中逐漸取代含質(zhì)粒菌成為優(yōu)勢菌群，從而減少基代含質(zhì)粒菌成為優(yōu)勢菌群，從而減少基因表達(dá)的產(chǎn)率，因表達(dá)的產(chǎn)率，導(dǎo)致基因工程菌在生產(chǎn)導(dǎo)致基因工程菌在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象過程中出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象。 （二）質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法二）質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法（1）將工程

3、菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻）將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂于涂于不含抗生素標(biāo)記不含抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)的平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-12h，統(tǒng)計(jì)所長出的，統(tǒng)計(jì)所長出的菌落數(shù)菌落數(shù)A；（2）然后隨機(jī)挑選）然后隨機(jī)挑選100個(gè)菌落，接種到含有個(gè)菌落，接種到含有抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-12h，統(tǒng)計(jì)所長出的統(tǒng)計(jì)所長出的菌落數(shù)菌落數(shù)B；（3）計(jì)算）計(jì)算B/A的比值的比值。該比值能反映質(zhì)粒的。該比值能反映質(zhì)粒的穩(wěn)定性穩(wěn)定性,稱為稱為穩(wěn)定性穩(wěn)定性(stability,ST) （三）質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因（三）質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因1 1、分裂不穩(wěn)定、分裂不穩(wěn)定: :指基因工程

4、菌在分裂的子代菌指基因工程菌在分裂的子代菌體中，出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的現(xiàn)象。它主體中，出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的現(xiàn)象。它主要與要與2 2個(gè)因素有關(guān)：個(gè)因素有關(guān)：（1 1）工程菌產(chǎn)生丟失質(zhì)粒的概率，）工程菌產(chǎn)生丟失質(zhì)粒的概率，拷貝量拷貝量低低的工程細(xì)菌，它所產(chǎn)生的工程細(xì)菌，它所產(chǎn)生不含質(zhì)粒的細(xì)菌變不含質(zhì)粒的細(xì)菌變異株異株和和概率較大概率較大。 （2 2）丟失質(zhì)粒的細(xì)菌、含有質(zhì)粒的工程菌）丟失質(zhì)粒的細(xì)菌、含有質(zhì)粒的工程菌之間的之間的競爭力大小。競爭力大小。2 2、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定: :指外源基因從質(zhì)粒上指外源基因從質(zhì)粒上丟失丟失、或、或者發(fā)生者發(fā)生堿基重排、缺失現(xiàn)象堿基重排、缺失現(xiàn)象，最終導(dǎo)致工

5、程，最終導(dǎo)致工程菌性能改變的現(xiàn)象。菌性能改變的現(xiàn)象。（四）提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法（四）提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1 1、選擇合適的宿主菌、選擇合適的宿主菌2 2、選擇合適的載體、選擇合適的載體3 3、選擇性壓力、選擇性壓力4 4、分階段培養(yǎng)、分階段培養(yǎng)5 5、控制培養(yǎng)條件、控制培養(yǎng)條件6 6、固定化、固定化1 1、選擇合適的宿主菌、選擇合適的宿主菌 宿主菌的遺傳特性對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定宿主菌的遺傳特性對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性影響很大。性影響很大。2 2、選擇合適的載體、選擇合適的載體 含低拷貝質(zhì)粒的菌含低拷貝質(zhì)粒的菌產(chǎn)生不含質(zhì)產(chǎn)生不含質(zhì)粒的子代菌頻率粒的子代菌頻率大于大于含高拷貝含高拷貝質(zhì)粒的菌。質(zhì)粒的菌。3 3、選擇

6、性壓力、選擇性壓力 因?yàn)閬G失質(zhì)粒因?yàn)閬G失質(zhì)粒的細(xì)菌在含的的細(xì)菌在含的抗生素的培養(yǎng)抗生素的培養(yǎng)基中不能正?；胁荒苷ＩL。生長。 所以可通過加所以可通過加入抗生素來入抗生素來抑抑制制質(zhì)粒丟失的質(zhì)粒丟失的細(xì)菌的生長。細(xì)菌的生長。4 4、分階段培養(yǎng)、分階段培養(yǎng) 工程菌的培養(yǎng)一般分為工程菌的培養(yǎng)一般分為2 2個(gè)階段：個(gè)階段：（1 1）第一階段）第一階段: :先使菌體生長至一定先使菌體生長至一定密度密度。（2 2）第二階段）第二階段: :開始開始誘導(dǎo)誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。外源基因的表達(dá)。 由于第一階段外源基因沒有表達(dá)，減少了由于第一階段外源基因沒有表達(dá)，減少了丟失質(zhì)粒的細(xì)菌的產(chǎn)生概率，也就增加了丟失質(zhì)粒

