流式細(xì)胞術(shù)及其應(yīng)用課件

1、l一、一、流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（FCM）就是對(duì)在高速流動(dòng)的鞘液包括下的細(xì)胞、粒子進(jìn)行分析和分選的技術(shù)，這種細(xì)胞或粒子是經(jīng)過(guò)特異熒光標(biāo)記的。其特點(diǎn)是測(cè)量速度快，每秒鐘能測(cè)數(shù)千個(gè)乃至上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，且可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，另一特點(diǎn)是在分析的同時(shí)可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來(lái)，這就是分選技術(shù)。 FCM(Flow Cytomytry 流式細(xì)胞術(shù)) FCM(Flow Cytomyter 流式細(xì)胞儀) 二、流式細(xì)胞儀的工作原理 待測(cè)細(xì)胞被制成單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在清潔氣體的壓力下進(jìn)入流動(dòng)室。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，鞘液的作用有二：一是約束樣品使之在噴嘴中

2、心以提高測(cè)量精度；二是防止樣品靠近噴孔壁以避免堵塞噴孔。在這種約束作用下，細(xì)胞排成單列一個(gè)跟隨一個(gè)地在鞘液包括下由流動(dòng)室下面的噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。液柱與入射的高度聚焦的激光束相交，此時(shí)，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光。在與入射激光和液柱都垂直的方向設(shè)置有熒光測(cè)量系統(tǒng)，包括透鏡、光闌、濾片、檢測(cè)器等，將細(xì)胞的熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，用專用軟件進(jìn)行分析。美國(guó)B-D公司型號(hào)：FACSCalibur, 單激光配制操作系統(tǒng)：Mac OS8.51999年3月購(gòu)置 1 前向角散射（FSC）：前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說(shuō)，同一個(gè)細(xì)胞群體，F(xiàn)SC強(qiáng)的，其細(xì)胞大一些，而FS

3、C弱的，其細(xì)胞小一些。 2 側(cè)向角散射（SSC）：側(cè)向角散射又稱90散射或大角散射。側(cè)向角散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，對(duì)胞內(nèi)較大的顆粒也會(huì)有反應(yīng)。所以，側(cè)向角散射光的強(qiáng)弱可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒的性質(zhì)。 3 熒光強(qiáng)度（FL）：是細(xì)胞或細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長(zhǎng)不同。通過(guò)熒光強(qiáng)度可將同一個(gè)細(xì)胞群體中的有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無(wú)熒光標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)分開來(lái)，也就是我們通常所說(shuō)的陽(yáng)性細(xì)胞，也可以將陽(yáng)性細(xì)胞中的高FL的細(xì)胞與低FL的細(xì)胞區(qū)分開來(lái)，也就是可以把強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞和弱陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測(cè)出三個(gè)FL，即

4、FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有三個(gè)激光光源（488nm、633nm和407nm），可測(cè)出13個(gè)FL。1細(xì)胞細(xì)胞DNA含量檢測(cè)：含量檢測(cè)： 細(xì)胞固定后用PI染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個(gè)原理，并通過(guò)專用的DNA分析軟件，可測(cè)出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測(cè)。 l腫瘤診斷：l DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個(gè)重要標(biāo)志，細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征。因此，臨床上可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測(cè)癌前病變、腫瘤的早期診斷、交界性腫瘤診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷等各方

5、面。 腫瘤預(yù)后估計(jì)： 異倍體腫瘤惡性度、復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率都較二倍體腫瘤高。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺、結(jié)腸、直腸、前列腺和膀胱腫瘤中，異倍體和較高的S期百分比都是不良預(yù)后的標(biāo)志。同樣的，在肺癌、頭頸部腫瘤、卵巢癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有類似發(fā)現(xiàn)。因此在病理組織學(xué)分級(jí)、臨床分期等指標(biāo)基礎(chǔ)上，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤DNA倍體能更客觀地預(yù)測(cè)預(yù)后。l凋亡：l 由于凋亡細(xì)胞核酸內(nèi)切酶活化，DNA降解，細(xì)胞DNA減少，因而可在G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，也就是凋亡峰。檢測(cè)調(diào)亡，可進(jìn)行抗腫瘤藥物研究和某些因素對(duì)細(xì)胞的損傷機(jī)理的研究。l 細(xì)胞表型的分析得益于單克隆抗體的產(chǎn)生及發(fā)展，現(xiàn)在

