免疫膠體金的制備與應(yīng)用

1、免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用 膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中都可能例用到。 1971年Faulk 和Taytor將膠體金引人免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于檢測 HBsAg、HCG 和抗雙鏈抗體等，具有簡單、

2、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)。 免疫膠體金技術(shù)的基本原理氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。 免疫

3、金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。 膠體金的制備方法膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。下面介紹最常用的制備方法及注意事項。、玻璃容器的清潔：玻璃表面少量的污染會干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃容器應(yīng)絕對清潔，用前經(jīng)過酸洗、硅化。硅化過程一般是將玻璃容器浸泡于二氯二

4、甲硅烷的氯仿溶液中分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。專用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸餾水淋洗，可代替硅化處理。、試劑、水質(zhì)和環(huán)境：氯金酸極易吸潮，對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其水溶液在可穩(wěn)定數(shù)月不變。實(shí)驗(yàn)用水一般用雙蒸餾水。實(shí)驗(yàn)室中的塵粒要盡量減少，否則實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將缺乏重復(fù)性。金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應(yīng)選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH35.8)、Tris-HCL (pH5.88.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.510.3)等緩沖系統(tǒng)。但應(yīng)注意

5、不應(yīng)使緩沖液濃度過高而使金溶膠自凝。、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠： 取0.01氯金酸水溶液100ml 加熱至沸，攪動下準(zhǔn)確加入檸檬酸三鈉水溶液 0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區(qū)最高吸收峰在535nm，1cm/535=1.12。金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱免疫凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)。金溶膠顆粒的直徑和制備時加入的檸檬酸三鈉量是密切相關(guān)的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠

6、，也就是不同粒徑的金溶膠，見附表。 附表 100 ml 氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響檸檬酸三鈉ml 0.300.450.701.001.502.00金溶膠顏色藍(lán)灰紫灰紫紅紅橙紅 橙吸收峰(nm) 220240535525522518徑粒(nm) 14797.571.54124.515、檸檬酸三鈉鞣酸混合還原劑：用此混合還原劑可以得到比較滿意的金溶膠，操作方法如下：取 4ml檸檬酸三鈉 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入05ml鞣酸，05ml 25mmo/L K2CO2（體積與鞣酸加入量相等），以雙蒸餾水補(bǔ)至溶液最終體積為20ml，加熱至60取1ml的 HAuCl4，加于79

7、ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60，然后迅速將上述檸檬酸鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.51小時)后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。、白磷還原法：在120ml雙蒸餾水中加入1.5ml氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一飽和度的白磷乙醚溶液，混勻后室溫放置15分鐘，在回流下煮沸 直至紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。此法制得的膠體金直徑約 6nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實(shí)驗(yàn)室不宜采用。要得到大小更均勻的膠體金顆粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度離心，經(jīng)分級后制得膠體金顆粒直徑的

8、變異系數(shù)（）可小于。膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存膠體金具有很高的動力學(xué)穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時自身凝聚極慢，可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。 金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。當(dāng)金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，如ConA，過氧化物酶等，當(dāng)pH較低時保持穩(wěn)定，提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點(diǎn)或

9、略高時又變得穩(wěn)定了。標(biāo)記后的膠體金溶液可用0.20.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在410貯存數(shù)月有效，不宜冰凍。貯存中可能會發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。免疫膠體金的應(yīng)用、膠體金在電鏡水平的應(yīng)用膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應(yīng)用最廣泛。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過應(yīng)用不同大小的顆?；蚪Y(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為315nm 膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。315nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測，而直徑15nm 多用于檢測量較多的感染細(xì)胞。膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測。組織抗原的檢測。金標(biāo)記在

10、電鏡水平的應(yīng)用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負(fù)染色、雙標(biāo)記技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。 實(shí)驗(yàn)證明，該法樣本用量少、檢測速度快、對比明顯、操作簡單、敏感性和特異性高，既可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測，因此，可同時適用于科研和診斷。、膠體金在光鏡水平的應(yīng)用膠體金同樣可用做光鏡水平的標(biāo)記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細(xì)胞涂片、切片均可應(yīng)用。主要用于：用單克窿抗體或抗血清檢測細(xì)胞懸液或培養(yǎng)的單層細(xì)胞的膜表面抗原。檢測培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原，組織中或亞薄切片中抗原的檢測。 膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補(bǔ)其它標(biāo)記物不可避免的本底過高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點(diǎn)。 、膠體金在流式細(xì)胞儀中的應(yīng)用：應(yīng)

