western blot總結(jié)前人的經(jīng)驗(yàn)

1、Western blot1.實(shí)驗(yàn)的原理2.試劑的配制3.實(shí)驗(yàn)的步驟4.凝膠圖象分析 實(shí)驗(yàn)的原理實(shí)驗(yàn)室所用的試劑的配方參考TAKARA分子實(shí)驗(yàn)常用配方手冊l蛋白樣品的制備 SDS-PAGE 轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗雜交 二抗雜交 底物顯色蛋白樣品的制備參考RIPA 裂解液的說明書： 對于對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品培養(yǎng)細(xì)胞樣品： 1.取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF，PMSF 的工作濃度為 1X2.對于貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗兩遍。加入適量的裂解 液（約為細(xì)胞體積的 5-7 倍），用移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。冰上放置20min，14000g 離心 10

2、 分鐘，取上清，即為 蛋白提取物。3 .對于懸浮細(xì)胞，2500g離心5min收集細(xì)胞，用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞，2500g離心5min收集細(xì)胞,加入適量裂解液. （約為細(xì)胞體積的 5-7 倍）。用移液器吹打數(shù)下，把細(xì)胞吹散，冰上孵育20min，14000g 離心 10 分鐘，取上清，即為 蛋白提取物。對于組織樣品：對于組織樣品： 1.手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，洗凈組織血跡，用濾紙吸干組 織表面液體，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入勻漿器中。 2.取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF,使 PMSF 的最終濃度為 1x。 3.按組織凈重（

3、g）：裂解液(ml)=1：10 的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿(如果裂解 不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液, 如果需要高濃度的蛋白樣品, 可以適當(dāng)減少裂解液的 用量) 。 4.勻漿器勻漿,冰上孵育 20min，直至充分裂解。 5.充分裂解后, 14000g 離心 10 分鐘,取上清,即為蛋白提蛋白濃度的測定使用BCA法測，詳細(xì)步驟參考說明書:(1) 取 1.2ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)（30mg BSA）中，充分溶解后配制成 25mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后可立即使用，也可-20長期保存； (2) 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取適量 25mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至 0.5mg/ml(蛋

4、白樣品在什么溶液中，標(biāo) 準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但為了簡便起見，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品)。 稀釋后的 0.5mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)也可-20長期保存； (3) 配制 BCA 工作液：按 50 體積試劑 A 加 1 體積試劑 B 配制適量工作液，充分混勻（配 制的量視樣本量而定，200l/孔）。工作液室溫 24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。 (4) 加標(biāo)準(zhǔn)品：將標(biāo)準(zhǔn)品按 0、1、2、4、8、12、16、20l 加入 96 孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中（做 副孔），加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到 20l。 (5) 加樣品：加 2l 樣品到 96 孔板的樣品孔中，加 18l PBS(好用 1%SDS 或裂解液，

5、保 持與原樣本中的一致)，使總體積達(dá)到 20l。 (6) 加工作液：每孔加入 200l 步驟 2 所配制工作液。 (7) 37靜置 20-30 分鐘?？墒覝胤胖?2 小時(shí)。 (8) 酶標(biāo)儀測定 A562，540-595nm 之間的波長也可接受。 (9) EXCEL 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。 附 SDSPAGE 電泳 q不連續(xù)的電泳緩沖體系。qSDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。SDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDSSDS和含有巰基乙醇的樣和含有巰基乙醇的樣品處理液，品處理液，

6、是一種很強(qiáng)的是一種很強(qiáng)的，它可以，它可以，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTTDTT）可以可以斷開二硫斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDSSDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物。復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDSSDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超 過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種

7、蛋白質(zhì)之間所過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所 帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基亞基 的的相對分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)相對分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)SDS：陰離子去污劑陰離子去污劑 變性劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與氨基酸側(cè)鏈與SDSSDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS膠束。膠束。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不 同分同分子之間原有的電荷差異。子之間原有的電荷差

8、異。與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS膠束的特點(diǎn)：膠束的特點(diǎn)：（1）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長橢圓棒（2）平均1g 蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS（3）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比SDS-PAGESDS-PAGE凝膠的有效分離范圍 SDSPAGE 電泳詳細(xì)過程（1） 清洗玻璃板： 一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干（2） 灌膠與上樣 1、 玻璃板對齊

9、后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要 使兩玻璃對齊，以免漏膠。） 2、 根據(jù)蛋白大小配制一定濃度的分離膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)， 可用 1ml 槍吸取 5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。 然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面 快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才 不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。） 3、 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固 就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。 Western Blot灌制分離膠灌制分離膠 隔絕

10、空氣隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:8%4、 按前面方法配 5的濃縮膠,加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空 間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以 免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收 縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng) 常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕 輕將其拔出。5、 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板 面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向 外。） 6、 測完蛋白含量后，計(jì)算含 50g 蛋白的溶液體積即為上

