生化-研究生實(shí)驗(yàn)3 重組質(zhì)粒DNA提取及雙酶切鑒定ppt課件

1、2019級(jí)研究生級(jí)研究生分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)銀銀 巍巍生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆召|(zhì)粒提純的原理和方法掌握質(zhì)粒提純的原理和方法; ;掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學(xué)掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學(xué)會(huì)運(yùn)用內(nèi)切酶會(huì)運(yùn)用內(nèi)切酶. . 預(yù)習(xí)：基因克隆示意圖 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)目的基因宿主細(xì)胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞陽性克隆株繁殖表達(dá)基因克隆操作過程：基因克隆操作過程： 分分分離載體和目的基因分離載體和目的基因 切切限制酶切載體與目的基因限制酶切載體與目的基因接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組

2、體篩選重組體 基因載體gene vector）78一一.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的制備的制備1 關(guān)于質(zhì)粒的概念關(guān)于質(zhì)粒的概念a.什么是質(zhì)粒什么是質(zhì)粒plasmid）？）？b.質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？c.質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？c.質(zhì)粒有哪些特點(diǎn)？質(zhì)粒有哪些特點(diǎn)？d.質(zhì)粒的用途有哪些？質(zhì)粒的用途有哪些？9(1)(1)質(zhì)粒的定義質(zhì)粒的定義 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌體內(nèi)、獨(dú)立于染色質(zhì)粒是存在于細(xì)菌體內(nèi)、獨(dú)立于染色體的、可以自主復(fù)制的一類雙鏈環(huán)狀體的、可以自主復(fù)制的一類雙鏈環(huán)狀DNADNA，在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋(supercoil)(supercoil)形

3、式存在。形式存在。 10 超螺旋超螺旋DNA(SC DNA)DNA(SC DNA)(2)(2)質(zhì)粒的三種構(gòu)型質(zhì)粒的三種構(gòu)型11 開環(huán)DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。12 線狀線狀DNA(linear DNA,L DNA):DNA(linear DNA,L DNA): 如果兩條鏈均斷開，即為線狀如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNADNA。電泳時(shí)，三者泳動(dòng)速度大小關(guān)系（？）電泳時(shí)，三者泳動(dòng)速度大小關(guān)系（？） 13(3)(3)質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的一般特性：的一般特性： 質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生

4、型遺傳因子質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子, ,有相對(duì)有相對(duì)獨(dú)立性。獨(dú)立性。 它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞一些表型。一些表型。 它是雙鏈閉合環(huán)狀它是雙鏈閉合環(huán)狀DNADNA，分子量大小不等。，分子量大小不等。14(4)(4)提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNADNA的目的與意義（？）的目的與意義（？） 基因載體基因載體/ /基因克隆基因克隆/ /基因工程基因工程2 提取質(zhì)粒DNA的常規(guī)方法:2.1 核酸分離純化的總原則： 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整 排除其他分子的污染蛋白質(zhì)、脂類、 糖、有機(jī)溶劑、金屬離子、其他DNA、RNA等）3.2 3.2 分離純化質(zhì)粒分離純化質(zhì)粒DNA D

5、NA 的主要步驟的主要步驟培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增DNA的擴(kuò)增與選擇）的擴(kuò)增與選擇）細(xì)菌的收集與裂解細(xì)菌的收集與裂解 搜集搜集高速離心的方法高速離心的方法質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的純化的純化 所有純化方法都是利用了質(zhì)粒所有純化方法都是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀的性質(zhì)。狀的性質(zhì)。3. SDS-3. SDS-堿裂解法提取質(zhì)粒堿裂解法提取質(zhì)粒DNADNA3.1 3.1 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：在有在有EDTAEDTA及去污劑及去污劑SDSSDS存在的條件存在的條件下，用堿處理細(xì)菌，可以使細(xì)菌的細(xì)胞下，用堿處理細(xì)菌，可以使細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物染色體壁破裂，釋

6、放出細(xì)胞內(nèi)容物染色體DNADNA、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA、蛋白質(zhì)和、蛋白質(zhì)和RNARNA等）；處理過程等）；處理過程中，染色體中，染色體DNADNA斷裂成不同長(zhǎng)度的雙鏈斷裂成不同長(zhǎng)度的雙鏈DNADNA。17強(qiáng)堿環(huán)境pH12.0-12.6時(shí)：宿主菌的線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質(zhì)粒DNA共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；當(dāng)加入高濃度酸性鹽，pH值恢復(fù)至中性時(shí)：變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物；而質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，能溶解在上清液中，這樣通過離心可以把染色體DNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起除去。18如果要提高DNA的純度，則可以用R