7、的細(xì)菌的產(chǎn)生概率，也就增加了工程菌的工程菌的穩(wěn)定性穩(wěn)定性。5 5、控制培養(yǎng)條件、控制培養(yǎng)條件通過溫度、通過溫度、pH值、培養(yǎng)基組分、溶解氧的值、培養(yǎng)基組分、溶解氧的綜合調(diào)節(jié)措施綜合調(diào)節(jié)措施通過以下方法可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過以下方法可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。（1）間歇間歇送氧送氧（2）改變）改變稀釋速率稀釋速率6 6、固定化、固定化固定化可提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性。固定化可提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性。（五）基因工程菌的生長速率（五）基因工程菌的生長速率 細(xì)菌菌體生長是核酸和蛋白質(zhì)的綜合表現(xiàn)，細(xì)菌菌體生長是核酸和蛋白質(zhì)的綜合表現(xiàn)，通常用通常用比生長速率比生長速率表征。表征。 比生長速率比生長

8、速率:表征微生物生長速率的參數(shù)。表征微生物生長速率的參數(shù)。 菌體生長菌體生長對(duì)于提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代對(duì)于提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量都有重要的意義。都有重要的意義。 基因工程菌的生長速率可通過基因工程菌的生長速率可通過選用不同的選用不同的碳源碳源、控制補(bǔ)料量控制補(bǔ)料量、稀釋速率稀釋速率的方法來加的方法來加以控制。以控制。（六）蛋白質(zhì)產(chǎn)量（六）蛋白質(zhì)產(chǎn)量/ /菌體數(shù)量比菌體數(shù)量比 在基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，在基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，蛋白質(zhì)產(chǎn)量蛋白質(zhì)產(chǎn)量/菌體數(shù)量比菌體數(shù)量比基本上是一個(gè)恒定值?；旧鲜且粋€(gè)恒定值。 細(xì)

9、菌生長速度快，其蛋白質(zhì)合成的速度也相應(yīng)細(xì)菌生長速度快，其蛋白質(zhì)合成的速度也相應(yīng)加快。加快。（七）能量供應(yīng)與菌體生長的關(guān)系（七）能量供應(yīng)與菌體生長的關(guān)系1 1、 Andersen Andersen 理論理論（1 1）AndersenAndersen等人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中所能提等人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中所能提供的最大能量決定著工程細(xì)菌的供的最大能量決定著工程細(xì)菌的最大生長速率最大生長速率。（2 2）當(dāng)培養(yǎng)基提供的能量不足時(shí)，細(xì)菌往往會(huì)產(chǎn)生）當(dāng)培養(yǎng)基提供的能量不足時(shí)，細(xì)菌往往會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸，而代謝副產(chǎn)物乙酸，而乙酸乙酸則會(huì)明顯則會(huì)明顯抑制細(xì)菌的生抑制細(xì)菌的生長長。其實(shí)質(zhì)是由于三羧酸循環(huán)的供

10、能不足，導(dǎo)致。其實(shí)質(zhì)是由于三羧酸循環(huán)的供能不足，導(dǎo)致部分乙酰輔酶部分乙酰輔酶A A轉(zhuǎn)化成乙酸來供能。轉(zhuǎn)化成乙酸來供能。2 2、改進(jìn)方法、改進(jìn)方法（1 1）適當(dāng)）適當(dāng)提高提高pHpH值值，可以減少乙酸的抑制作用。，可以減少乙酸的抑制作用。（2 2）分批選用不同的）分批選用不同的碳源碳源、控制補(bǔ)料速度控制補(bǔ)料速度、能在一、能在一定范圍之內(nèi)，控制細(xì)菌的過度生長，從而抑制乙定范圍之內(nèi)，控制細(xì)菌的過度生長，從而抑制乙酸的產(chǎn)生。酸的產(chǎn)生。（八）前體供應(yīng)與菌體生長的關(guān)系（八）前體供應(yīng)與菌體生長的關(guān)系1、工程菌的生長速率工程菌的生長速率往往往往低于低于未經(jīng)克隆的未經(jīng)克隆的原原始宿主細(xì)胞始宿主細(xì)胞2、外源基因的