11、樣量。取出上樣樣 品至 PCR管中，加入 5SDS 上樣緩沖液至終濃度為 1。（5SDS 上樣緩沖液事先跟巰基巰基乙醇按乙醇按1ml1ml加加50ul50ul配好配好。）上樣前要將樣 品于沸水中煮 5min 使蛋白變性 Western Blot灌制積層膠灌制積層膠 插入梳子插入梳子 7、 加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。） 用微量移液槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將移液槍的槍頭插 至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也 可能使樣品溢出），沒加一個(gè)樣品要換一次槍頭（3） 電泳 電泳時(shí)間一般 1.5h，電壓為 濃縮膠80V 較好，

12、分離膠120V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止 電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 Western BlotStaking gelSeparating gel 轉(zhuǎn)膜 （1） 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 6 張 5x9cm的濾紙和 1 張 4x8cm的PVDF膜。切 濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的膜 置于甲醇中浸 15秒才可使用。（2） 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和 浸過的膜。 （3） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以 搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊 三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子

13、上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去 其中的氣泡。 （4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。 撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。 將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋 3 張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作 在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。（5） 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電

14、 轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用 恒流300mA,轉(zhuǎn)2h（6） 轉(zhuǎn)完后將膜用 1麗春紅染液染 5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染 上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。(此步可以省略) 免疫反應(yīng) （1） 將膜用 TBST從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖 動(dòng)封閉 1h。 （2） 將一抗用 TBST 稀釋至適當(dāng)濃度（在 1.5ml 離心管中）。剪一大小合適的雜交袋，取出膜，在濾紙上沾幾下（PVDF 膜需保持濕的狀態(tài)）， 放入雜交袋中，加入一抗后，用封口機(jī)封閉在袋內(nèi)，趕盡氣泡，4 過夜（指 12 小時(shí)）。 或者室溫?fù)u床1.5h. 取出濾膜用

15、 TBST 漂洗 3 次，每次 10min（室溫，平緩搖動(dòng)）。 （3） 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育 1.5h 后，用 TBST 在室溫 下脫色搖床上洗三次，每次 10min；（1） 將 A 和 B 兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min 后，將膜蛋白面朝下與此混 合液充分接觸；1min 后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入 X光片夾中 （2） 在暗室中，將 1顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出 X光片， 用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大 1cm）；打開 X-光片夾，把 X 光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上 X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào) 的

16、強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為 1min 或 5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片， 以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開 X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中 顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為 12min（2025 ），溫度過低時(shí)（低于 16）需適當(dāng)延長顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把 X光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為 510min，以膠片透明為止；用自來水沖 去殘留的定影液后，室溫下晾干。 應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對 結(jié)果產(chǎn)生影響。全程不要用鑷子去夾。凝膠圖象分析 將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)對目的條帶進(jìn)行光

17、密度定量。計(jì)算出相對表達(dá)量，然后作條形圖。常見的一些問題與分析1.暗處觀察膜，明明發(fā)現(xiàn)只有一條熒光帶，為何我顯影出來的條帶卻很多，形成了拖尾現(xiàn)象？答：主要是將膠片放到膜上后，還在拖動(dòng)它，取出膠片的時(shí)候，要小心，盡量不要拖動(dòng)膠片，可以將整個(gè)壓片盒倒轉(zhuǎn)過來打開。2.為何每次洗出來的條帶都是很粗，每個(gè)樣品之間的間隔很小呢？答：這是一個(gè)常見的問題，有些人的做法是減少上樣量，但最后還是出現(xiàn)了同樣的問題。其實(shí)關(guān)鍵在于顯影的技巧，當(dāng)膠片在顯影液中，剛出現(xiàn)條帶時(shí)，叫要立刻拿上來了，然后條帶會(huì)慢慢變粗，當(dāng)達(dá)到想要的效果時(shí)，立刻放到定影液中定影。3.膠帶顯影出來后，出現(xiàn)了幾條條帶，我怎么知道哪個(gè)是我們的目的條帶，還有哪個(gè)樣品是多少號(hào)怎么看？答：顯影完后，晾干，拿去跟膜進(jìn)行對照，根據(jù)mark的大小標(biāo)出相應(yīng)條帶的大小，這里關(guān)鍵在于，壓片的時(shí)候，放膠片一定要按正確的方式放，一般膠片半圓角的兩邊要跟壓片盒的左上角的兩邊緊挨著對齊。用梳子去跟膜和膠片匹對就可以找出每個(gè)加樣孔的位置了。4.為什么我轉(zhuǎn)膜后，沒有看到膜上有marker?答：很有可能是你轉(zhuǎn)膜的時(shí)，方向搞錯(cuò)了