6、CD系統(tǒng)已有247種之多。細(xì)胞用帶有熒光的單克隆抗體標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析，可分析出熒光細(xì)胞的含量，也可分析出這種陽(yáng)性細(xì)胞的CD分子的相對(duì)含量。標(biāo)記的方法一般用直標(biāo)法，也可用間標(biāo)法。熒光探針多為FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、APC等。 淋巴細(xì)胞分類：l CD3(T細(xì)胞，CD4、CD8)、CD19（B細(xì)胞）、CD16、CD56（NK細(xì)胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測(cè)等。 造血干/祖細(xì)胞計(jì)數(shù)l 造血干/祖細(xì)胞存在于骨髓和外周血中，形態(tài)與淋巴細(xì)胞相似，用普通形態(tài)學(xué)方法難以識(shí)別。由于造血干/祖細(xì)胞表

7、面可表達(dá)CD34和CD45抗原且具有很高的核酸含量，因而用CD34和CD45單克隆抗體和核酸染料進(jìn)行三色熒光標(biāo)記，F(xiàn)CM多參數(shù)分析血液、骨髓和濃縮白細(xì)胞懸液中造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)臨床血液病、惡性腫瘤、基因異常等疾病的造血干/祖細(xì)胞移植治療有十分重要的意義。 白血病的免疫分型 流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型時(shí)，測(cè)量細(xì)胞數(shù)一般在1000050000細(xì)胞之間，而且快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對(duì)白血病

8、的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研究等有重要價(jià)值。l 利用FCM可快速檢測(cè)白血病細(xì)胞所表達(dá)的分化抗原，并可做多色標(biāo)記分析，從而可對(duì)白血病細(xì)胞作多參數(shù)多抗原分析，使一些形態(tài)學(xué)檢測(cè)上難以解決的問(wèn)題迎刃而解。l 例如造血干細(xì)胞表達(dá)CD34，髓系表達(dá)CD13、CD14，B細(xì)胞系表達(dá)CD10、CD19、CD20等，T細(xì)胞系表達(dá)CD2、CD3、CD5、CD7，可以測(cè)定出血球細(xì)胞表達(dá)各種抗原的情形，協(xié)助臨床鑒別診斷。l新建細(xì)胞系l 新建立的細(xì)胞系，進(jìn)行系列的表型分析，以確定此細(xì)胞系的表型。l已有細(xì)胞系的表型分析l 對(duì)于已知細(xì)胞系，由于多次傳代和培養(yǎng)條件的改變，細(xì)胞遺傳信息可能會(huì)發(fā)生突變，對(duì)其進(jìn)

9、行表型分析，以檢測(cè)該細(xì)胞系是否有變異。 原理 血小板是由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生的無(wú)核細(xì)胞，正常靜止?fàn)顟B(tài)呈兩面微凸的圓盤狀，平均直徑23m。活化的血小板呈不規(guī)則形狀，表面有大量星狀突起，彼此間常發(fā)生粘附、聚集。血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮功能的分子基礎(chǔ)。l 靜止與活化血小板膜糖蛋白分子的種類、含量、結(jié)構(gòu)、功能等顯著不同，一些血小板糖蛋白的分子缺陷常導(dǎo)致血小板止血功能的異常，某些糖蛋白分子在血小板膜上高表達(dá)又是血小板被活化的特異性分子標(biāo)志。當(dāng)血小板表面結(jié)合有自身抗體時(shí)常導(dǎo)致血小板減少。血小板的上述變化，通過(guò)用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，可以敏感、特異、快速的診斷血小板病。l血小板

