第十二章高效液相色譜ppt課件

1、n n高效液相色譜法高效液相色譜法 n高效液相色譜法高效液相色譜法HPLCHPLC是是2020世紀世紀6060年代末年代末7070年代初發(fā)展起來的一種新型年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，分離分析技術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。析的重要手段。n它是在經(jīng)典液相色譜基礎上，引入它是在經(jīng)典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、因而具備速度快、效率高、靈

2、敏度高、操作自動化的特點。操作自動化的特點。高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相柱經(jīng)典液相柱色譜裝置色譜裝置高效液相色譜儀高效液相色譜儀例：分離例：分離20種氨基酸種氨基酸柱長：柱長：170 cm柱徑：柱徑：0.9 cmF：30 mL/ht分離分離: 20 h經(jīng)典柱色經(jīng)典柱色譜譜HPLCt分離：分離：1 h高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法 液相色譜與氣相色譜的比較液相色譜與氣相色譜的比較 液相色譜與氣相色譜的比較液相色譜與氣相色譜的比較 （l氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20。對于占有機物總數(shù)

3、近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。 液相色譜能完成難度較高的分離工作，因為：液相色譜能完成難度較高的分離工作，因為： 氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中，流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，作用。而在液相色譜中，流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。也可選用不同比例的兩種或兩為提高選擇性增加了一個因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的

4、液體作流動相，增大分離的選擇性。種以上的液體作流動相，增大分離的選擇性。 液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜。等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜可選擇余地小的。譜。等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜可選擇余地小的。 液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。有利于色譜分離條件的選擇。 （4 4液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的

5、檢測器，儀器比較復雜，但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復雜，價格昂貴。在實際應用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補價格昂貴。在實際應用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補充的。充的。 目前高效液相色譜法已被廣泛應用目前高效液相色譜法已被廣泛應用于分析對生物學和醫(yī)藥上有重大意義于分析對生物學和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。 適用范圍廣；適用范圍廣； 分離性能好；分離性能好； 分析速度快；分析速度快；流動相可選擇性范圍寬；流動相可選擇

6、性范圍寬；靈敏度較高；靈敏度較高；色譜柱可反復使用；色譜柱可反復使用；流出組分容易收集；流出組分容易收集；平安。平安。類類 型型主要分離機理主要分離機理主要分析對象或應用領域主要分析對象或應用領域吸附色譜吸附色譜吸附能，氫鍵吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜分配色譜疏水分配作用疏水分配作用各種有機化合物的分離、分析與制備各種有機化合物的分離、分析與制備凝膠色譜凝膠色譜溶質(zhì)分子大小溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜離子交換色譜庫侖力庫侖力無機離子、有機離子分析無機離子、有機離子分析離子排斥色譜離子排斥色譜Do

7、nnanDonnan膜平衡膜平衡有機酸、氨基酸、醇、醛分析有機酸、氨基酸、醇、醛分析離子對色譜離子對色譜疏水分配作用疏水分配作用離子性物質(zhì)分析離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水作用色譜疏水分配作用疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜手性色譜立體效應立體效應手性異構(gòu)體分離，藥物純化手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜親和色譜生化特異親和力生化特異親和力 蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析應用應用 由于由于HPLC分離分析的高靈分離分析的高靈敏度、定量的準確性、適于非敏度、定量的準確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因而，在

8、工業(yè)、科學研究，尤因而，在工業(yè)、科學研究，尤其是在生物學和醫(yī)學等方面應其是在生物學和醫(yī)學等方面應用極為廣泛。如氨基酸、蛋白用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機物抗生素、膽固醇、金屬有機物等分析，大多是通過等分析，大多是通過HPLC來來完成的。完成的。 右圖是各種右圖是各種HPLC方法的應方法的應用范圍及對象用范圍及對象極性增極性增加加不溶于不溶于水水溶于水溶于水非極性非極性離子離子非離子極性非離子極性吸附吸附反向分反向分配配分配分配正向分正向分配配離子交離子交換換尺寸排尺寸排阻

9、阻凝膠滲凝膠滲透透凝膠過凝膠過濾濾分分子子量量一一 液相色譜速率理論液相色譜速率理論uDdCDdCuDCudCDdCHMpmsfsMdpmMpe)()1(2212CuAH 流動相流速對板高的影響流動相流速對板高的影響 小顆粒填料，填充均勻；小顆粒填料，填充均勻； 選擇較低的流動相流速；選擇較低的流動相流速； 選擇粘度小的溶劑作流動相，改善傳質(zhì)。選擇粘度小的溶劑作流動相，改善傳質(zhì)。 修正的速率方程：修正的速率方程：提高柱效提高柱效途徑途徑二二 液相色譜中的柱外譜帶展寬液相色譜中的柱外譜帶展寬1貯液罐(濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì))2高壓泵輸液泵）3進樣裝置4色譜柱分別5檢測器分析6廢液出口或組分收集器

