器官移植配型

1、 器官移植配型理論與技術(shù)基本概念基本概念n廣義的器官移植：用自身或異體的正常器官、組織或細(xì)胞置換病變或功能缺失的器官、組織或細(xì)胞，以維持和重建機(jī)體的生理功能。n影響移植成功的關(guān)鍵因素是可能發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)；一一. . 基本概念基本概念人人人人豬豬相關(guān)概念相關(guān)概念同種異體移植異種移植同系移植移植自體移植引起排斥反應(yīng)的抗原nABO血型抗原；n組織特異性抗原；n主要組織相容性抗原(MHA, major histocompatibility antigen )，又稱人類白細(xì)胞抗原（HLA）;n次要組織相容性抗原（mHA, minor histocompatibility antigen ）H-Y抗原

2、;HLA的基因結(jié)構(gòu)、抗原結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)n由第6號染色體短臂21.31區(qū)編碼，按功能分為HLA-I,三個區(qū)域，其中I,區(qū)編碼抗原與移植關(guān)系密切。HLA-I類抗原主要由A、B、C位點(diǎn)編碼；HLA-類抗原由DR、DP、DQ位點(diǎn)編碼；nHLA-I類抗原是由第6號染色體相應(yīng)I類基因編碼的鏈與第15號染色體編碼的2微球蛋白非共價鍵結(jié)合的糖蛋白，主要表達(dá)在有核細(xì)胞表面；nHLA-類抗原由第6號染色體相應(yīng)類基因編碼的鏈和鏈非共價鍵結(jié)合的糖蛋白，主要表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞，胸腺上皮細(xì)胞表面；HLA抗原的生物學(xué)功能n1.參與蛋白質(zhì)抗原的處理與遞呈；n2.調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；n3.參與T細(xì)胞分化過程；n4.介導(dǎo)同種免疫應(yīng)答；HL

3、A基因的遺傳特點(diǎn)n1.高度多態(tài)性；HLA基因呈現(xiàn)多位點(diǎn)復(fù)等位的特點(diǎn)；n2.共顯性遺傳：每對等位基因同時表達(dá)；n3.單倍型遺傳：位于同一條染色體上的 HLA各位點(diǎn)的基因組合；n4.連鎖不平衡：單倍型基因非隨機(jī)分布的現(xiàn)象；2.傳統(tǒng)的HLA分型技術(shù)n血清學(xué)分型:補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒實(shí)驗;n待測淋巴細(xì)胞與已知抗體孵育，再加入補(bǔ)體，若該抗體與淋巴細(xì)胞膜上HLA分子相匹配，則激活補(bǔ)體系統(tǒng)導(dǎo)致待測細(xì)胞膜的破壞，否則細(xì)胞膜完整不受影響。n局限性：需要活的淋巴細(xì)胞；存在交叉反應(yīng)；隱蔽抗原無法識別；人為影響因素多質(zhì)控難做；n細(xì)胞學(xué)分型：混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；n受者淋巴細(xì)胞與已知類型的淋巴細(xì)胞或者供者淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，

4、兩種細(xì)胞HLA分子表型如果相同則不能刺激淋巴細(xì)胞增殖，反之則刺激淋巴細(xì)胞增殖，分為單雙向兩種類型。n局限性：需要活的純合子表型的淋巴細(xì)胞；增殖檢測方法要用到同位素；分子生物學(xué)技術(shù)分型nHLA抗原蛋白分子的多態(tài)性取決于相應(yīng)編碼基因的多態(tài)性；nRFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP;nPCR-SSCP;nPCR-Sequencing；nPCR-SSO/基因芯片技術(shù)；n流式細(xì)胞儀技術(shù)；n氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)；聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 在多聚合酶，在多聚合酶，引物，底物和模引物，底物和模板的參與下通過板的參與下通過變性，退火，延變性，退火，延伸三個循環(huán)步驟伸三個循環(huán)步驟在短時間內(nèi)達(dá)

5、到在短時間內(nèi)達(dá)到對目的片斷的大對目的片斷的大量擴(kuò)增，是基因量擴(kuò)增，是基因分型的基礎(chǔ)。分型的基礎(chǔ)。RFLP/PCR-RFLP/PCR-SSP/基因組基因組DNA 提取提取 酶切酶切 電泳分析電泳分析（RFLP） DNA 擴(kuò)增（共性引物擴(kuò)增（共性引物/特異性引物）特異性引物） (限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切) 電泳檢測電泳檢測(PCR-RFLP/PCR-SSP) PCR-SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）n提取基因組提取基因組DNA PCR擴(kuò)增（特異引物）擴(kuò)增（特異引物） 變性變性(雙雙鏈鏈 單鏈單鏈) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)帶型根據(jù)帶型可檢出基因的多態(tài)性又可檢出點(diǎn)突變，有利于發(fā)現(xiàn)