11、大量表達(dá)外源基因的大量表達(dá)常常引起工程菌的常常引起工程菌的生生長停滯長停滯。這種停滯與能量供應(yīng)無關(guān)。這種停滯與能量供應(yīng)無關(guān)。3、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸，能使細(xì)菌的、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸，能使細(xì)菌的生長速率提高。生長速率提高。4、當(dāng)合成材料的前體物供應(yīng)不足時(shí)，工程細(xì)、當(dāng)合成材料的前體物供應(yīng)不足時(shí)，工程細(xì)菌就會(huì)產(chǎn)生菌就會(huì)產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)嚴(yán)緊反應(yīng)”。當(dāng)氨酰當(dāng)氨酰tRNA不不足時(shí)，核糖體就會(huì)在密碼子上停留，并合成足時(shí)，核糖體就會(huì)在密碼子上停留，并合成ppGpp的魔點(diǎn)蛋白的魔點(diǎn)蛋白，這是一種調(diào)控因子，會(huì)，這是一種調(diào)控因子，會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)致RNA聚合酶在模板上移動(dòng)的停頓。聚合酶在模板上移動(dòng)的停頓。七、基因工

12、程菌中試七、基因工程菌中試 中試中試: :生物技術(shù)藥物與其他藥物一樣，從實(shí)生物技術(shù)藥物與其他藥物一樣，從實(shí)驗(yàn)室研究到產(chǎn)業(yè)化必須經(jīng)過中間放大試驗(yàn)驗(yàn)室研究到產(chǎn)業(yè)化必須經(jīng)過中間放大試驗(yàn)的系列工藝研究和驗(yàn)證，這種中間放大試的系列工藝研究和驗(yàn)證，這種中間放大試驗(yàn)簡稱之。驗(yàn)簡稱之。 中試放大的目的中試放大的目的是驗(yàn)證、復(fù)審和完善實(shí)是驗(yàn)證、復(fù)審和完善實(shí)驗(yàn)室工藝所研究確定的反應(yīng)條件，及研驗(yàn)室工藝所研究確定的反應(yīng)條件，及研究選定的工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備結(jié)構(gòu)、材質(zhì)、究選定的工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備結(jié)構(gòu)、材質(zhì)、安裝和車間布置等，為正式生產(chǎn)提供數(shù)安裝和車間布置等，為正式生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)，以及物質(zhì)量和消耗等。據(jù)，以及物質(zhì)量和消耗等。n藥物從

13、實(shí)驗(yàn)室的微量制備到工廠的產(chǎn)業(yè)藥物從實(shí)驗(yàn)室的微量制備到工廠的產(chǎn)業(yè)化制備，化制備，并不是簡單的數(shù)量級(jí)的線性放并不是簡單的數(shù)量級(jí)的線性放大關(guān)系大關(guān)系，而是各種研究技術(shù)的系統(tǒng)集成而是各種研究技術(shù)的系統(tǒng)集成和放大優(yōu)化。和放大優(yōu)化。n中試研究的理想狀況是中試研究的理想狀況是工藝穩(wěn)定工藝穩(wěn)定，工藝工藝規(guī)模同等條件放大規(guī)模同等條件放大，使設(shè)計(jì)的生產(chǎn)批量，使設(shè)計(jì)的生產(chǎn)批量和成本符合使用要求。和成本符合使用要求?；蚬こ叹性囆杩紤]以下幾方面：基因工程菌中試需考慮以下幾方面：1 1 工程菌的選擇工程菌的選擇2 2 反應(yīng)器的設(shè)計(jì)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)3 3 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成發(fā)酵培養(yǎng)基的組成4 4 工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制工藝

