植物體細胞雜交

1、第十一章植物體細胞雜交第一節(jié)植物體細胞雜交的概念與發(fā)展歷程一、植物體細胞雜交的類型、概念植物體細胞雜交按照所用親本原生質(zhì)體的性質(zhì)可以分為三類：第一類為常用的體細胞雜交，即用雙親的體細胞原生質(zhì)體或其衍生系統(tǒng)進行誘導融合，再經(jīng)培養(yǎng)、篩選、鑒定等步驟得到細胞雜種； 第二類是配子間細胞雜交，即用雙親的性細胞原生質(zhì)體為融合親本，其他步驟同第一類； 第三類是配子體細胞雜交，即一個融合親本為性細胞原生質(zhì)體，另一個為體細胞原生質(zhì)體， 其他步驟同第一類。 目前仍以體細胞雜交為多，其他兩類也開始有所報道（夏鎮(zhèn)澳， 1997）。下面僅對植物體細胞雜交加以介紹。植物體細胞雜交即原生質(zhì)體融合（見圖11.9），是在植物原

2、生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)基礎上，借用動物細胞融合方法發(fā)展和完善的新型生物技術(shù)，包括原生質(zhì)體制備、細胞融合誘導、 雜種細胞篩選與培養(yǎng)以及雜種植株再生與鑒定等技術(shù)環(huán)節(jié)。早期，在許多植物屬內(nèi)、種間和種內(nèi)的體細胞雜交獲得雜種細胞系或雜種植株，如煙草屬、曼陀羅屬等。目前，由于植物原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是禾本科和豆科等重要糧食作物原生質(zhì)體操作關鍵技術(shù)的突破，使這兩類作物的體細胞雜交也能產(chǎn)生種間或?qū)匍g雜種（錢迎倩等，1990）。圖 11.9 原生質(zhì)體電融合（引自 Koop and Schweiger ， 1985）二、植物體細胞雜交發(fā)展歷程1960年， Kocking首次獲得通過酶法制備的高等植物原生質(zhì)體；

3、1970年， Power首次通過硝酸鈉作為誘導劑進行較大規(guī)模原生質(zhì)體誘導融合；1971年， Takebe離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)首次獲得再生完整植株；1972年， Carlson首次獲得第一個植物細胞雜種粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種。1974年， Kao 采用聚乙二醇誘導融合法誘導植物細胞融合，建立了相應的融合技術(shù)；1978年， Melchers首次獲得屬間細胞雜種（番茄馬鈴薯）；1981年， Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；1987年， Schweiger建立了單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。第二節(jié)植物原生質(zhì)體融合的方法目前，誘導體細胞融合的方法主要有電融合法 （Zimme

4、rmann ，1982）和聚乙二醇 （ PEG）高鈣高 pH 值法（ Kao， 1977 ）。一、電融合法電融合法與 PEG 融合法相比具有三大優(yōu)點： 一是不存在對細胞的毒害問題； 二是融合效率高；三是融合技術(shù)操作簡便。電融合的基本過程：1、細胞膜的接觸； 2、膜的擊穿。 電融合的主要參數(shù)包括交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時間、直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。二、聚乙二醇（ PEG）高鈣高 pH 值法優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG 可能對細胞有毒害。第三節(jié)雜種細胞的發(fā)育動態(tài)及體細胞雜種應注意的問題一、

5、雜種細胞的發(fā)育動態(tài)誘導植物原生質(zhì)體融合后會產(chǎn)生不同的融合結(jié)果（見圖胞質(zhì)雜種是指所得到的細胞雜種完全沒有供體的核基因，體基因。11.10），包括雜種和胞質(zhì)雜種。而僅僅是轉(zhuǎn)入供體的葉綠體和線粒線粒體葉綠體融合 (fusion)核異核體 (heterokaryon)胞質(zhì)雜種雜種 (hybrid)雜種 (hybrid)胞質(zhì)雜種(cybrid)(cybrid)圖 11.10 兩種遺傳上不同植物原生質(zhì)體融合后可能產(chǎn)生的結(jié)果核質(zhì)重組、細胞器重組、部分核物質(zhì)或細胞器丟失、核分裂的非同步性二、體細胞雜種選擇應注意的問題體細胞融合可以克服常規(guī)植物育種中遠緣雜交不孕性，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的交流，用以將控制優(yōu)良性狀的基因?qū)?/p>

6、入被改良的受體內(nèi)，獲得細胞雜種， 創(chuàng)造新的育種材料或優(yōu)良品系，豐富植物基因庫。 但為了將體細胞雜交技術(shù)更好地應用于生物資源開發(fā)和作物品種改良，在進行體細胞雜交研究時，應考慮以下主要問題： 雜交組合的選擇。近緣種內(nèi)或種間的體細胞雜交具有較強的目的性，因此，在進行雜交組合選擇時，應選擇再生能力強、具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀（高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等）的野生種或近緣種， 通過細胞融合將優(yōu)良特性導入相應的栽培種或近緣種，創(chuàng)造新的育種材料或新品種。 原生質(zhì)體的制備。體細胞融合一般要求新鮮、制備時間較短的原生質(zhì)體，因分離時間過長，原生質(zhì)體開始長壁，影響融合效果。 融合方法。經(jīng)改良的電融合法要優(yōu)于PEG 法，而且操作

7、簡便，對細胞無毒害作用（ Bates and Hazenkampt， 1985），誘導頻率較高。但由于電融合需要昂貴的電融合儀，這種方法現(xiàn)在應用并不普遍。 PEG 法操作比較復雜，融合效果受原生質(zhì)體的生理狀態(tài)、純度、密度， PEG 的質(zhì)量和濃度，處理時間，鈣離子濃度，洗液成分以及誘導融合程序等因素影響較大，在融合時應加以考慮。 選擇雜種的方法。應用遺傳或生理互補的選擇方法能夠在愈傷組織水平或再生植株中有效地選擇雜種。 但應考慮到雜種細胞生長發(fā)育過程中染色體的丟失，即通過遺傳互補選擇法進行雜種細胞選擇時， 淘汰了喪失標記基因的體細胞雜種。 因此，進行雜種選擇時要小心謹慎。 由雜種細胞誘導獲得再生植株是否為雜種的鑒定方法。根