7、NA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)。19溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTA、TrisCl組成組成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的減少抽提過程中的 機(jī)械機(jī)械 剪切作用剪切作用,防止破壞質(zhì)粒防止破壞質(zhì)粒.(保護(hù)作用保護(hù)作用) EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止防止DNA酶對(duì)酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用）質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用） TrisCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍緩沖作用范圍緩沖作用）20 溶液溶液II：由：由SDS十二烷基硫酸鈉與十二烷

8、基硫酸鈉與NaOH組成組成 SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之 變性裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）變性裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用） NaOHPH12的作用是破壞氫鍵，使的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性分子變性DNA變性作用）變性作用） 21溶液溶液IIIIII：HACHAC和和KACKAC組成的高鹽溶液組成的高鹽溶液( (復(fù)性作用復(fù)性作用) )HACHAC溶液能中和溶液溶液能中和溶液的堿性，使染色體的堿性，使染色體DNA DNA 變性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒變性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNADNA復(fù)性。復(fù)性。KACKAC會(huì)與會(huì)與SDSSDS溶解度很低的鹽，并

9、與蛋白質(zhì)形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成 沉淀而除去；溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也會(huì)與蛋白質(zhì)也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS-SDS 復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNADNA分離。分離。 實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)步步驟驟及及注注意意事事項(xiàng)項(xiàng)加加1.5ml培養(yǎng)物于培養(yǎng)物于EP管，管，12000rpm30S 除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的100 l溶液溶液I，顛倒，顛倒EP管，混勻管，混勻 加入加入200l溶液溶液II，溫和混勻，冰浴，溫和混勻，冰浴35min 加入加入150l冰溶液冰溶液III，溫和混勻，冰浴，溫和混勻，冰浴35min，12000rpm5min 轉(zhuǎn)移

10、上清到新轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚，管，加入等體積酚，12000rpm5min 轉(zhuǎn)移上清到新轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積氯仿管，加入等體積氯仿/異戊醇，異戊醇，12000rpm5min 上層水相轉(zhuǎn)移到新上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入管，加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，倍體積無水乙醇，顛倒混勻，-20 冰箱中放置冰箱中放置20min，120005min 棄上清，沉淀中加棄上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室溫靜置去上清，管平放室溫靜置1015min ， 20 l TE 溶解溶解DNA 本卷須知：本卷須知： 1、加樣槍正確使用；、加樣槍正確使用；

11、 2、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類型、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類型pUC119-U6 ）；）； 3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要換槍頭；、加不同溶液要換槍頭； 5、離心前把管擦干；、離心前把管擦干； 6、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀；、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀； 7、吸取酚時(shí)槍頭伸到下層溶液中，注意不、吸取酚時(shí)槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到要沾到 皮膚。皮膚。二、限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒二、限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒 1 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease） 能在特異位點(diǎn)酶切位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制

12、性DNA片段。 主要存在于細(xì)菌體內(nèi)。 切割不同來源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值（“分子手術(shù)刀”）。25作用作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源限制外源DNA， 保護(hù)自身保護(hù)自身DNA。分類分類、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d

13、 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識(shí)別序列特點(diǎn)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口、粘端切口：平端切口、粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口pUC18/19酶切位點(diǎn)的分布示意圖2 BamHI 、Hind酶切重組質(zhì)粒及鑒定酶切重組質(zhì)粒及鑒定1 實(shí)驗(yàn)原理： 利用限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,

14、產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的DNA片段，通過電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因重組質(zhì)粒DNA）32重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒BamHIHind III雙酶切雙酶切電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III2 實(shí)驗(yàn)材料: 重組質(zhì)粒; BamHI 、Hind 限制性內(nèi)切酶;反應(yīng)緩沖液;瓊脂糖凝膠電泳所需試劑和設(shè)備。343 實(shí)驗(yàn)步驟:A 建立反應(yīng)體系B 酶切反應(yīng)溫育1-3h）C 電泳鑒定354、雙酶切體系： 質(zhì)粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l ddH2O 6l 36合