14、最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制5 5 計(jì)算機(jī)應(yīng)用計(jì)算機(jī)應(yīng)用1 1 工程菌的選擇工程菌的選擇能用基因重組技術(shù)獲得能用基因重組技術(shù)獲得高產(chǎn)潛力高產(chǎn)潛力以工業(yè)原料為培養(yǎng)基以工業(yè)原料為培養(yǎng)基生產(chǎn)工藝能用一般的工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)生產(chǎn)工藝能用一般的工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)產(chǎn)生和分泌的蛋白質(zhì)不致病、無毒性、能安全生產(chǎn)。產(chǎn)生和分泌的蛋白質(zhì)不致病、無毒性、能安全生產(chǎn)。代謝能控制代謝能控制2 2 反應(yīng)器的設(shè)計(jì)反應(yīng)器的設(shè)計(jì) 反應(yīng)器（發(fā)酵罐）的設(shè)計(jì)應(yīng)符合生物反應(yīng)反應(yīng)器（發(fā)酵罐）的設(shè)計(jì)應(yīng)符合生物反應(yīng)與化學(xué)工程需要，因此在設(shè)計(jì)前應(yīng)取得與化學(xué)工程需要，因此在設(shè)計(jì)前應(yīng)取得5 5 種生物數(shù)據(jù)：種生物數(shù)據(jù)：培養(yǎng)細(xì)胞系特性培養(yǎng)細(xì)胞系特性細(xì)胞生長率細(xì)胞生長率發(fā)

15、酵罐消毒方法發(fā)酵罐消毒方法溫度、溶氧、二氧化碳、溫度、溶氧、二氧化碳、pHpH值、代謝產(chǎn)物值、代謝產(chǎn)物后處理效果后處理效果3 3 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成發(fā)酵培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基作用培養(yǎng)基作用: : 提供化學(xué)元素提供化學(xué)元素, ,如碳、氮、氧、氫、磷、微量元素如碳、氮、氧、氫、磷、微量元素 提供特殊的營養(yǎng)源，氨基酸、維生素提供特殊的營養(yǎng)源，氨基酸、維生素 提供能源，如葡萄糖提供能源，如葡萄糖 控制代謝控制代謝4 4 工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制 工藝最佳化：工藝最佳化： 最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全、最周全的廢物處理效

16、果、最佳化速度與最低失敗全、最周全的廢物處理效果、最佳化速度與最低失敗率的綜合指標(biāo)。率的綜合指標(biāo)。 參數(shù)監(jiān)測控制參數(shù)監(jiān)測控制： 生物反應(yīng)中，有生物反應(yīng)中，有4種參數(shù)需監(jiān)測：種參數(shù)需監(jiān)測： 主要參數(shù)主要參數(shù)：pH值、溫度、溶氧、二氧化碳值、溫度、溶氧、二氧化碳 生物量生物量：渾濁度、細(xì)胞組分、總氮量及菌絲干重：渾濁度、細(xì)胞組分、總氮量及菌絲干重 碳源碳源：糖、有機(jī)酸、乙醇、淀粉、脂質(zhì)：糖、有機(jī)酸、乙醇、淀粉、脂質(zhì) 產(chǎn)品產(chǎn)品 5 5 計(jì)算機(jī)應(yīng)用計(jì)算機(jī)應(yīng)用熱電耦測量熱電耦測量-溫度溫度離子敏感電極離子敏感電極-元素元素氧化還原電極氧化還原電極-還原電位還原電位熱量計(jì)熱量計(jì)-熱平衡熱平衡最終目標(biāo)：最終

17、目標(biāo)： 工藝最佳化工藝最佳化、產(chǎn)品、產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量產(chǎn)量與質(zhì)量不斷提高、不斷提高、原材料與能源原材料與能源消耗不斷下降消耗不斷下降、成本降低成本降低。 經(jīng)計(jì)算機(jī)計(jì)算，模擬出一個(gè)經(jīng)計(jì)算機(jī)計(jì)算，模擬出一個(gè)高質(zhì)高質(zhì)、高產(chǎn)高產(chǎn)、低成本低成本的生產(chǎn)工藝最佳化的控制微生物的的生產(chǎn)工藝最佳化的控制微生物的數(shù)學(xué)公式。數(shù)學(xué)公式。八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn)八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn)（一）基因工程菌培養(yǎng)的程序（一）基因工程菌培養(yǎng)的程序（二）基因工程菌的培養(yǎng)方式（二）基因工程菌的培養(yǎng)方式（三）影響基因工程菌培養(yǎng)的各種因素分析（三）影響基因工程菌培養(yǎng)的各種因素分析（四）基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備（四）基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)

