第五章_植物細(xì)胞培養(yǎng)與次級(jí)代謝產(chǎn)物制備

1、細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì) 胞 工 程大理大學(xué)農(nóng)生學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室大理大學(xué)農(nóng)生學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室 E-mail:2015.9.302015.9.30細(xì)胞工程細(xì)胞工程第五章第五章 植物植物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)l根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模:小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；l根據(jù)培養(yǎng)方式根據(jù)培養(yǎng)方式:懸浮培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)等；懸浮培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)等；l根據(jù)要求產(chǎn)物根據(jù)要求產(chǎn)物:用于誘變的細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生產(chǎn)物用于誘變的細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)。的細(xì)胞培養(yǎng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)（植物細(xì)胞培養(yǎng)（plant cell culture）是指在離體條件下）是指在離體條件下對(duì)植物對(duì)植物單個(gè)細(xì)胞

2、或小的細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖獲得細(xì)進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物的技術(shù)。胞或細(xì)胞產(chǎn)物的技術(shù)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程第一節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) 植物細(xì)胞直徑一般約為10-200m，平均直徑比微生物細(xì)胞大30-100倍。 植物細(xì)胞通常以一定細(xì)胞數(shù)目的非均相細(xì)胞團(tuán)方式存在于培養(yǎng)液中。 植物細(xì)胞具有纖維素細(xì)胞壁和大的液泡，很容易被剪切力損傷。 與微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，操作周期長(zhǎng)，分批培養(yǎng)一般需要2-3周。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 植物細(xì)胞培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜，適合微生物生長(zhǎng)，因此防止污染更困難。 植物細(xì)胞培養(yǎng)一般需要光照，通過(guò)光合作用合成有機(jī)物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對(duì)細(xì)

3、胞培養(yǎng)影響較大。細(xì)胞工程細(xì)胞工程與微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞有什么特點(diǎn)？ 細(xì)菌，真菌、植物細(xì)胞都有細(xì)胞壁胞。 細(xì)菌無(wú)成形的細(xì)胞核，真菌、植物細(xì)胞有成形的細(xì)胞核。 細(xì)菌只有核糖體一種細(xì)胞器。 植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大。 生命活動(dòng)與細(xì)胞分裂細(xì)胞工程細(xì)胞工程第二節(jié)第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1、植物細(xì)胞培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽（大量、微量） 碳源（蔗糖） 有機(jī)氮源（水解酪蛋白） 有機(jī)酸、維生素 植物生長(zhǎng)激素等細(xì)胞工程細(xì)胞工程（1）單細(xì)胞分離）單細(xì)胞分離1 1、酶解法、酶解法 選擇專一性水解酶在溫和的條件下將植物細(xì)胞壁物質(zhì)（纖維素 果膠 多糖）降解植物細(xì)胞壁物質(zhì)，從而使細(xì)胞彼此分開(kāi)，這種方法稱為酶解法。

4、經(jīng)常采用的生物酶包括：纖維素酶、果膠酶、瓊脂酶等生物酶。/機(jī)械法機(jī)械法外植體搗碎，然后過(guò)濾和離心。外植體搗碎，然后過(guò)濾和離心。2、由植物培養(yǎng)組織（愈傷組織）中分離單細(xì)胞植物單細(xì)胞分離與小規(guī)模培養(yǎng)植物單細(xì)胞分離與小規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程 酶解法酶解法Takebe等（等（1968）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)胞離大量的葉肉細(xì)胞加果膠酶加果膠酶過(guò)濾、離心過(guò)濾、離心細(xì)胞工程細(xì)胞工程由愈傷組織誘導(dǎo)分離單細(xì)胞由愈傷組織誘導(dǎo)分離單細(xì)胞莖段莖段步驟：步驟： 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織

5、的松不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；散性；細(xì)胞工程細(xì)胞工程搖床用于振蕩搖床用于振蕩繼代繼代懸浮懸?。⊿uspension culture)將愈傷組織在將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物建立懸浮培養(yǎng)物120rpm culturetransfer 1time/3d 3 weeks100-130目網(wǎng)過(guò)濾目網(wǎng)過(guò)濾Centrifuge(離心）離心） isolation細(xì)胞工程細(xì)胞工程（2）植物單細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)植物單細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)l看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)l飼養(yǎng)層培養(yǎng)技飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)術(shù)l細(xì)胞平板培養(yǎng)細(xì)胞平板培養(yǎng)l微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)概念：用一塊愈傷組織或植物