10、 7記錄裝置高壓泵高壓泵流動相流動相溶劑溶劑廢液廢液色譜柱色譜柱進樣口進樣口檢測器檢測器一一 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)要求要求輸出壓力高輸出壓力高平穩(wěn)、脈沖小平穩(wěn)、脈沖小流量穩(wěn)定可調(diào)流量穩(wěn)定可調(diào)耐腐蝕耐腐蝕1 高壓泵高壓泵 恒流泵特點是在一定操作恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)，與色譜柱引起阻力變化無關(guān)，如往復式柱塞泵、注射式螺旋如往復式柱塞泵、注射式螺旋泵；泵； 恒壓泵是指能保持輸出壓力恒恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視力而變化，故保留時間的重視性差，如氣

11、動泵。性差，如氣動泵。2 梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置通過改變流動相的組成來調(diào)整通過改變流動相的組成來調(diào)整組分的組分的k k值，改變分離因子值，改變分離因子值，值，以達到最短時間內(nèi)得到最佳分以達到最短時間內(nèi)得到最佳分離的目的。離的目的。梯度洗脫梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫梯度洗脫梯度洗脫的特點的特點分配比變化范圍寬的分配比變化范圍寬的復雜樣品應采取復雜樣品應采取梯度洗脫方式分離梯度洗脫方式分離3 貯液瓶及流動相貯液瓶及流動相1) 對樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。對樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。2) 適用于所選擇的檢測器。適用于所選擇的檢測器。3) 化學惰性好，以

12、免破壞固定相?；瘜W惰性好，以免破壞固定相。4) 低粘度，增加樣品的擴散系數(shù)，提高柱效。低粘度，增加樣品的擴散系數(shù)，提高柱效。5) 純度高。溶劑不純會增加檢測器噪聲，產(chǎn)生偽峰。純度高。溶劑不純會增加檢測器噪聲，產(chǎn)生偽峰。對流動相溶劑對流動相溶劑的一般要求的一般要求二二 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)二二 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng) 準備狀態(tài)準備狀態(tài) 進樣狀態(tài)進樣狀態(tài)六通閥進樣六通閥進樣 裝置裝置自動進樣器自動進樣器 三三 色譜柱色譜柱內(nèi)徑：內(nèi)徑：45 mm，柱長：，柱長：1050 cm；柱填料粒徑柱填料粒徑3 10m 分離柱分離柱四四 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)溶質(zhì)型檢測器溶質(zhì)型檢測器總體檢測器總體檢測器示差折光檢測器示差折光檢

13、測器介電常數(shù)檢測器介電常數(shù)檢測器紫外檢測器紫外檢測器熒光檢測器熒光檢測器電化學檢測器電化學檢測器1 紫外吸收檢測器紫外吸收檢測器(a) 可變波長紫外檢測器可變波長紫外檢測器(b) 二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器氘燈氘燈光柵光柵流通池流通池測量光電二極管測量光電二極管參比光電二極管參比光電二極管2 二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器兩種檢測器的色譜圖兩種檢測器的色譜圖(a)：可變波長紫外檢測器；：可變波長紫外檢測器；(b)：二極管陣列檢測器：二極管陣列檢測器(b)(a)nm254 紫外檢測器靈敏度高，精密度及線性范圍較好紫外檢測器靈敏度高，精密度及線性范圍較好 ，可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵?。

14、 流動相選擇有限制。流動相選擇有限制。一些常用溶劑的紫外截止波長一些常用溶劑的紫外截止波長溶劑溶劑CS2氯仿氯仿 四氫四氫呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截紫外截止波長止波長/nm380245212210 1902051873 熒光檢測器熒光檢測器靈敏度高，選擇靈敏度高，選擇性好，可用于梯度性好，可用于梯度洗脫。洗脫。 4 示差折光檢測器示差折光檢測器利用組分與流動利用組分與流動相的折射率之差進相的折射率之差進行檢測。行檢測。 通用性好，靈敏通用性好，靈敏度較低，不適用于度較低，不適用于梯度洗脫。梯度洗脫。5 化學發(fā)光檢測器化學發(fā)光檢測器6 電化學檢測器電化學檢測器 電導檢測器電導檢測器