18、備-發(fā)酵罐發(fā)酵罐（五）基因工程菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化（五）基因工程菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化（一）基因工程菌培養(yǎng)的程序（一）基因工程菌培養(yǎng)的程序 搖瓶操作搖瓶操作：了解工了解工程菌生長的基礎(chǔ)條件，程菌生長的基礎(chǔ)條件，如溫度、如溫度、pHpH、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，各種組分以及碳氮比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體細(xì)胞的影積累對(duì)受體細(xì)胞的影響；響； 培養(yǎng)罐操作培養(yǎng)罐操作：確定確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案和順序。案和順序。（二）基因工程菌的培養(yǎng)方式（二）基因工程菌的培養(yǎng)方式1 1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)2 2、連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)3 3、透析培養(yǎng)、透析培養(yǎng)4 4、固

19、定化培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)1 1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng) 將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間后，間歇式或連續(xù)地時(shí)間后，間歇式或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的方法。使菌體進(jìn)一步生長的方法。 其目的是創(chuàng)造一個(gè)良好的微生物環(huán)境，其目的是創(chuàng)造一個(gè)良好的微生物環(huán)境，延長延長菌體的對(duì)數(shù)生長期菌體的對(duì)數(shù)生長期，來獲得，來獲得高密度的菌體總高密度的菌體總量量。2 2、連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng) 將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌式培養(yǎng)達(dá)到將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌式培養(yǎng)達(dá)到一定的菌體濃度后，同時(shí)進(jìn)行進(jìn)料、出料操一定的菌體濃度后，同時(shí)進(jìn)行進(jìn)料、出料操作，通

20、過控制一定的營養(yǎng)物稀釋比率，來進(jìn)作，通過控制一定的營養(yǎng)物稀釋比率，來進(jìn)行行不間斷式培養(yǎng)不間斷式培養(yǎng)的培養(yǎng)方式。的培養(yǎng)方式。 連續(xù)培養(yǎng)利于保持連續(xù)培養(yǎng)利于保持生產(chǎn)環(huán)境的恒定生產(chǎn)環(huán)境的恒定，利于控，利于控制制菌體的生長速率。菌體的生長速率。 但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致連續(xù)但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致連續(xù)培養(yǎng)比較困難。培養(yǎng)比較困難。3 3、透析培養(yǎng)、透析培養(yǎng) 透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)是利用膜的半透性原理，使得代謝是利用膜的半透性原理，使得代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分開，通過去除培養(yǎng)液中的代產(chǎn)物和培養(yǎng)基分開，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物的方法來謝產(chǎn)物的方法來消除代謝產(chǎn)物對(duì)工程菌的不消除代謝產(chǎn)物對(duì)工程菌的不良

21、影響良影響。 透析裝置是用半透膜將發(fā)酵器隔成兩半，形透析裝置是用半透膜將發(fā)酵器隔成兩半，形成發(fā)酵液區(qū)和透析液區(qū)，通過透析來及時(shí)移成發(fā)酵液區(qū)和透析液區(qū)，通過透析來及時(shí)移去合成產(chǎn)物。去合成產(chǎn)物。 半透膜的種類、孔徑、面積、發(fā)酵液和透析半透膜的種類、孔徑、面積、發(fā)酵液和透析液的比例、透析液的組成、循環(huán)流速、培養(yǎng)液的比例、透析液的組成、循環(huán)流速、培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間等因素會(huì)影響產(chǎn)物得率。持續(xù)時(shí)間等因素會(huì)影響產(chǎn)物得率。4 4、固定化培養(yǎng)、固定化培養(yǎng) 為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，將性，將固定化技術(shù)固定化技術(shù)和和基因工程菌基因工程菌結(jié)合起來，結(jié)合起來，進(jìn)行固定化式連續(xù)培進(jìn)行固定化式連續(xù)培養(yǎng)，有利于提高生