6、離體組織看護(hù)單細(xì)胞使其生長(zhǎng)增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法。細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程飼養(yǎng)層培養(yǎng)飼養(yǎng)層培養(yǎng)將飼養(yǎng)細(xì)胞先用射線輻射處理，使其失去活性，然后將飼養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞混合植板，經(jīng)過(guò)照射的細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞能夠起到一個(gè)飼養(yǎng)作用。細(xì)胞工程細(xì)胞工程雙層濾紙植板培養(yǎng)方法雙層濾紙植板培養(yǎng)方法培養(yǎng)基培養(yǎng)基飼養(yǎng)層細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞看護(hù)濾紙層轉(zhuǎn)移碟濾紙轉(zhuǎn)移碟濾紙培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程概念：將制備好的概念：將制備好的單細(xì)胞懸浮液?jiǎn)渭?xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密，按照一定的細(xì)胞密度，接種在度，接種在1mm1mm左右的左右的薄層固體培養(yǎng)基薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，稱上進(jìn)行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng)。

7、之為平板培養(yǎng)。細(xì)胞平板培養(yǎng)細(xì)胞平板培養(yǎng)法法細(xì)胞工程細(xì)胞工程微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)概念：人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)概念：人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法，稱微室培養(yǎng)?；?，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法，稱微室培養(yǎng)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)特點(diǎn)：特點(diǎn)：能在顯微鏡下追蹤單細(xì)胞分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的全能在顯微鏡下追蹤單細(xì)胞分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的全過(guò)程。過(guò)程。培養(yǎng)基少，營(yíng)養(yǎng)和水分難以保持，培養(yǎng)基少，營(yíng)養(yǎng)和水分難以保持，pHpH值變動(dòng)幅度大值變動(dòng)幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 細(xì)胞

8、同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同細(xì)胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。 同一培養(yǎng)體系中，細(xì)胞不同步使懸浮細(xì)胞的分裂、同一培養(yǎng)體系中，細(xì)胞不同步使懸浮細(xì)胞的分裂、代謝以及生理、生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化，所以人們一直代謝以及生理、生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化，所以人們一直希望通過(guò)一定的技術(shù)途徑，使同一培養(yǎng)體系中的細(xì)胞能希望通過(guò)一定的技術(shù)途徑，使同一培養(yǎng)體系中的細(xì)胞能保持相對(duì)一致的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)狀態(tài)。保持相對(duì)一致的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)狀態(tài)。細(xì)胞的同步化培養(yǎng)細(xì)胞的同步化培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程體積選擇法：體積選擇法：用大、小孔徑篩網(wǎng)過(guò)濾、收集單細(xì)胞。

9、用大、小孔徑篩網(wǎng)過(guò)濾、收集單細(xì)胞。冷冷/低溫處理法：低溫處理法：4低溫下處理幾天使細(xì)胞同步化低溫下處理幾天使細(xì)胞同步化后，再添加新的培養(yǎng)液培養(yǎng)。后，再添加新的培養(yǎng)液培養(yǎng)。饑餓法：饑餓法：控制營(yíng)養(yǎng)液濃度，通過(guò)饑餓使細(xì)胞達(dá)到同控制營(yíng)養(yǎng)液濃度，通過(guò)饑餓使細(xì)胞達(dá)到同步化，再添加營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。步化，再添加營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。抑制法：抑制法：使用抑制劑如尿苷、使用抑制劑如尿苷、5-5-氟脫氧尿苷、秋水氟脫氧尿苷、秋水仙素等使細(xì)胞達(dá)到同步化。仙素等使細(xì)胞達(dá)到同步化。細(xì)胞工程細(xì)胞工程l無(wú)論何種細(xì)胞同步化處理，對(duì)細(xì)胞本身或多或少都無(wú)論何種細(xì)胞同步化處理，對(duì)細(xì)胞本身或多或少都有一定的傷害。有一定的傷害。l如果處理的細(xì)胞沒(méi)有

10、足夠的生活力，不僅不能獲得如果處理的細(xì)胞沒(méi)有足夠的生活力，不僅不能獲得理想的同步化效果，還可能造成細(xì)胞的大量死亡，因理想的同步化效果，還可能造成細(xì)胞的大量死亡，因此在進(jìn)行同步化處理之前，細(xì)胞必須進(jìn)行充分的活化此在進(jìn)行同步化處理之前，細(xì)胞必須進(jìn)行充分的活化培養(yǎng)。培養(yǎng)。l用于處理的細(xì)胞系最好處于用于處理的細(xì)胞系最好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞系和細(xì)胞株細(xì)胞系和細(xì)胞株 細(xì)胞系和細(xì)胞株概念細(xì)胞系和細(xì)胞株概念 原代培養(yǎng)物經(jīng)原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代首次傳代成功即稱為細(xì)胞系（成功即稱為細(xì)胞系（Cell Cell LineLine），因此細(xì)胞系可泛指一般可以傳代的細(xì)胞。），因此細(xì)胞系可泛指一般可