10、檢測(cè)指標(biāo)：l質(zhì)膜糖蛋白：CD41/CD61（gpb/a）、l CD42b(GPb/)l顆粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。l活化：gpb/a復(fù)合物活化早期標(biāo)志物l CD62P活化后期的表面標(biāo)志l血小板抗體（PAIgG）。l網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)：常用染料為TO。 應(yīng)用 血小板無(wú)力癥診斷： CD41/CD61缺失或異常 巨大血小板綜合征診斷： CD42a/CD42b缺失 免疫性血小板減少性紫癜診斷： PAIgG 血栓前狀態(tài)與血栓性疾病診斷： 血小板活化異常 網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與應(yīng)用l 網(wǎng)織紅細(xì)胞是未完全成熟的紅細(xì)胞，胞漿中仍殘留有不同含量的RNA。RNA含量越高，網(wǎng)織紅細(xì)胞越幼稚，反之，則接近于成熟

11、紅細(xì)胞。網(wǎng)織紅細(xì)胞是反映骨髓紅系造血的指針。用熒光染料噻唑橙(Thiazole Orange，TO)可使活體網(wǎng)織紅細(xì)胞中RNA染色，用488nm激光激發(fā)后發(fā)射綠色熒光，F(xiàn)CM分析其熒光強(qiáng)度的大小可測(cè)量網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)量和RNA含量。主要用于貧血篩查。l 睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)的診斷 l 紅細(xì)胞表面CD59缺失l 細(xì)胞破膜后將細(xì)胞內(nèi)某一蛋白成分進(jìn)行熒光標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量分析，同表型分析一樣，可以測(cè)量出這種陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和這種蛋白的相對(duì)含量。并且，結(jié)合細(xì)胞表型分析，進(jìn)行多標(biāo)記和多參數(shù)分析，可以檢測(cè)出含這種蛋白的細(xì)胞是屬于哪一種表型的細(xì)胞。多用間標(biāo)法，熒光探針多為FITC。也可以與周期分

12、析結(jié)合起來(lái)，分別分析蛋白陽(yáng)性和蛋白陰性細(xì)胞的細(xì)胞周期，這在研究功能蛋白對(duì)周期的調(diào)控作用是非常有用的工具。 為最新發(fā)展起來(lái)的用于檢測(cè)可溶性蛋白的流式細(xì)胞技術(shù)(CBA)，是將待檢蛋白吸附到微球上，再與熒光探針結(jié)合，測(cè)定微球上這種蛋白的熒光強(qiáng)度，與已知微球的熒光強(qiáng)度相比較，求出待測(cè)蛋白的含量，分析軟件可自動(dòng)給出相關(guān)方程。l 用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來(lái)，可用于分選的效率較高的儀器國(guó)內(nèi)較少，臺(tái)式機(jī)一般分選速度為每少鐘300個(gè)細(xì)胞，而大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并可做到點(diǎn)對(duì)點(diǎn)分選。但分選速度也與細(xì)胞中目的細(xì)胞的百分率及細(xì)胞懸液的密度有關(guān)。 FCM的應(yīng)用，概括成一句話就是 凡是能被熒光

13、素標(biāo)記的且這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)的細(xì)胞或顆粒，都可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在生物檢測(cè)技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不在生物檢測(cè)技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)多用的儀器?？啥嗟玫囊粰C(jī)多用的儀器。 縱觀歷史，幾乎沒(méi)有哪一門科學(xué)技術(shù)象流式細(xì)胞術(shù)這樣凝結(jié)了眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科研領(lǐng)域的科學(xué)家的心血。從流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)明、改進(jìn)，流式細(xì)胞儀的研制、革新，到今天的眾多應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，每一步都是諸如生物學(xué)、生物技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、電子工程學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、高等數(shù)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)和物理學(xué)等學(xué)科知識(shí)綜合運(yùn)用的結(jié)晶。 而現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)，更是由于結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)、定量細(xì)胞化學(xué)和定量熒光

14、細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用，使其在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等眾多研究領(lǐng)域的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛。l 熒光素和抗體的選擇l 熒光素的選擇：現(xiàn)在國(guó)內(nèi)引進(jìn)的大多數(shù)流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源，即488nm光源，所以我們?cè)谶x擇熒光素時(shí)要選擇能被488nm激光激發(fā)的熒光素，常用的熒光素有：l測(cè)細(xì)胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。l測(cè)細(xì)胞蛋白、抗體或抗原：FITC、PE、Per-CP、 PE-CY5、PerCP-CY5.5。l測(cè)細(xì)胞膜電位：Rh-123。l測(cè)鈣離子：Fluo-3。l抗體的選擇：l 一定要選擇商業(yè)化的流式用單克隆抗體，此類抗體在制備過(guò)程中有嚴(yán)格的質(zhì)控，非特異熒光弱。最好用直標(biāo)抗體，如果是用間標(biāo)抗體，