11、用熒光素標(biāo)記的抗體，通過流式細(xì)胞儀計數(shù)分析細(xì)胞表面抗原，是免疫學(xué)研究中的重要技術(shù)之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊，區(qū)分不同的標(biāo)記困難，因此必須尋找一種非熒光素標(biāo)記物，用于流式細(xì)胞計數(shù)。這樣可以同時進(jìn)行幾種標(biāo)記。該標(biāo)記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，因而可以作為流式細(xì)胞儀的標(biāo)記物之一。、凝集試驗(yàn)：單分散的免疫金溶膠呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當(dāng)與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，顆粒也會沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，這一原理可定性或定量地應(yīng)用于免疫反應(yīng)。、免疫印跡技術(shù)(immunoblotting)：免

12、疫印跡是一種較新的免疫化學(xué)技術(shù)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用酶免疫法（或免疫熒光、）進(jìn)行定量。免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后，再與經(jīng)葡萄球菌蛋白致敏的膠體金溫育，徹底洗去多余的膠體金，根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測知樣品中的特異性抗原。 利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強(qiáng)金顆粒的可見性，更可大大提高測定靈敏度，檢測下限可低至 0.1ng，這種免疫金銀染色法應(yīng)用已日趨廣泛。由于膠體金免疫印跡技術(shù)簡便、快速，且有相當(dāng)?shù)母叩撵`敏度，在臨床免疫診斷上有很大的應(yīng)用潛力。、膠體金在肉眼水平的應(yīng)用膠

13、體金取代傳統(tǒng)三大標(biāo)記物，用于肉眼水平的免疫檢測中。除了膠體金本身具有的特點(diǎn)外，還有以下優(yōu)點(diǎn)：試劑和樣本用量極小，樣本量可低至12ul；不需計數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測儀等貴重儀器，更適于現(xiàn)場應(yīng)用； 沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與；實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長期保存；時間大大縮短，提高了檢測速度。金標(biāo)過程中，無共價鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠體金的敏感性可達(dá)到 ELISA的水平。而結(jié)合銀染色時，檢測的敏感性更大大提高。膠體金在免疫層析快速診斷技術(shù)中的應(yīng)用免疫層析法(immunochromatograph

14、y)是近幾年來國外興起的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝 酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。早孕診斷用的免疫層析試紙條（通常又叫尿妊紙條）的裝配結(jié)構(gòu)見圖一。裝配方法：在塑料底板上分別將吸尿用玻璃纖維、凍干金標(biāo)記抗HCG玻璃纖維、已固定有抗HCG抗體的NC膜及硬質(zhì)吸水濾紙按圖裝配，配件與塑料底板的結(jié)合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成

15、寬 度為4mm的條狀，即為尿妊用紙條。本法檢測速度快，一般一兩分鐘可出結(jié)果；靈敏度高，可達(dá)50IU/L；好的試紙條結(jié)果也是準(zhǔn)確可靠的，這是其所以能在尿妊診斷中得到廣泛應(yīng)用的主要原因。尿妊試紙條的快速特性來源于膠體金免疫層析法的固有特性，但與原材料選擇特別是NC膜的孔徑大小密切相關(guān)，準(zhǔn)確性取決于抗HCG的特異性。金標(biāo)尿妊紙條雖然好用，但在使用中也必須注意以下幾個方面：一是溫度，試紙條雖然可在室溫保存，但大批暫時不用的試紙條還是應(yīng)該放在保存，以免抗體失效，從冰 箱剛?cè)〕龅脑嚰垪l則應(yīng)待其恢復(fù)至室溫，然后才打開密封，可避免反應(yīng)線模糊不清。二是正確操作，一般的操作方法是在試紙條的吸尿玻璃端滴入滴（約微升

16、）尿液，或?qū)⑽蚨酥苯硬迦霕?biāo)本中，深度約毫米秒，取出后平放，這種方法比較麻煩且容易造成污染。我們的方法是取尿標(biāo)本約0.5ml 加入小試管中，然后插入試紙條，待分鐘反應(yīng)帶清晰后觀察結(jié)果。膠體金在快速斑點(diǎn)滲濾技術(shù)中的應(yīng)用法在臨床實(shí)驗(yàn)室已得到普遍的應(yīng)用，特別是用于各型肝炎標(biāo)志物的檢測。但法由于操作程序復(fù)雜，時間較長，給實(shí)驗(yàn)室?guī)聿槐恪Ｒ虼顺霈F(xiàn)一步法快速檢測試劑盒，雖可提高檢測速度，但有出現(xiàn)假陰性結(jié)果的弊端。法需時較長的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗體）需經(jīng)擴(kuò)散才能與固相上的抗原或抗體反應(yīng)，不適當(dāng)?shù)乜s短反應(yīng)時間，將使靈敏度降至臨床要求以下。為滿足臨床快速檢測的需要，近年來發(fā)展了多種簡便、快速的免疫