15、安培檢測器安培檢測器7 質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器五五 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)脫氣裝置脫氣裝置 梯度洗脫梯度洗脫 再循環(huán)再循環(huán) 恒溫恒溫 餾分收集餾分收集及處理及處理分離原理分離原理msccK K不僅與固定相的不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流種類有關(guān)，也與流動相的種類有關(guān)動相的種類有關(guān)液液分配色譜液液分配色譜液液色譜液液色譜鍵和相色譜鍵和相色譜固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團鍵合到載體表面，因可將各種極性的官能團鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。此它適用于種類繁多樣品的分離。缺點缺點特點特點硅膠為基體，利用硅膠表面的硅醇基硅膠為基

16、體，利用硅膠表面的硅醇基(Si一一OH)與有機分與有機分子之間成鍵子之間成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1疏水基團疏水基團 如不同鏈長的烷烴如不同鏈長的烷烴C8和和C18和苯基等；和苯基等；（2極性基團極性基團 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；（3離子交換基團離子交換基團 如陰離子交換基團：胺基，季銨鹽；陽離如陰離子交換基團：胺基，季銨鹽；陽離子交換基團：磺酸等。子交換基團：磺酸等。2. 鍵合相色譜法分類鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜:常用固定相：常用固定相：C18常用流動相常用流動相甲醇甲醇-水水乙腈乙

17、腈-水水反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜疏溶劑分離機制疏溶劑分離機制固定相極性固定相極性 流動相極性流動相極性離子性鍵合相色譜離子性鍵合相色譜 將各種離子交換基團化學鍵合到硅膠將各種離子交換基團化學鍵合到硅膠基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜類同。譜類同。 3.化學鍵合固定相的特點化學鍵合固定相的特點 存在著雙重分離機制：存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；低覆蓋率：吸附為主； 反相鍵合相色譜

18、反相鍵合相色譜:常用流動相常用流動相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜:極性大的先流出，極性小的后流出極性大的先流出，極性小的后流出正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜:極性小的先流出，極性大的后流出極性小的先流出，極性大的后流出一一 吸附色譜法吸附色譜法1 分離原理分離原理nadnadadSXSXK X + nSadXad+SnKad值越大，保留時間越長。值越大，保留時間越長。 2 固定相固定相硅膠強極性硅膠強極性氧化鋁弱極性氧化鋁弱極性活性炭非極性活性炭非極性分子篩強極性分子篩強極性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑固體吸附劑3 流動相流動相(洗脫劑洗脫劑) 越

19、大，表明流動相溶劑分子對吸越大，表明流動相溶劑分子對吸附劑的親和能力越強，則越易從吸附附劑的親和能力越強，則越易從吸附劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來。劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來。 。 溶劑分子在單位吸附劑表面上的溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附自由能吸附自由能。 溶劑強度參數(shù)溶劑強度參數(shù)硅膠固定相分離苯，甲苯，硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯乙苯，丙苯，丁苯流動相：流動相：干燥正庚烷干燥正庚烷1份水飽和的正庚烷份水飽和的正庚烷2份干燥正庚烷份干燥正庚烷水飽和的正庚烷水飽和的正庚烷改變流動相的改變流動相的組成可改變分離組成可改變分離的選擇性的選擇性4 應用應用具有不同官能團的化合物具有不同官

20、能團的化合物具有相同官能團，但數(shù)量不同的具有相同官能團，但數(shù)量不同的化合物化合物異構(gòu)體異構(gòu)體例：幾種取代位置不同的硝基例：幾種取代位置不同的硝基苯胺的分離。在硅膠吸附劑上苯胺的分離。在硅膠吸附劑上的滯留順序：的滯留順序：鄰位鄰位間位間位對對位位鄰硝基苯胺鄰硝基苯胺間硝基苯胺間硝基苯胺對硝基苯胺對硝基苯胺適合分離的物適合分離的物質(zhì)質(zhì)一一 離子交換色譜法離子交換色譜法陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂陽離子交換陽離子交換陰離子交換陰離子交換+RSO3-H+H+RSO3-M+M+RNR3+Cl-+X-RNR3+X-Cl-1 分離原理分離原理2 固定相固定相陽離子：陽離子：SO3H(強強)CO2H(弱弱)陰離子：陰離子：N+R3(強強)NH2 (弱弱)基基質(zhì)質(zhì)合成樹脂合成樹脂纖維素纖維素硅膠硅膠離子交換劑離子交換劑3 流動相流動相水相緩沖液水相緩沖液+有機改性劑有機改性劑調(diào)節(jié)選擇性的調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)主要參數(shù)鹽種類及濃度鹽種類及濃度pH值值各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序： FOHCOOCHHCOOClSCNBrCrONOIOCSO324324