15、二抗的選擇更應(yīng)嚴(yán)格。 l 評(píng)價(jià)一個(gè)樣品制備的優(yōu)劣，可有三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，即細(xì)胞的密度，不能低于1106/ml ； 非特異熒光，不超過(guò)1；細(xì)胞碎片和聚集體，不能出現(xiàn)肉眼可見的團(tuán)塊。l 流式細(xì)胞儀對(duì)一個(gè)樣品提供的結(jié)果是否可信，雖然與儀器操作者的水平有很大關(guān)系，但在很大程度上取決于樣品制備的優(yōu)劣。細(xì)胞密度太低，影響測(cè)試速度并造成測(cè)試參數(shù)調(diào)整的困難，尤其是在做DNA分析時(shí)，由于細(xì)胞太少，勢(shì)必要提高樣品的流速，人為地增大了G0/G1期的CV值，影響了結(jié)果的可靠性；非特異熒光強(qiáng)，則造成樣品結(jié)果的假陽(yáng)性；聚集體增多，尤其是肉眼可見的細(xì)胞聚集體，可造成流式細(xì)胞儀進(jìn)樣針的阻塞，影響儀器的性能，碎片可干擾測(cè)試結(jié)果，造

16、成結(jié)果分析的困難。 流式樣品制備過(guò)程中常見的問(wèn)題及解決對(duì)策 常見問(wèn)題原 因解決對(duì)策細(xì)胞密度低制備過(guò)程中細(xì)胞損失增加離心時(shí)間、吸棄上清非特異熒光強(qiáng)抗體不純、死亡細(xì)胞多選擇純度高的抗體、用同型對(duì)照抗體或雙標(biāo)記排除非特異熒光碎片多細(xì)胞死亡、機(jī)械損傷在細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)測(cè)試、避免反復(fù)吹打細(xì)胞聚集消化不完全、酒精固定造成的細(xì)胞粘連徹底消化、在用酒精固定細(xì)胞時(shí)加入終濃度為1.5-3的小牛血清熒光弱靈敏度不夠、抗體加入量不飽和、反應(yīng)時(shí)間短改用生物素-親和素、增加抗體用量、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間測(cè)不出亞二倍體峰凋亡測(cè)試方法選擇不當(dāng)改用原位末端標(biāo)記或Annexin-V和PI雙標(biāo)記法 樣品對(duì)照l(shuí) 細(xì)胞的熒光有自發(fā)熒光、非特

17、異熒光和特異熒光，并且流式細(xì)胞術(shù)提供的陽(yáng)性細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度都是相對(duì)陰性細(xì)胞而言的，所以在樣品制備中樣品對(duì)照的設(shè)置至關(guān)重要。在測(cè)DNA時(shí)，要設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，即不做任何干預(yù)的細(xì)胞對(duì)照。在檢測(cè)細(xì)胞膜CD分子和細(xì)胞內(nèi)蛋白或細(xì)胞因子時(shí)，要設(shè)同型抗體對(duì)照，如果是雙標(biāo)記或三標(biāo)記檢測(cè)，還要設(shè)單標(biāo)記的陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞細(xì)胞DNA分析分析： 用本法可測(cè)定細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體和凋亡，在樣品制備中存在的問(wèn)題主要是細(xì)胞的聚集和碎片，建議在固定細(xì)胞時(shí)加入1.5%-3%小牛血清。 培養(yǎng)的細(xì)胞系、體液中分離的有核細(xì)胞或分離的組織細(xì)胞約1106，離心沉淀后用0.3ml 含5%-10%小牛血清的PBS懸浮，移入預(yù)先加有0.7ml無(wú)