11、以傳代的細(xì)胞。是以一種細(xì)胞為主的、能在體外長(zhǎng)期生存的不均一是以一種細(xì)胞為主的、能在體外長(zhǎng)期生存的不均一的細(xì)胞群體。的細(xì)胞群體。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 通過(guò)通過(guò)選擇法或克隆形成法選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)細(xì)胞稱為細(xì)胞株的培養(yǎng)細(xì)胞稱為細(xì)胞株（Cell StrainCell Strain），也就是說(shuō)，細(xì)胞株是用細(xì)胞系單），也就是說(shuō)，細(xì)胞株是用細(xì)胞系單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須

12、在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。培養(yǎng)期間始終存在。細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞株篩選1、適合于工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞株必須滿足以下條件：（1）分散性好，適合大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。（2）均一性好，細(xì)胞大小、生理狀態(tài)一致。（3）生長(zhǎng)速度快 培養(yǎng)周期短 不易染菌。（4）目標(biāo)產(chǎn)物含量高，容易分離提取。（5）細(xì)胞遺傳穩(wěn)定。2、適合工業(yè)生產(chǎn)用細(xì)胞株的一般篩選流程：（自學(xué)）3、細(xì)胞株定向富集馴化4、人工誘變篩選細(xì)胞工程細(xì)胞工程 5 5、細(xì)胞株保存、細(xì)胞株保存繼代培養(yǎng)保存法 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞通過(guò)每隔12周換液進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。這種方法適合于短期保種。低溫保存法 一般選擇5-10的溫度下培養(yǎng)，每隔十天左右更換一次培養(yǎng)液。冷凍保存 包括低溫保

13、存（-20）、超低溫保存（液氮-196 ）。細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)(cell suspension culture) (1)(1)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的概念和意義細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的概念和意義u懸浮培養(yǎng)是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體懸浮培養(yǎng)是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程意義意義/ /優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)u細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；大規(guī)模培養(yǎng)；u能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞

14、的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。分化創(chuàng)造方法和條件。細(xì)胞工程細(xì)胞工程Cell suspensionPlantsArtificial seedsSecondary productsIsolation protoplastsMutation select細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞懸浮培養(yǎng)起始培養(yǎng)物的建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)起始培養(yǎng)物的建立l選擇適宜的外植體：選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉幼胚、胚軸、子葉是最常使用是最常使用的外植體。的外植體。l 選擇適宜的培養(yǎng)基：選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度較高濃度激素；必要的附加物激素；必要的附加物質(zhì)。質(zhì)。l 愈傷組織的要求：愈傷組織的要求：

15、松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程建立細(xì)胞懸浮系建立細(xì)胞懸浮系細(xì)胞工程細(xì)胞工程懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面接觸面，改善營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；，改善營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)有害物質(zhì)在局部在局部積累而對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生積累而對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換改善氣體的交換。細(xì)胞工程細(xì)胞工程懸浮培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目的增殖變化懸浮培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)

16、目的增殖變化細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)：滯后期（延遲期）滯后期（延遲期）: : 細(xì)胞很少分裂，其長(zhǎng)短與接種量、大小和細(xì)胞很少分裂，其長(zhǎng)短與接種量、大小和繼代時(shí)原種細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期有關(guān)；繼代時(shí)原種細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期有關(guān)； 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期: :細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加，增長(zhǎng)速率保持不變細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加，增長(zhǎng)速率保持不變直線生長(zhǎng)期直線生長(zhǎng)期: :細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最明顯的時(shí)期細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最明顯的時(shí)期緩慢期緩慢期: :生長(zhǎng)逐漸緩慢生長(zhǎng)逐漸緩慢, ,培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，氧氣減少；氧氣減少； 靜止靜止/ /平

17、臺(tái)期平臺(tái)期: :生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開(kāi)始死亡。至開(kāi)始死亡。衰亡期衰亡期：細(xì)胞死亡速度加快，細(xì)胞開(kāi)始快速自溶，死亡。：細(xì)胞死亡速度加快，細(xì)胞開(kāi)始快速自溶，死亡。 細(xì)胞工程細(xì)胞工程成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件：成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件： 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30305050個(gè)細(xì)胞，個(gè)細(xì)胞，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大均一