22、產(chǎn)養(yǎng)，有利于提高生產(chǎn)效率。效率。（三）影響基因工程菌培養(yǎng)的各種因素（三）影響基因工程菌培養(yǎng)的各種因素 基因工程菌基因工程菌 傳統(tǒng)微生物傳統(tǒng)微生物生物材料生物材料含外源重組基因含外源重組基因 不含外源重組基因不含外源重組基因發(fā)酵工藝發(fā)酵工藝使外源基因高效表達(dá)使外源基因高效表達(dá) 使自身基因表達(dá)使自身基因表達(dá)目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物 產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生外源蛋白質(zhì) 產(chǎn)生自身的代謝產(chǎn)生自身的代謝1 1、培養(yǎng)基的影響、培養(yǎng)基的影響 4 4、溶解氧的影響、溶解氧的影響2 2、接種量的影響、接種量的影響 5 5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響3 3、溫度的影響、溫度的影響 6 6、PHPH值的影響值的影響1 1、培養(yǎng)

23、基的影響、培養(yǎng)基的影響（1 1）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。糖。（2 2）常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋）常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、硫酸銨、硝酸銨、氯化白水解物、玉米漿、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨。銨。（3 3）其它組份：無機(jī)鹽、微量元素、維生素、）其它組份：無機(jī)鹽、微量元素、維生素、生物素。生物素。（4 4）無機(jī)磷在許多初級(jí)代謝的酶促反應(yīng)中是）無機(jī)磷在許多初級(jí)代謝的酶促反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子。一個(gè)效應(yīng)因子。2、接種量的影響、接種量的影響 接種量接種量是指所移入的種子液體量與培養(yǎng)液體是指所移入的種子液體量與培養(yǎng)液體量的比例，

24、它的大小會(huì)影響發(fā)酵物的產(chǎn)量量的比例，它的大小會(huì)影響發(fā)酵物的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。和發(fā)酵周期。（1）接種量小，菌體生長延遲，不利于外源）接種量小，菌體生長延遲，不利于外源基因的表達(dá)?；虻谋磉_(dá)。（2）接種量適中接種量適中，生產(chǎn)菌能夠迅速占領(lǐng)整個(gè)，生產(chǎn)菌能夠迅速占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，減少菌體污染的機(jī)會(huì)。培養(yǎng)環(huán)境，減少菌體污染的機(jī)會(huì)。（3）接種量過大，菌體生長過快，代謝產(chǎn)物）接種量過大，菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長。積累過多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長。 一般來說，一般來說，10-15%的接種量的接種量，菌體的延遲，菌體的延遲期短、菌群迅速繁衍、很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期短、菌群迅速繁衍、很

25、快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，適用于個(gè)源基因的表達(dá)。期，適用于個(gè)源基因的表達(dá)。3、溫度的影響、溫度的影響 溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制、溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、小分子蛋白質(zhì)的合成水平等轉(zhuǎn)錄、翻譯、小分子蛋白質(zhì)的合成水平等方面。方面。（1）在復(fù)制水平，溫度可影響基因拷貝數(shù)）在復(fù)制水平，溫度可影響基因拷貝數(shù)量。量。（2）在轉(zhuǎn)錄水平，溫度可影響）在轉(zhuǎn)錄水平，溫度可影響RNA聚合酶聚合酶的作用，而來調(diào)控基因表達(dá)。的作用，而來調(diào)控基因表達(dá)。（3）在翻譯水平上，還可以通過小分子蛋）在翻譯水平上，還可以通過小分子蛋白質(zhì)的合成水平來影響基因表達(dá)。白質(zhì)的合成水平來影響基因表達(dá)。（4）溫度還影響