18、水乙醇的EP管中，置-20固定細(xì)胞24小時(shí)以上（用本法制備的細(xì)胞可在-20保存一周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間）。在分析腫瘤細(xì)胞的倍體時(shí)，要同時(shí)加入PBMC作為內(nèi)參，PBMC與腫瘤細(xì)胞的比例為1:2）。 3000rpm離心細(xì)胞1分鐘，吸棄上清，用1ml PBS重懸細(xì)胞，再離心洗滌細(xì)胞一次，吸棄上清，沉淀細(xì)胞用100l 1mg/ml RNase A懸浮，3730min以消化RNA，再加入400l 50g/ml PI，置暗處10min后上機(jī)檢測(cè)。 結(jié)果分析：流式報(bào)告中可給出G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞的百分比、凋亡百分比和細(xì)胞倍體。GFP/DNA雙參數(shù)分析 在分析轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白（GFP）的細(xì)胞的細(xì)胞周期

19、時(shí)，用GFP/DNA雙標(biāo)記法分析GFP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞周期，以觀察基因表達(dá)蛋白對(duì)細(xì)胞周期的影響，是目前最好的技術(shù)方法。 方法為先用0.5%多聚甲醛預(yù)固定細(xì)胞30-60分鐘，以保護(hù)GFP，防止其熒光的卒滅，再用70%乙醇固定。流式報(bào)告中可給出GFP陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的細(xì)胞周期、GFP的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)量。l 在分析胞內(nèi)（胞漿或胞核）蛋白與細(xì)胞周期的關(guān)系時(shí)，也可用間接免疫螢光法先標(biāo)記胞內(nèi)蛋白，再用PI標(biāo)記DNA。這種樣品需要先用乙醇固定細(xì)胞，用破膜劑打孔，以便抗體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶蛋白結(jié)合，再用螢光二抗標(biāo)記細(xì)胞。最后加入PI，上流式測(cè)試，分析方法與前述方法一樣。細(xì)胞表面細(xì)胞表面CD分子檢測(cè)分子檢測(cè)（

20、以小鼠脾細(xì)胞CD3、CD4、CD8為例）：l 小鼠脾臟用注射器芯輕輕研磨，過(guò)200目濾網(wǎng)，將細(xì)胞濾于含5%小牛血清的PBS中，吸取0.1ml（約1106）置離心管中，加入CD3-PE-CY5、CD4-FITC及CD8-PE抗體（加入量參照供應(yīng)商的推薦量，一般抗體的加入量為1g /1106/0.1ml ），室溫30min。l 加入細(xì)胞裂解液2ml 室溫裂解RBC 15min，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，吸棄上清，沉淀用0.5ml PBS懸浮，上機(jī)檢測(cè)；也可用2%多聚甲醛固定，4避光可保存至少24小時(shí)。用CD3設(shè)門法分析，流式報(bào)告中可給出CD3陽(yáng)性細(xì)胞中CD4和CD8陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和熒光強(qiáng)度。通過(guò)流式

21、報(bào)告計(jì)算出CD4與CD8的比值。l 注意兩點(diǎn)：建議使用流式專用的RBC裂解液。離心后上清一定要吸，不能倒，離心速度控制在3000rpm左右，1分鐘即可。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定：細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定：l 用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子是當(dāng)前流式細(xì)胞術(shù)中一種較新的技術(shù)。在免疫反應(yīng)中，細(xì)胞因子擔(dān)當(dāng)了重要的角色。幾乎所有的細(xì)胞因子均可由各種不同類型的細(xì)胞在體外產(chǎn)生。但利用生物測(cè)定技術(shù)、酶標(biāo)法或PCR技術(shù)不能回答某一特定的細(xì)胞因子在體內(nèi)究竟是由哪種細(xì)胞產(chǎn)生的，即使將細(xì)胞分離制備出來(lái)，由于存在污染其它細(xì)胞的可能性，結(jié)果仍然缺乏可靠性。l l 理想的測(cè)定技術(shù)應(yīng)使細(xì)胞因子的檢測(cè)能在可區(qū)分其表型的單細(xì)胞中進(jìn)行，胞內(nèi)細(xì)