6、新可檢出基因的多態(tài)性又可檢出點(diǎn)突變，有利于發(fā)現(xiàn)新的等位基因的等位基因PCR-sequencingn提取基因組提取基因組DNA PCR擴(kuò)增（非特異擴(kuò)增（非特異/特異引物）特異引物）DNA測序測序n最可靠、直接、準(zhǔn)確的最可靠、直接、準(zhǔn)確的HLA分型方法；分型方法；n臨床上應(yīng)用限制了供體的來源；臨床上應(yīng)用限制了供體的來源；n在確定等位基因的多態(tài)性、發(fā)現(xiàn)新位點(diǎn)、基因定位等在確定等位基因的多態(tài)性、發(fā)現(xiàn)新位點(diǎn)、基因定位等研究領(lǐng)域應(yīng)用較多；研究領(lǐng)域應(yīng)用較多；PCR-SSO（序列特異性寡核苷酸探針雜交）/基因芯片技術(shù)n正向雜交：正向雜交：提取基因組提取基因組DNA PCR擴(kuò)增（共性引物）擴(kuò)增（共性引物） 將將

7、PCR產(chǎn)物固定在固相支持載體上并進(jìn)行變性處理產(chǎn)物固定在固相支持載體上并進(jìn)行變性處理 與標(biāo)記的特異性與標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針變性雜交寡核苷酸探針變性雜交 根據(jù)雜交信號判斷根據(jù)雜交信號判斷HLA類型；類型；n反向雜交：反向雜交：將特異性寡核苷酸探針固定在固相載體上將特異性寡核苷酸探針固定在固相載體上 與標(biāo)記與標(biāo)記的的PCR產(chǎn)物（已經(jīng)變性處理）雜交產(chǎn)物（已經(jīng)變性處理）雜交 根據(jù)雜交信號判斷根據(jù)雜交信號判斷HLA類類型；型；n基因芯片技術(shù)是一種反向基因芯片技術(shù)是一種反向PCR-SSO方法，具有高通量、縮微化、方法，具有高通量、縮微化、自動化程度高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢；自動化程度高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢；流式細(xì)

8、胞儀技術(shù)n提取基因組提取基因組DNA 非特異性非特異性PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 變性處理變性處理 與包被了特異性與包被了特異性HLA探針的微球結(jié)合探針的微球結(jié)合 洗脫處理洗脫處理 通過流式細(xì)胞儀檢測通過流式細(xì)胞儀檢測n利用流式細(xì)胞儀技術(shù)將反向的固相利用流式細(xì)胞儀技術(shù)將反向的固相PCRSSO技術(shù)變技術(shù)變?yōu)橐合鄼z測分析技術(shù)；為液相檢測分析技術(shù)；n每種包被了不同類型每種包被了不同類型HLADNA探針的微球?qū)?yīng)一種探針的微球?qū)?yīng)一種熒光染色能夠被流式細(xì)胞儀識別；熒光染色能夠被流式細(xì)胞儀識別；n具有高通量、準(zhǔn)確快速的優(yōu)勢；具有高通量、準(zhǔn)確快速的優(yōu)勢；氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)分型技術(shù)n根據(jù)HLA分子346個氨基酸殘基中對

9、移植物排斥與存活率具有重要影響的關(guān)鍵氨基酸，當(dāng)供受者的關(guān)鍵氨基酸殘基相同，盡管接受HLA抗原部分錯配的供體，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性仍然是低反應(yīng)性或無免疫反應(yīng)性，從而使移植物得以長期存活。HLA分型技術(shù)臨床應(yīng)用評價n1.在器官移植中具有重要臨床意義； 六位點(diǎn)配型原則：HLA-A/B/DRn2.合理選擇HLA基因分型技術(shù)； 各種方法相互補(bǔ)充，難以相互替代，根 據(jù)不同需求選擇不同方法方方法法血清學(xué)分型血清學(xué)分型/ /細(xì)細(xì)胞分型胞分型基因分型基因分型(SSP/SSOP/SB)(SSP/SSOP/SB)識識別別位位點(diǎn)點(diǎn)HLAHLA分子抗原特分子抗原特異性，某些氨基異性，某些氨基酸殘基位點(diǎn)酸殘基位點(diǎn)DNADNA

10、序列差異序列差異分分辨辨率率低（抗原特異性）低（抗原特異性）HLA-A01HLA-A01低（抗原特異性）低（抗原特異性）/ /中等（集團(tuán)特中等（集團(tuán)特異性）異性）/ /高（等位基因特異性）高（等位基因特異性）HLA-AHLA-A* *0101；HLA-AHLA-A* *0101/0102/01030101/0102/0103； HLA-AHLA-A* *0101020301010203抗原法抗原法/ /基因法基因法1.1.字母字母HLAHLA代表染色體上一段特代表染色體上一段特殊的遺傳區(qū)域（人類白細(xì)胞殊的遺傳區(qū)域（人類白細(xì)胞表面抗原區(qū)域）；表面抗原區(qū)域）；2.2.A/B/DRA/B/DR代表該區(qū)域某一具體代表該區(qū)域某一具體的基因座位；的基因座位；3.3.數(shù)字代表該基因座位編碼的數(shù)字代表該基因座位編碼的特異性抗原（血