17、學(xué)檢測方法，快速斑點(diǎn)滲濾法即為其中一種，其標(biāo)記物質(zhì)用膠體金即稱為快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法Dot-immunogold filtration assay)，又稱滴金免疫法?？焖侔唿c(diǎn)滲濾法的基本原理仍是間接法或夾心法。間接法測抗體：固定于膜上的特異性抗原標(biāo)本中的相應(yīng)抗體金標(biāo)記的抗抗體或顯色。夾心法測抗原：固定于膜上的多克隆抗體標(biāo)本中待測抗原金標(biāo)記的特異性單克隆抗體顯色。 結(jié)果判斷：快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法在操作完成后即可直接觀察結(jié)果。根據(jù)測定模式的不同可有以下不同的判定結(jié)果?？焖侔唿c(diǎn)免疫金滲濾法檢測速度快，結(jié)果觀察一目了然，已應(yīng)用于多種臨床檢測項目。以上分析可以看出，膠體金標(biāo)記技術(shù)是繼三大標(biāo)記技術(shù)之后，又

18、一較為成熟且已得到廣泛應(yīng)用的免疫標(biāo)記技術(shù)。 免疫膠體金制備、蛋白質(zhì)的處理：由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對低離子強(qiáng)度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對澄清無細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。 一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表面而減弱膠體金對蛋白質(zhì)的吸附。、蛋白質(zhì)最適用量的選擇：將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)儲存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質(zhì)540ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對照管，分鐘后加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置小時，不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋白

19、量再加10即為最佳標(biāo)記蛋白量。、標(biāo)記：在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下標(biāo)記是比較合適的，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大下述標(biāo)記步驟最為常見： 用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH(標(biāo)記時調(diào)到pH6.0)。于100ml 金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液（體積為ml），攪拌分鐘。加入5mlPEG20000溶液。于10000100000g離心3060分鐘（根據(jù)粒徑大小選擇不同離心條件），小心吸去上清液（切忌傾倒）。將沉淀懸浮于一定體積含0.20.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以 1cm/540

20、nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4保存。包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以含 0.1的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0。以上操作中應(yīng)注意，一切溶液中不應(yīng)含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預(yù)處理。膠體金是通過在氯金酸水溶液中加入還原劑使之還原并聚集形成膠體金粒子而形成的.使用不同種類,不同劑量的還原劑,可以控制所產(chǎn)生的粒子大小,即粒子的大小取決于反應(yīng)溶液中最初還原試劑和還原核的數(shù)量.還原劑濃度越高,核濃度也越高,氯金酸水溶液的還原也就從更多的還原中心開始,因此產(chǎn)生的

21、膠體金粒子數(shù)量越多,體積也越小.粒子直徑每增加1倍,數(shù)量減為原來的1/8.目前,制備膠體金的方法有許多種,根據(jù)時間的先后,依次為抗壞血酸還原法,檸檬酸三鈉還原法,乙醛超聲波還原法,放射性膠體金法,硼氫化鈉還原法,鞣酸-檸檬酸三鈉還原法,白磷還原法及白磷還原法的改良法和微波制備膠體金法.根據(jù)不同的制備方法,可以制備出直徑1 nm500 nm的膠體金粒子,但作為免疫標(biāo)記探針,其直徑一般在3 nm50 nm的范圍內(nèi).膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的原理，一般認(rèn)為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)呈電中性，此時蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大，處于一種微弱的水化

22、狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面，形成一個蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)，如果低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，二者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合。為防止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明膠作穩(wěn)定劑。用Sephacryb S400 （丙烯葡聚糖S400）層析分離純化膠體金蛋白標(biāo)記物只適用于以BSA作穩(wěn)定劑者。一、待標(biāo)記蛋白質(zhì)的準(zhǔn)備（1）透析除鹽：蛋白質(zhì)溶液內(nèi)應(yīng)除去多余的電解質(zhì)，不然過高的鹽類物質(zhì)會降

23、低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質(zhì)的吸附，因此，標(biāo)記之前必須徹底除鹽。一般將蛋白質(zhì)置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的鹽水（0.005mol/l NaCl , pH7.0）透析。（2）去除蛋白質(zhì)中的沉淀：長期低溫保存的蛋白質(zhì)或4較長時間保存的抗體，特別是在濃度高于2mg/ml的情況下，很容易形成聚合物，聚合物對標(biāo)記過程及免疫金探針的穩(wěn)定性有一定影響，因此，標(biāo)記之前須離心以除去這些聚合物。一般以100000r/min 4離心60min取上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至1mg./ml即可用于標(biāo)記。二、膠體金pH值的調(diào)整膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI）略偏

