細胞表面分子的檢測與分析學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1細胞表面分子的檢測細胞表面分子的檢測(jin c)與分析與分析第一頁，共37頁。第2頁/共37頁第二頁，共37頁。一、新鮮實體組織樣本的制備一、新鮮實體組織樣本的制備 酶消化法。酶消化法。 常用常用(chn yn)(chn yn)的酶類試劑：胃蛋白酶、木瓜的酶類試劑：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等 機械法。機械法。1 1、剪碎法、剪碎法 2 2、網(wǎng)搓法、網(wǎng)搓法 3 3、研磨法、研磨法 化學(xué)處理法?；瘜W(xué)處理法。 常用常用(chn yn)(chn yn)試劑：試劑：0.2%EDTA 0.25%0.2%EDTA 0.25%胰酶胰酶+0.2%EDTA

2、+0.2%EDTA注意：除消化過程外，其余步驟最好在注意：除消化過程外，其余步驟最好在4 4度環(huán)境下操度環(huán)境下操作，提高作，提高 細胞活性。細胞活性。第3頁/共37頁第三頁，共37頁。勻，室溫放置勻，室溫放置10min，離心去上清，離心去上清，再加入溶血劑溶血，反再加入溶血劑溶血，反復(fù)復(fù)23次，至紅細胞完全溶解。次，至紅細胞完全溶解。細胞重懸后，再進行熒光標(biāo)細胞重懸后，再進行熒光標(biāo)記。記。第4頁/共37頁第四頁，共37頁。(xbo)層；（4）用吸管將上層與中層之間的單個核細胞(xbo)層吸出，用生理鹽水洗兩遍，PBS重懸；（5）熒光標(biāo)記。第5頁/共37頁第五頁，共37頁。四、貼壁細胞單細胞懸液

3、的制備 （1）將培養(yǎng)細胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化(xiohu)37分鐘， 至光鏡下見到貼壁細胞變圓還沒有漂浮為止，棄消化(xiohu) 液，加PBS； （2）用吸管將細胞從瓶壁上輕輕吹打下來，移入離心管中； （3）離心，1000r/min，5min； （4）加PBS洗兩遍； （5）PBS重懸，將細胞吹打均勻； （6）熒光標(biāo)記。第6頁/共37頁第六頁，共37頁。n接標(biāo)記。接標(biāo)記。第7頁/共37頁第七頁，共37頁。n補償對照補償對照(duzho)n多色熒光標(biāo)記時，用于熒光光譜重疊的多色熒光標(biāo)記時，用于熒光光譜重疊的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。第8頁/共37頁第八頁，共37頁。第9頁/共37頁第九頁，共

4、37頁。 口訣(kuju)：橫平豎直第10頁/共37頁第十頁，共37頁。第11頁/共37頁第十一頁，共37頁。第12頁/共37頁第十二頁，共37頁。樣本樣本(yngbn)的采集的采集n手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本(biobn)取材時，要避免出血或組織壞 死。深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA降解，造成檢測結(jié)果的誤差。n采集靜脈血樣本時，要避免發(fā)生溶血。n收集培養(yǎng)的細胞時，要注意選擇消化的方法和試劑。第13頁/共37頁第十三頁，共37頁。原則：時間越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室溫 72小時EDTA抗凝的標(biāo)本：室溫 24小時ACD抗凝的外周血：室溫 72小時ACD不推薦用作骨髓穿刺液的抗凝粒細胞、血小

5、板功能檢測：即刻檢測單核細胞表面抗原分析： 1小時，4嗜酸性(sun xn)粒細胞表面抗原分析： 24小時，4淋巴細胞免疫表型與DNA含量的分析： 72小時第14頁/共37頁第十四頁，共37頁。第15頁/共37頁第十五頁，共37頁。 溶血，即裂解紅細胞。它是流式細胞術(shù)分析(fnx)白細胞的先決條件。溶血不好，白細胞群不能很好分開，溶血好壞直接影響檢測結(jié)果。因此，必須對溶血過程進行嚴(yán)格控制。 影響影響(yngxing)溶血的因素：采血過程溶血的因素：采血過程 溶血劑的使用溶血劑的使用 實驗操作過程實驗操作過程第16頁/共37頁第十六頁，共37頁。第17頁/共37頁第十七頁，共37頁。n流式細胞術(shù)

6、的樣本制備沒有一個黃金標(biāo)準(zhǔn)n最佳樣本制備方法需要根據(jù)具體情況獨立(dl)設(shè)定評估第18頁/共37頁第十八頁，共37頁。第19頁/共37頁第十九頁，共37頁。第20頁/共37頁第二十頁，共37頁。第21頁/共37頁第二十一頁，共37頁。淋巴細胞淋巴細胞單核細胞單核細胞粒細胞粒細胞這三群細胞分別由具有不同功能(gngnng)的細胞組成這些細胞數(shù)量不等，甚至非常稀少這些細胞表達不同的標(biāo)記物，是用來區(qū)分它們的基礎(chǔ)第22頁/共37頁第二十二頁，共37頁。第23頁/共37頁第二十三頁，共37頁。第24頁/共37頁第二十四頁，共37頁。1.取新鮮抗凝血100ul，置于FCM測量管中；2.直接標(biāo)記法：加入帶熒

7、光標(biāo)記抗人的單克隆抗體 10ul，充分混勻，4閉光孵育2030min; 3.加入溶血劑A液600ul, 輕輕振蕩15s, 加入溶血劑B液260ul, 輕輕振蕩15s， 加入溶血劑C液100ul, 振蕩10s,上機檢測。 ACK溶血劑:加入2mlACK溶血劑，充分混勻，反應(yīng)5min, 1000r/min離心5min，去上清；重復(fù)一遍，用PBS洗滌1遍，收集(shuj)細胞上機檢測。第25頁/共37頁第二十五頁，共37頁。置) 第26頁/共37頁第二十六頁，共37頁。n無菌濾膜濾過(l u)，4保存第27頁/共37頁第二十七頁，共37頁。第28頁/共37頁第二十八頁，共37頁。第29頁/共37頁第二十九頁，共37頁。第30頁/共37頁第三十頁，共37頁。第31頁/共37頁第三十一頁，共37頁。第32頁/共37頁第三十二頁，共37頁。第33頁/共37頁第三十三頁，共