22、胞因子染色和流式細(xì)胞術(shù)則可滿足這些要求。即流式細(xì)胞術(shù)可同時(shí)回答某種細(xì)胞因子是來(lái)源于哪種細(xì)胞表型陽(yáng)性的細(xì)胞。l 樣品制備：體外刺激誘導(dǎo)細(xì)胞使其產(chǎn)生細(xì)胞因子；刺激同時(shí)加入Monensin（莫能菌素）以中斷胞內(nèi)細(xì)胞因子的運(yùn)輸，使新合成的細(xì)胞因子聚積在高爾基體。固定細(xì)胞；加入打孔劑使在細(xì)胞膜上造成許多小孔（打孔），從而使大分子的細(xì)胞因子抗體能透過(guò)膜；熒光標(biāo)記。l 常用打孔劑有Saponin、Triton-X 100。 4. 胞內(nèi)蛋白的測(cè)定 收集細(xì)胞（如果是含有紅細(xì)胞的有核細(xì)胞，則用裂解液去除紅細(xì)胞），用含510%的牛血清PBS懸浮，終濃度為70的乙醇固定，固定后洗去酒精，沉淀細(xì)胞用0.2 Triton

23、-x 100破膜15min，加入一抗（一定要加飽和量）室溫30分鐘，離心洗滌兩次，洗去未結(jié)合的一抗，再加入二抗，室溫30min，洗滌二次，重懸于0.5m l PBS中上機(jī)測(cè)試。要設(shè)不加一抗但要加同型抗體的陰性對(duì)照。也可以不必固定。用這種方法可測(cè)周期蛋白、凋亡蛋白、基因表達(dá)產(chǎn)物等。5.線粒體跨膜電位測(cè)定：線粒體跨膜電位測(cè)定： Rh-123是線粒體的特異性染料，細(xì)胞被染料染色后，可測(cè)出細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱與線粒體跨膜電位的高低有關(guān)，可間接反映出細(xì)胞的功能。其方法如下： 取1106細(xì)胞用PBS洗一次，再用1ml PBS懸浮，加入2.5mM Rh-123 2l，使其終濃度為5M，室溫作用3

24、0min，作用畢，用PBS洗細(xì)胞二次，0.5ml PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)測(cè)試。由于凋亡和死亡細(xì)胞線粒體受損，熒光較弱，而功能正常的細(xì)胞熒光較強(qiáng)。在流式報(bào)告中的直方圖中可出現(xiàn)兩個(gè)峰或一個(gè)峰。 Rh-123的另一個(gè)用途是用于研究腫瘤細(xì)胞的耐藥。6.細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定以RPMI1640培養(yǎng)基配成濃度大約為1106/ml的細(xì)胞懸液，每ml細(xì)胞懸液中加入終濃度為15mol/ml Fluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hanks平衡鹽溶液（含10mmol/L HEPES，pH7.4)洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。報(bào)告中可給出樣品的熒光強(qiáng)度

25、。再根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度計(jì)算公式： Ca2+=Kd(FFmin)/(FmaxF)Kd為所用染料與Ca2+的解離常數(shù)：Kd (Fluo-3): 400nmol/L, Fmax為細(xì)胞內(nèi)Ca2+飽和時(shí)所測(cè)得的熒光強(qiáng)度， Fmin為Fluo-3未與Ca2+結(jié)合時(shí)所測(cè)得的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為樣品的熒光強(qiáng)度。7. 網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)取肝素化靜脈血2.5l，加入0.5ml Retic-COUNT試劑中，同時(shí)設(shè)PBS的陰性對(duì)照，室溫30分鐘后上流式細(xì)胞儀測(cè)試，報(bào)告中會(huì)給出網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度。樣品的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比為陽(yáng)性管與陰性管的百分比之差。l8. 活性氧物質(zhì)(ROS) 的測(cè)定