18、性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。淡黃色。 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般2 23 3天甚至更短時(shí)間便天甚至更短時(shí)間便可增加一倍?？稍黾右槐?。 細(xì)胞工程細(xì)胞工程影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素： 起始愈傷組織的質(zhì)量：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其起始愈傷組織的質(zhì)量：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎。松易

19、碎。 接種細(xì)胞密度：接種初期的細(xì)胞密度過(guò)低往往使延遲期加長(zhǎng)接種細(xì)胞密度：接種初期的細(xì)胞密度過(guò)低往往使延遲期加長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞的起始密度一般在，懸浮細(xì)胞的起始密度一般在0.50.52.52.510105 5個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞/ /毫升，毫升，低于這一密度則會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)延遲。低于這一密度則會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)延遲。 培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器自學(xué)自學(xué)生物反應(yīng)器是指用于高等生物細(xì)胞批量化培養(yǎng)的裝生物反應(yīng)器是指用于高等生物細(xì)胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

20、氣升式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器 鼓泡式反應(yīng)器鼓泡式反應(yīng)器細(xì)胞工程細(xì)胞工程 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，根據(jù)一個(gè)培養(yǎng)周期中是否添植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，根據(jù)一個(gè)培養(yǎng)周期中是否添加培養(yǎng)基，可分為加培養(yǎng)基，可分為成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)方式等。養(yǎng)方式等。 成批培養(yǎng)（成批培養(yǎng)（batch culturebatch culture）: :指在一個(gè)培養(yǎng)體積中指在一個(gè)培養(yǎng)體積中，接種細(xì)胞和添加培養(yǎng)基后，中途不添加培養(yǎng)基也，接種細(xì)胞和添加培養(yǎng)基后，中途不添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。不更換培養(yǎng)基的方式。植物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)方式植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)方式細(xì)胞工程細(xì)胞工程 連續(xù)培養(yǎng)（連續(xù)培養(yǎng)（cont

21、inuous culturecontinuous culture）: :在培養(yǎng)過(guò)程中，不斷地向在培養(yǎng)過(guò)程中，不斷地向反應(yīng)器中添加培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)反應(yīng)器中添加培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)液，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)的內(nèi)在細(xì)胞密度、產(chǎn)物濃度以及物理液，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)的內(nèi)在細(xì)胞密度、產(chǎn)物濃度以及物理狀態(tài)相對(duì)平衡的培養(yǎng)方式。狀態(tài)相對(duì)平衡的培養(yǎng)方式。 半連續(xù)培養(yǎng)（半連續(xù)培養(yǎng)（semi-continuous culturesemi-continuous culture）: :這是一種介于成這是一種介于成批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)之間的培養(yǎng)方式，其基本方法是在完成上批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)之間的

22、培養(yǎng)方式，其基本方法是在完成上述成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，只從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸述成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，只從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，保留小部分細(xì)胞懸液作為下一個(gè)培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，液，保留小部分細(xì)胞懸液作為下一個(gè)培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 植物細(xì)胞固定化需要采用固定劑，是一些多糖和多聚類植物細(xì)胞固定化需要采用固定劑，是一些多糖和多聚類化合物，常用的包括海藻酸鹽、瓊脂糖、卡拉膠等?；衔铮Ｓ玫陌êＴ逅猁}、瓊脂糖、卡拉膠等。1、海藻酸鹽、海藻酸鹽固定化固定化在在Ca2+離子等多價(jià)陽(yáng)離子的存在離子等多價(jià)陽(yáng)離子的存在下，下，海

23、藻酸鹽的羧基和海藻酸鹽的羧基和Ca2+之間之間以離子鍵形成不溶于水的海藻酸以離子鍵形成不溶于水的海藻酸鈣鈣，從而在，從而在細(xì)胞細(xì)胞表面形成凝膠表面形成凝膠。如果采用如果采用磷酸、檸檬酸、磷酸、檸檬酸、EDTA等等螯合劑處理將螯合劑處理將Ca2+離子除去，離子除去，又能使膠體又能使膠體溶解釋放出細(xì)胞。溶解釋放出細(xì)胞。無(wú)菌空氣入口無(wú)菌空氣入口玻璃瓶玻璃瓶細(xì)胞和褐藻酸鈉混合液細(xì)胞和褐藻酸鈉混合液空氣出口空氣出口形成膠體顆粒的噴射口形成膠體顆粒的噴射口隔濾板隔濾板裝有裝有CaCl2溶液溶液的燒瓶的燒瓶 植物細(xì)胞固定化方法海藻酸鹽固定化細(xì)胞步驟海藻酸鹽固定化細(xì)胞步驟細(xì)胞工程細(xì)胞工程l l常用方法：常用方

