實(shí)驗(yàn)二總糖和還原糖的測定

1、1實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 總糖和還原糖的測定總糖和還原糖的測定 (3 (3，5 5二硝基水楊酸法二硝基水楊酸法) ) 食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程課程2掌握掌握3，5二硝基水楊酸法測定待測二硝基水楊酸法測定待測樣品的總糖和還原糖含量的基本原理，樣品的總糖和還原糖含量的基本原理，學(xué)會處理學(xué)會處理721型或型或722型分光光度計出型分光光度計出現(xiàn)的問題現(xiàn)的問題 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定

2、是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。原糖以葡萄糖含量計）。4本實(shí)驗(yàn)是利用本實(shí)驗(yàn)是利用3，5二硝基二硝基水楊酸溶液（水楊酸溶液（DN

3、S法）與還法）與還原糖溶液共熱后被還原成棕原糖溶液共熱后被還原成棕紅色氨基化合物，在一定范紅色氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和棕紅色物圍內(nèi)還原糖的量和棕紅色物質(zhì)深淺的程度成一定比例關(guān)質(zhì)深淺的程度成一定比例關(guān)系，可用于比色測定。操作系，可用于比色測定。操作簡便，快速，雜質(zhì)干擾較少。簡便，快速，雜質(zhì)干擾較少。5三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制：準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制：準(zhǔn)確稱取100mg分分析純的無水葡萄糖（預(yù)先在析純的無水葡萄糖（預(yù)先在105干燥至恒干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到重），用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到10

4、0ml容量瓶中，再定容到刻度，搖勻。濃容量瓶中，再定容到刻度，搖勻。濃度為度為1mg/ml。6取取7支支25250mm的試管，分別按下表加入試劑：的試管，分別按下表加入試劑：管管 號號0123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.60.81.01.2相當(dāng)于葡萄糖量相當(dāng)于葡萄糖量(mg)00.20.40.60.81.01.2蒸餾水（蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.00.83,5二硝基水楊酸二硝基水楊酸(ml)1.51.51.51.51.51.51.5將各管溶液混合均勻，沸水浴加熱將各管溶液混合均勻，沸水浴加熱5min，取出后立，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向

5、每管加入即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5ml蒸餾水，蒸餾水，搖勻。于搖勻。于520nm波長處測定波長處測定OD值。以葡萄糖毫克數(shù)值。以葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。72、樣品中、樣品中總糖總糖和和還原糖還原糖含量的測定含量的測定 （1）樣品中）樣品中還原糖還原糖的提?。旱奶崛。?準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取10g新鮮材料（或新鮮材料（或2g材料干樣粉材料干樣粉末），放在末），放在100ml燒杯中，先以少量水調(diào)成糊燒杯中，先以少量水調(diào)成糊狀，然后加狀，然后加5060ml蒸餾水，于蒸餾水，于50恒溫水恒溫水浴中保溫浴中保溫20min，過

6、濾，將濾液收集在，過濾，將濾液收集在100ml容量瓶中，再定容至容量瓶中，再定容至100ml。8（2）樣品中）樣品中總糖總糖的水解提?。旱乃馓崛。?準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取10g新鮮材料（或新鮮材料（或1g材料干樣粉末），材料干樣粉末），放在錐形瓶中，加入放在錐形瓶中，加入10ml 6 molL-1 鹽酸，鹽酸，15ml水，在沸水浴中加熱水，在沸水浴中加熱30min，取出一、二滴置于，取出一、二滴置于白瓷板上，加白瓷板上，加1滴碘碘化鉀溶液檢查水解是否完滴碘碘化鉀溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。冷卻后加入全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。冷卻后加入1滴酚酞指示劑，以滴酚酞指示劑，以1

7、0%氫氧化鈉溶液中和至溶液氫氧化鈉溶液中和至溶液呈微紅色，過濾并定容到呈微紅色，過濾并定容到100ml。再精確吸取上。再精確吸取上述溶液述溶液10ml于于100ml容量瓶中，定容至刻度，混容量瓶中，定容至刻度，混勻備用。勻備用。9（3）樣品中糖含量的測定：）樣品中糖含量的測定：取取7支支25250mm試管分別按下表加入試劑：試管分別按下表加入試劑：加完試劑后，與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時加完試劑后，與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時相同的操作測定樣品糖含量。相同的操作測定樣品糖含量。10四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在在ExcelExcel繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。以表格形式

8、列出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，取樣品的以表格形式列出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，取樣品的ODOD520520平均值用標(biāo)平均值用標(biāo)準(zhǔn)線性方程求出相應(yīng)的糖量，并用下式計算出待測樣品準(zhǔn)線性方程求出相應(yīng)的糖量，并用下式計算出待測樣品中還原糖與總糖的含量。中還原糖與總糖的含量。還原糖還原糖（mgg-1）=還原糖毫克數(shù)還原糖毫克數(shù)提取液總體提取液總體積（積（ml）稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)測定用提取液體積（測定用提取液體積（ml）樣品重量（樣品重量（g）總糖（總糖（mgg-1）=樣品水解后還原糖毫克數(shù)樣品水解后還原糖毫克數(shù)提取液總體積（提取液總體積（ml）稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)測定用提取液體積（測定用提取液體積（ml）樣品重量（樣品重量（g）11五、討論

9、分析五、討論分析1、在被測樣品中，還原糖可能是些什么糖？總糖、在被測樣品中，還原糖可能是些什么糖？總糖包括哪些？包括哪些？2、用來測定總糖的樣品，為什么要加鹽酸水解？、用來測定總糖的樣品，為什么要加鹽酸水解？而在其測定前，又為何要用而在其測定前，又為何要用NaOH中和？中和？3、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度和樣品含糖量的測定為什、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度和樣品含糖量的測定為什么應(yīng)該同步進(jìn)行？比色時設(shè)么應(yīng)該同步進(jìn)行？比色時設(shè)0號管有什么意義？號管有什么意義？ 六、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)建議六、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)建議12附：儀器和試劑附：儀器和試劑主要儀器：分光光度計，水浴鍋，容量瓶，刻度試管，主要儀器：分光光度計，水浴鍋，容量瓶，刻度試管，移液管等。移液管等。3,5-二硝基水楊酸試劑：二硝基水楊酸試劑：甲液：溶解甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于結(jié)晶酚于15.2ml 10%氫氧化鈉溶液中，氫氧化鈉溶液中，并用水稀釋至并用水稀釋至69ml，在此溶液中加，在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。亞硫酸氫鈉。乙液：稱取乙液：稱取255g酒石酸鉀鈉加到酒石酸鉀鈉加到300ml 10%氫氧化鈉溶氫氧化鈉溶液中，再加入液中，再加入880ml 1% 3,5-二硝基水楊酸溶液。二硝基水楊酸溶液。 將甲乙二溶液混合