26、l 2 ,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA) 是一種非熒光性小分子探針，可擴(kuò)散到細(xì)胞中并去酯化，通過(guò)氧化作用轉(zhuǎn)變成高熒光性的2 , 7-二氯熒光素（DCF)，因此可用于定量胞內(nèi)ROS。將細(xì)胞孵育于5mol/ L 的DCFH-DA/ PBS溶液中，37 保溫15 min ，F(xiàn)CM檢測(cè)。DCF螢光的強(qiáng)弱則反映了細(xì)胞ROS 的高低。1.細(xì)胞表型分析 雙色分析：FITC與PE 三色分析：雙色分析+PE-CY5或 PerCP-CY5.5。 四色分析：三色分析+APC或CY5。2.胞內(nèi)蛋白與周期的關(guān)系分析 蛋白標(biāo)記：FITC或GFP，DNA標(biāo)記：PI3.凋亡與壞死分析： 凋亡用Annexin V-F

27、ITC，壞死用PI，或細(xì)胞標(biāo)志物用FITC，凋亡用Annexin-PE，壞死用7-AAD。l流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。l幾個(gè)概念：l%Gated：陽(yáng)性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。lMean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測(cè)物質(zhì)的含量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一般用該值。lGeo Mean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽(yáng)性細(xì)胞為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。Date acquired: 12-Apr-05File: BM normal 1M.001DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 77.99 % at 47.06 Dip G2

28、-M: 3.81 % at 94.13 Dip S: 18.20 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 4.61流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期Date acquired: 08-Mar-05File: NCDIPLOID: 25.29 % Dip G0-G1: 77.58 % at 38.10 Dip G2-M: 5.43 % at 76.20 Dip S: 16.99 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 3.99ANEUPLOID 1: 74.71 % An1 G0-G1: 81.84 % at 45.11 An1 G2-M: 3.70 % at 89.44 An1 S: 14.4

29、5 % G2/G1: 1.98 An1 %CV: 4.83 An1 DI: 1.18Total S-Phase: 15.09 %Date acquired: 15-Mar-05File: BEP2 D 4Gy 12hDIPLOID: 50.99 % Dip G0-G1: 45.50 % at 42.39 Dip G2-M: 1.71 % at 84.77 Dip S: 52.78 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 4.21ANEUPLOID 1: 49.01 % An1 G0-G1: 79.67 % at 82.26 An1 G2-M: 8.67 % at 158.09 An1 S

30、: 11.67 % G2/G1: 1.92 An1 %CV: 3.64 An1 DI: 1.94Total S-Phase: 32.63 %Date acquired: 19-Apr-05File: 7402 0uMDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 65.70 % at 50.33 Dip G2-M: 8.37 % at 96.54 Dip S: 25.93 % G2/G1: 1.92 Dip %CV: 4.51Apoptosis: 0.09 % Mean: 27.06Date acquired: 19-Apr-05File: 7402 40uMDIPLOID: 100

31、.00 % Dip G0-G1: 42.73 % at 49.76 Dip G2-M: 33.15 % at 98.17 Dip S: 24.12 % G2/G1: 1.97 Dip %CV: 4.22Apoptosis: 35.07 % Mean: 33.48PI單染法測(cè)細(xì)胞凋亡（亞二倍體峰）EGFP+EGFP-totalR2R3File: S COS7 +0Acquisition Date: 19-Apr-05RegionEvents% Gated Y Mean Y Geo MeanR1250899100.005.851.82R278053.11136.0245.92R324312196.

32、901.671.64G0-G1: 25.42 % G2-M: 48.02 % S: 26.56 % G0-G1: 48.78 % G2-M: 9.72 % S: 41.50 % G0-G1: 47.86 % G2-M: 10.77 % S: 41.37 % EGFP/DNA雙參數(shù)分析基因表達(dá)蛋白對(duì)細(xì)胞周期的影響EGFP+DG0/G1:90.9% G2/M:0.4% S: 8.7%EGFP-G0/G1:68.0% G2/M:4.2% S: 27.8%EtotalG0/G1:72.9% G2/M:2.7% S: 24.4%F圖圖p21/WAF1/CIP1-EGFP-EGFP對(duì)對(duì)293細(xì)胞細(xì)胞周期的影響細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 G0/G1:72.1% G2/M:3.1% S:24.8%EGFP+AEGFP-G0/G1:68.8% G2/M:3.0% S:28.2%BtotalG0/G1:70.0% G2/M:3.1% S:26.9%CR2File: 0d controlAcquisition Date: 04-Mar-03RegionEvents% G