24、法：（1 1）滴入法：）滴入法：將細(xì)胞懸浮液與滅菌的含將細(xì)胞懸浮液與滅菌的含NaClNaCl的卡拉膠溶液混的卡拉膠溶液混勻，然后滴入含中勻，然后滴入含中KClKCl的培養(yǎng)基中，使其分散成小顆粒。過(guò)濾、的培養(yǎng)基中，使其分散成小顆粒。過(guò)濾、清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。（2 2）模鑄法：）模鑄法：將細(xì)胞將細(xì)胞- -卡拉膠溶液注入柱形鑄模中形成顆粒?？ɡz溶液注入柱形鑄模中形成顆粒。（3 3）兩相法：）兩相法：將細(xì)胞將細(xì)胞- -卡拉膠溶液與無(wú)菌豆油或石蠟油攪拌卡拉膠溶液與無(wú)菌豆油或石蠟油攪拌混勻，形成液滴置于冰浴中不斷攪拌，凝固成均勻顆粒，再離混勻，形成

25、液滴置于冰浴中不斷攪拌，凝固成均勻顆粒，再離心除去油相和大部分溶液。心除去油相和大部分溶液。2 2、卡拉膠固定化、卡拉膠固定化細(xì)胞工程細(xì)胞工程l l瓊脂糖瓊脂糖(Agarose)固定化：固定化：（1 1）凝塊法：）凝塊法：將細(xì)胞懸浮于滅菌的瓊脂糖中，攪拌待凝將細(xì)胞懸浮于滅菌的瓊脂糖中，攪拌待凝結(jié)包埋細(xì)胞后，將凝塊擠進(jìn)無(wú)菌金屬網(wǎng)中，使其分散成小結(jié)包埋細(xì)胞后，將凝塊擠進(jìn)無(wú)菌金屬網(wǎng)中，使其分散成小顆粒。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。顆粒。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。（2 2）模鑄法：）模鑄法：同卡拉膠法同卡拉膠法（3 3）兩相法：）兩相法：同卡拉膠法同卡拉膠法l l優(yōu)點(diǎn)：與海藻酸鹽

26、、優(yōu)點(diǎn)：與海藻酸鹽、卡拉卡拉膠等固定化方法相比，不膠等固定化方法相比，不需要其它離需要其它離子來(lái)保證膠的穩(wěn)定性。子來(lái)保證膠的穩(wěn)定性。l l不足：制得的顆粒較大、形狀不規(guī)則。不足：制得的顆粒較大、形狀不規(guī)則。3 3、瓊脂糖、瓊脂糖(Agarose)固定化固定化細(xì)胞工程細(xì)胞工程l l固定化后需要測(cè)定細(xì)胞存活率大小，方法有：固定化后需要測(cè)定細(xì)胞存活率大小，方法有：（1 1）熒光染色觀察法：）熒光染色觀察法：根據(jù)活細(xì)胞對(duì)根據(jù)活細(xì)胞對(duì)FDAFDA（二乙酸熒光素）（二乙酸熒光素）黃綠色黃綠色熒光染料能被吸收，而死細(xì)胞無(wú)法吸收原理鑒定。熒光染料能被吸收，而死細(xì)胞無(wú)法吸收原理鑒定。（2 2）呼吸強(qiáng)度測(cè)定：）呼

27、吸強(qiáng)度測(cè)定： 用氧電極法測(cè)定固定化細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度判斷存活率。用氧電極法測(cè)定固定化細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度判斷存活率。（3 3）細(xì)胞生長(zhǎng)速率的測(cè)定：）細(xì)胞生長(zhǎng)速率的測(cè)定： 通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的濕重或干重增加率反映細(xì)胞活性大小。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的濕重或干重增加率反映細(xì)胞活性大小。固定化細(xì)胞活力測(cè)定固定化細(xì)胞活力測(cè)定細(xì)胞工程細(xì)胞工程第三節(jié)第三節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物l概述概述l培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)l植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)l提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑l細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)中的有關(guān)技術(shù)問(wèn)題細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)中的有關(guān)技術(shù)問(wèn)題細(xì)胞工程細(xì)胞工程概述概述l長(zhǎng)

