濾膜法測定總大腸菌群1

1、濾膜法測定總大腸菌群1 主題內(nèi)容與適用范圍 本方法規(guī)定了生活飲用水中總大腸菌群的濾膜測定方法。 本方法適用于生活飲用水和低濁度的水源水中總大腸菌群數(shù)的測定。 2 方法提要 用孔徑為0.45m的微孔濾膜過濾水樣，細(xì)菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù)。 3 培養(yǎng)基與試劑 3.1 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基 3.1.1 成份 A 蛋白胨 10g B 酵母浸膏 5g C 牛肉膏 5g D 乳糖 10g E 瓊脂 1520g F 硫酸氫二鉀 3.5g G 無水亞硫酸鈉 5g左右 H 堿性品紅乙醇溶液(50g/L) 20mL I 蒸餾水 1000mL 3.1

2、.2 儲存培養(yǎng)基的制備 先將瓊脂加到500mL蒸餾水中，煮沸溶解，于另500mL蒸餾水中加入硫酸氫二鉀、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，混勻后調(diào)pH為7.27.4，再加入乳糖，分裝，115高壓滅菌20min，儲存于冷暗處備用。 3.1.3 平皿培養(yǎng)基的配制 將上法制備的儲存培養(yǎng)基加熱融化，用滅菌吸管按比例吸取一定量的5堿性品紅乙醇溶液置于滅菌空試管中，再按比例稱取所需的無水硫酸鈉置于另一滅菌試管中，加滅菌水少許，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以滅菌。 用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉色為止，將此亞硫

3、酸鈉與堿性品紅的混合液全部加到已融化的儲存培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻(防止產(chǎn)生氣泡)，立即將此種培養(yǎng)基15mL傾入已滅菌的空平皿中。待冷卻凝固后置冰箱內(nèi)備用。此種以制成的培養(yǎng)基于冰箱內(nèi)保存不宜超過二周。如培養(yǎng)基已由淡粉色變?yōu)樯罴t色，則不能再用。 3.2 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基 3.2.1 成份 A 蛋白胨 10g B 牛肉膏 3g C 乳糖 5g D 氯化鈉 5g E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL F 蒸餾水 1000mL 3.2.2 制法 將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于蒸餾水中，調(diào)整pH為7.27.4，再加入1mL1.6溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，115高壓滅菌20

4、min，貯存于冷暗處備用。 4 儀器 4.1 濾器。 4.2 濾膜，孔徑0.450.65m。直經(jīng)根據(jù)濾器規(guī)格，目前常用的有3.5cm和4.7cm兩種。 4.3 抽濾設(shè)備。 4.4 無齒鑷子。 4.5 培養(yǎng)箱: 36±1。 4.6 冰箱: 04。 4.7 天平。 4.8 顯微鏡。 4.9 平皿: 直徑為9cm。 4.10 滅菌刻度吸管: 1mL,10mL。 5 檢驗(yàn)步驟 5.1 準(zhǔn)備工作 5.1.1 濾膜滅菌: 將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌三次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌23次，以除去殘留溶劑。 5.1.2 濾器滅菌: 用點(diǎn)燃的酒精棉球，火焰滅菌。也

5、可用121高壓滅菌20min。 5.2 過濾水樣 用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，帖放在已滅菌的濾床上、，固定好濾器，將100mL水浴(如水樣含菌數(shù)較多，可減少過濾水樣量，或?qū)⑺畼酉♂?注入濾器中，打開濾器閥門，在負(fù)0.5大氣壓下抽濾。 5.3 培養(yǎng) 水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基(36.1.3.1)上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2224h。 6 觀察結(jié)果 6.1 挑出符合下列特征菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。 紫紅色，具有金屬光澤的菌落。 深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。 淡紅色，中心色較深的菌落。 凡革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)基液，于37培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則判定為總大腸菌群陽性。 6.1.2