26、蛋白質(zhì)的活性和包含體的）溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。形成。 4 4、溶解氧的影響、溶解氧的影響 溶解氧溶解氧對(duì)于工程菌發(fā)酵過程中的菌體代對(duì)于工程菌發(fā)酵過程中的菌體代謝是有十分重要作用。細(xì)菌在大量擴(kuò)增謝是有十分重要作用。細(xì)菌在大量擴(kuò)增過程中，要進(jìn)行過程中，要進(jìn)行消耗氧氣消耗氧氣的生化反應(yīng)過的生化反應(yīng)過程。因此，維持較高水平的溶解氧水平程。因此，維持較高水平的溶解氧水平（DO240%），才能維持工程菌的快），才能維持工程菌的快速生長和繁衍。速生長和繁衍。 采用采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法，可改善的方法，可改善培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。5、誘

27、導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響 對(duì)于對(duì)于PLclts875突變株工程菌來說，在突變株工程菌來說，在28-30培養(yǎng)時(shí)，突變體能產(chǎn)生培養(yǎng)時(shí)，突變體能產(chǎn)生阻遏蛋白阻遏蛋白、來阻止啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)譯。當(dāng)溫度升到來阻止啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)譯。當(dāng)溫度升到42時(shí)，時(shí)，這種阻遏作用就消失。此時(shí)溫度對(duì)于工程這種阻遏作用就消失。此時(shí)溫度對(duì)于工程菌的表達(dá)起誘導(dǎo)作用。菌的表達(dá)起誘導(dǎo)作用。 一般來說，對(duì)于處在生長期后期的工程菌一般來說，對(duì)于處在生長期后期的工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)，如菌體細(xì)胞密度在進(jìn)行誘導(dǎo)，如菌體細(xì)胞密度在109個(gè)個(gè)/ml時(shí)，時(shí)，通過升溫誘導(dǎo)，可達(dá)到蛋白質(zhì)表達(dá)增產(chǎn)的通過升溫誘導(dǎo)，可達(dá)到蛋白質(zhì)表達(dá)增產(chǎn)的效果。效果。6、pH值的影響值

28、的影響 pH對(duì)于細(xì)胞的正常生長、外源蛋白的高效表對(duì)于細(xì)胞的正常生長、外源蛋白的高效表達(dá)都有影響。達(dá)都有影響。（1）細(xì)胞細(xì)胞生長期的最佳生長期的最佳pH范圍是范圍是6.8-7.4。（2）外源蛋白外源蛋白表達(dá)的最佳表達(dá)的最佳pH范圍是范圍是6.0-6.5。n 在發(fā)酵過程中，細(xì)菌自身對(duì)在發(fā)酵過程中，細(xì)菌自身對(duì)pH值有一定的值有一定的調(diào)節(jié)能力。當(dāng)調(diào)節(jié)能力。當(dāng)pH值超出其調(diào)節(jié)能力的范圍值超出其調(diào)節(jié)能力的范圍時(shí)，會(huì)影響細(xì)菌生長。時(shí)，會(huì)影響細(xì)菌生長。n 發(fā)酵前期，發(fā)酵前期，pH值可控制在值可控制在7.0，隨著蛋白質(zhì)，隨著蛋白質(zhì)的表達(dá)，的表達(dá)，pH值不斷下降，當(dāng)值不斷下降，當(dāng)pH6.0時(shí)，應(yīng)時(shí)，應(yīng)及時(shí)開動(dòng)及時(shí)開動(dòng)堿泵堿泵，加入堿液。，加入堿液。（四）基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備（四）基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備-發(fā)酵罐發(fā)酵罐1 1、發(fā)酵罐的組成、發(fā)酵罐的組成2 2、發(fā)酵罐的要求、發(fā)酵罐的要求1 1、發(fā)酵罐的組成、發(fā)酵罐的組成（1）空氣加入系統(tǒng)）空氣加入系統(tǒng)-去水去油的空氣壓縮機(jī)去水去油的空氣壓縮機(jī) + 氣體流量計(jì)氣體流量計(jì) + 空氣無菌過濾器空氣無菌過濾器 + 溶解氧電溶解氧電極極 + 溶解氧控制系統(tǒng)。溶解氧控制系統(tǒng)。（2）pH調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)-H電極電極 + pH控制系統(tǒng)控制系統(tǒng) + 酸酸堿補(bǔ)加裝置。堿補(bǔ)