28、期以來(lái)，長(zhǎng)期以來(lái)，植物一直是許多化學(xué)品的主要資源植物一直是許多化學(xué)品的主要資源，特，特別在制藥和食品加工業(yè)中更是不可缺少；別在制藥和食品加工業(yè)中更是不可缺少；l據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至少有據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至少有20%20%左右的藥物是由植物衍生左右的藥物是由植物衍生而來(lái)，而且每年都有發(fā)現(xiàn)許多植物來(lái)源的新化合物。而來(lái)，而且每年都有發(fā)現(xiàn)許多植物來(lái)源的新化合物。細(xì)胞代謝產(chǎn)物分為初級(jí)代謝產(chǎn)物、次級(jí)代謝產(chǎn)物。細(xì)胞代謝產(chǎn)物分為初級(jí)代謝產(chǎn)物、次級(jí)代謝產(chǎn)物。初級(jí)代謝產(chǎn)物（初級(jí)代謝產(chǎn)物（Primary metabolitesPrimary metabolites） 是通過(guò)初級(jí)是通過(guò)初級(jí)代謝產(chǎn)生的維持細(xì)胞生命活動(dòng)必需的物質(zhì)

29、，如氨基酸、代謝產(chǎn)生的維持細(xì)胞生命活動(dòng)必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類等。核苷酸、多糖、脂類等。次級(jí)代謝產(chǎn)物（次級(jí)代謝產(chǎn)物（Secondary metabolitesSecondary metabolites）是指植物是指植物中一大類并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合中一大類并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性。期的特異性。 大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。植物次合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。植物次

30、生代謝產(chǎn)物次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱為生代謝產(chǎn)物次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱為次生代謝。次生代謝。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 不同種類的生物所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物不相不同種類的生物所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細(xì)胞內(nèi)，也可能排到外同，它們可能積累在細(xì)胞內(nèi)，也可能排到外環(huán)境中。由于次級(jí)代謝產(chǎn)物大多具有生物活環(huán)境中。由于次級(jí)代謝產(chǎn)物大多具有生物活性，因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點(diǎn)。性，因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點(diǎn)。 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 由于資源短缺和需求量增加，依靠從栽培植物由于資源短缺和需求量增加，依靠從栽培植物提取天然的次級(jí)代謝產(chǎn)物途徑很難滿足人類需求，提取天然的次級(jí)代謝產(chǎn)物途徑很難

31、滿足人類需求，而利用植物細(xì)胞生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)而利用植物細(xì)胞生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物成為最有效途徑。物成為最有效途徑。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：l l減少耕地占用，不受季節(jié)、地域限制；減少耕地占用，不受季節(jié)、地域限制；l l可以排除病菌和害蟲(chóng)的影響可以排除病菌和害蟲(chóng)的影響( (密閉無(wú)菌操作密閉無(wú)菌操作) )；l可通過(guò)選擇優(yōu)良株系和優(yōu)化培養(yǎng)條件提高代謝可通過(guò)選擇優(yōu)良株系和優(yōu)化培養(yǎng)條件提高代謝物產(chǎn)量；物產(chǎn)量；l能通過(guò)改造生物合成途徑獲得新有用物質(zhì)。能通過(guò)改造生物合成途徑獲得新有用物質(zhì)。l 植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義具有重要

32、意義 李時(shí)珍（李時(shí)珍（15931593）在本草綱目中所開(kāi)列的）在本草綱目中所開(kāi)列的18921892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約2525的的法定藥品來(lái)自植物。其藥物的有效成分均為法定藥品來(lái)自植物。其藥物的有效成分均為次生次生產(chǎn)物產(chǎn)物。 細(xì)胞工程細(xì)胞工程1 1、藥用代謝產(chǎn)物、藥用代謝產(chǎn)物 這是重要應(yīng)用領(lǐng)域，包括生物堿、萜類、苷類、酮類等。這是重要應(yīng)用領(lǐng)域，包括生物堿、萜類、苷類、酮類等。 例如，紫杉醇（例如，紫杉醇（TaxolTaxol）是從紅豆杉屬植物中分離得到的）是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種一種二萜烯類二萜烯類化合物，化合物，治療乳腺癌、肺癌、卵

33、巢癌等的藥物治療乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的藥物。通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物需求：需求：僅美國(guó)每年就有僅美國(guó)每年就有50 000名婦女患卵巢名婦女患卵巢癌，每年需約癌，每年需約24kg紫杉醇；還有約紫杉醇；還有約40 000名名婦女死于乳腺癌，年需求量將增至婦女死于乳腺癌，年需求量將增至100kg。全世界每年需要全世界每年需要500kg紫杉醇才能滿足廣大紫杉醇才能滿足廣大癌癥患者需求。癌癥患者需求。 生產(chǎn)生產(chǎn)1 kg紫杉醇需要砍伐紫杉醇需要砍伐60年生大樹(shù)年生大樹(shù)3000-4000棵棵。紫杉醇在。紫杉醇在樹(shù)皮、嫩芽中含量樹(shù)皮、嫩芽中含量

34、最高最高。若光從樹(shù)皮中提取紫杉，每年需砍伐。若光從樹(shù)皮中提取紫杉，每年需砍伐150-200萬(wàn)棵萬(wàn)棵左右的大樹(shù)。左右的大樹(shù)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程2 2、天然食品和食品添加劑、天然食品和食品添加劑 如胡蘿卜素、葉黃素、甜菊苷、辣椒素等，因?yàn)榛瘜W(xué)合成如胡蘿卜素、葉黃素、甜菊苷、辣椒素等，因?yàn)榛瘜W(xué)合成色素和甜味劑越來(lái)越受到擔(dān)心和嚴(yán)格限制。色素和甜味劑越來(lái)越受到擔(dān)心和嚴(yán)格限制。3 3、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑 如利用萬(wàn)壽菊細(xì)胞生產(chǎn)噻吩烷，香草生產(chǎn)魚(yú)藤酮?dú)⑾x(chóng)劑。如利用萬(wàn)壽菊細(xì)胞生產(chǎn)噻吩烷，香草生產(chǎn)魚(yú)藤酮?dú)⑾x(chóng)劑。4 4、飼料、精細(xì)化工等產(chǎn)品、飼料、精細(xì)化工等產(chǎn)品 如用培養(yǎng)的槡、榆等細(xì)胞，再加入大豆粉、糖、

35、淀粉等可充如用培養(yǎng)的槡、榆等細(xì)胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供應(yīng)蠶養(yǎng)殖業(yè)的飼料。足供應(yīng)蠶養(yǎng)殖業(yè)的飼料。 精細(xì)化工產(chǎn)品種類繁多（精細(xì)化工產(chǎn)品種類繁多（3636類），附加值高，具有功能性或類），附加值高，具有功能性或最終使用性。除上述醫(yī)藥、農(nóng)藥、添加劑外，還包括染料、涂最終使用性。除上述醫(yī)藥、農(nóng)藥、添加劑外，還包括染料、涂料、香精、洗滌劑、化妝品、料、香精、洗滌劑、化妝品、金屬表面處理劑、芳香消臭劑等金屬表面處理劑、芳香消臭劑等產(chǎn)品。產(chǎn)品。細(xì)胞工程細(xì)胞工程產(chǎn)品成分產(chǎn)品成分用途用途年銷售額年銷售額/ /億美元億美元長(zhǎng)春花堿（長(zhǎng)春花）長(zhǎng)春花堿（長(zhǎng)春花）治療白血病治療白血病18182020（美國(guó)）（

36、美國(guó)）阿嗎靈阿嗎靈循環(huán)系統(tǒng)障礙藥循環(huán)系統(tǒng)障礙藥5 52525（全世界）（全世界）奎寧（金雞納樹(shù)）奎寧（金雞納樹(shù)）治療瘧疾治療瘧疾5 51010（美國(guó)）（美國(guó)）致熱素致熱素殺蟲(chóng)劑殺蟲(chóng)劑2020（全世界）（全世界）毛地黃毛地黃心臟病藥心臟病藥20205555（美國(guó)）（美國(guó)）細(xì)胞工程細(xì)胞工程 植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成聚酮途徑：聚酮途徑：又稱乙酸丙二又稱乙酸丙二酸途徑，乙酰輔酶酸途徑，乙酰輔酶A A通過(guò)直通過(guò)直線式聚合生成脂肪酸和環(huán)線式聚合生成脂肪酸和環(huán)狀次級(jí)代謝產(chǎn)物。聚酮類狀次級(jí)代謝產(chǎn)物。聚酮類化合物的合成?；衔锏暮铣?。莽草酸途徑：莽草酸途徑：生物堿、類生物堿、類黃酮、

37、香豆素等產(chǎn)物。黃酮、香豆素等產(chǎn)物。甲戊二羥酸途徑：甲戊二羥酸途徑：又稱甲又稱甲瓦龍酸途徑，合成萜類、瓦龍酸途徑，合成萜類、甾體、蒽醌等產(chǎn)物。甾體、蒽醌等產(chǎn)物。細(xì)胞工程細(xì)胞工程（1）細(xì)胞株）細(xì)胞株l l植物不同部位的細(xì)胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力是不同的，植物不同部位的細(xì)胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力是不同的，所以所以在進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價(jià)值的代謝產(chǎn)物時(shí)，在進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價(jià)值的代謝產(chǎn)物時(shí)，必須必須弄清楚產(chǎn)物的合成部位弄清楚產(chǎn)物的合成部位，也就是應(yīng)該考慮到不同部位，也就是應(yīng)該考慮到不同部位來(lái)源來(lái)源細(xì)胞的特性細(xì)胞的特性。l l篩選出篩選出穩(wěn)定、高產(chǎn)、穩(wěn)定、高產(chǎn)、生長(zhǎng)速度快生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞株的細(xì)胞株

38、是細(xì)胞是細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物的前提。缺乏適合的細(xì)胞株是目大規(guī)模培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物的前提。缺乏適合的細(xì)胞株是目前許多代謝產(chǎn)物無(wú)法利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的主要限制之一。前許多代謝產(chǎn)物無(wú)法利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的主要限制之一。細(xì)胞遺傳特性細(xì)胞遺傳特性植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的影響因素植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的影響因素細(xì)胞工程細(xì)胞工程l l 次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成涉及次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成涉及多基因參與（基因多基因參與（基因簇）簇），機(jī)制非常復(fù)雜，不同于蛋白質(zhì)合成，影響因素，機(jī)制非常復(fù)雜，不同于蛋白質(zhì)合成，影響因素非常多。非常多。l l 結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行生物合成機(jī)制研究，揭示代謝結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行生物合成機(jī)制研究，揭示

39、代謝途徑及誘導(dǎo)合成機(jī)制途徑及誘導(dǎo)合成機(jī)制是細(xì)胞培養(yǎng)的重要生物學(xué)問(wèn)是細(xì)胞培養(yǎng)的重要生物學(xué)問(wèn)題，有利于指導(dǎo)建立優(yōu)化的培養(yǎng)工藝與技術(shù)。題，有利于指導(dǎo)建立優(yōu)化的培養(yǎng)工藝與技術(shù)。（2 2）生物合成機(jī)制）生物合成機(jī)制細(xì)胞工程細(xì)胞工程選擇適宜的起始材料選擇適宜的起始材料 a.a.首先必須選擇能夠首先必須選擇能夠高效合成目的產(chǎn)物高效合成目的產(chǎn)物的植物種類。的植物種類。 b.b.再此前提下，起始培養(yǎng)材料還應(yīng)考慮再此前提下，起始培養(yǎng)材料還應(yīng)考慮器官和組織特異性器官和組織特異性，通，通常選取常選取自然狀態(tài)下能夠積累次生產(chǎn)物的部位自然狀態(tài)下能夠積累次生產(chǎn)物的部位，這樣的細(xì)胞經(jīng)過(guò)，這樣的細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后常具有合成目的產(chǎn)物

40、的能力，或比較容易誘導(dǎo)合成目的培養(yǎng)后常具有合成目的產(chǎn)物的能力，或比較容易誘導(dǎo)合成目的產(chǎn)物。產(chǎn)物。 提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑細(xì)胞工程細(xì)胞工程選擇合適的培養(yǎng)基成分選擇合適的培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基的成分既有利于細(xì)胞大量生長(zhǎng)繁殖，又有利培養(yǎng)基的成分既有利于細(xì)胞大量生長(zhǎng)繁殖，又有利于次生代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生。于次生代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生。 一般來(lái)說(shuō)，增加培養(yǎng)基的一般來(lái)說(shuō)，增加培養(yǎng)基的N N，P P、K K的濃度能促進(jìn)細(xì)胞的濃度能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而適當(dāng)增加糖濃度有利于次生產(chǎn)物的合成。生長(zhǎng)，而適當(dāng)增加糖濃度有利于次生產(chǎn)物的合成。提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑細(xì)胞工程細(xì)胞工程提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑提高細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的途徑 前體（前體（precursor）的應(yīng)用）的應(yīng)用u 培養(yǎng)基中加入外源前體物質(zhì)，可使目的