24、堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1n HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可。幾種常用的蛋白質(zhì)標(biāo)記時膠體金所用的pH值見表5-4。表5-4 常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時膠體金所用的pH值如下蛋白質(zhì)pH抗體（球蛋白）9.0親合層析的IgG7.6單克隆抗體8.2F（ab）27.2SPA(葡萄球菌蛋白)6.0蓖麻子植物凝血素8.0蓖麻子植物凝血素8.0花生凝集素6.3Helix pomatia lectin7

25、.4大豆凝集素6.1Lens Culinaris lectin6.9Lotus Tetragonolobus lectin6.3荊豆凝集素6.3Bandeirae simplicifolia lectin6.2過氧化物酶8.0類卵粘蛋白4.8血漿銅蘭蛋白7.0-胎球蛋白6.5小牛血清白蛋白6.5牛血清白蛋白5.5牛血球白蛋白結(jié)合肽4.5牛血清白蛋白結(jié)合胰島素5.3霍亂毒素6.9破傷風(fēng)毒素6.9DNAase6.0RNAase9.0低密度脂蛋白5.52-巨球蛋白6.0抗生物素蛋白（親合素）10.0鏈霉抗生物素蛋白6.6麥胚凝集素9.9三、待標(biāo)記蛋白質(zhì)最適穩(wěn)定量的測定（1）光電比色法：制備一系列不同

26、濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520580nm之間測定，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最適穩(wěn)定量為45g/ml。圖5-2蛋白最適穩(wěn)定量示意圖（2）目測法：以目測法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級稀釋后（由5g45g另設(shè)對照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯

27、化鈉，依表5-5順序進(jìn)行。表5-5 具體的做法是按表內(nèi)進(jìn)行管數(shù)12345678910膠體金（ml）1111111111蛋白質(zhì)（g）51015202530354045010%NaCl(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1當(dāng)分別加入0.1ml 10%氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。沒有加入蛋白質(zhì)的管為對照管。小于5nm顆粒的膠體金溶液，每個管內(nèi)應(yīng)加入5l33%的雙氧水，否則有不變藍(lán)色及聚沉現(xiàn)象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量最低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金

28、的必須蛋白量。在此基礎(chǔ)上再加上20%即為穩(wěn)定所需蛋白質(zhì)的實(shí)際用量。四、蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的最適穩(wěn)定量及標(biāo)記的最佳pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下：（1）根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量計算出所需要的待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。（2）在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（pH已調(diào)至PI超過0.5pH），加入蛋白質(zhì)時應(yīng)逐滴加入，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。（3）在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇（PEg MW20000）使其終濃度為0.05%, 我們對比了BSA和PEG穩(wěn)定膠體金的效果，BSA穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金，放在4達(dá)2年半仍然保持良好性

29、能，而用PEG穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金放在41年左右就有分層現(xiàn)象，而且染色效果顯著下降。因此，我們認(rèn)為最好還是用BSA作穩(wěn)定劑。（4）將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量，濃縮完畢后純化。離心法純化時，不要濃縮。五、膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化標(biāo)記好的免疫金探針必須經(jīng)過純化處理以后才能用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色。純化的目的是除去其中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)，未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過程中可能形成的各種聚合物。（一）調(diào)整與超速離心法（1）將標(biāo)記的大于10nm的膠體金溶液選用15000r/min 4離心15min，吸出上清，棄去沉淀，以去除大的聚合物。（2）一般在10nm以

30、上所標(biāo)記的膠體金均可在調(diào)整離心機(jī)上離心，小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機(jī)離心，在4離心1h左右，棄上清，將沉淀以原體積的0.02mol./l TBSpH8.2（內(nèi)含1%BSA，0.05%疊氮鈉）溶解，重復(fù)離心23次，沉淀溶于原體積的1/10TBS中。4保存?zhèn)溆谩榱说玫筋w粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用10%30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集不同大小顆粒的膠體金標(biāo)記蛋白制劑。幾種免疫金探針離心所用轉(zhuǎn)速（見表5-6），離心純化時所用轉(zhuǎn)速見表5-7，膠體金的OD值見表5-8。表5-6 幾種免疫金探針離心時所用轉(zhuǎn)速參考表膠體金顆粒直徑（nm）蛋白質(zhì)時間（min）轉(zhuǎn)速（r）3.0GAR IgG60300005.0GAR IgG502500010.0RAM IgG501900015.0SPA401700015.0ALcc IgG401700020.0SPA401300025.0SPA3512000說明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAm IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝細(xì)胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白表5-7 幾種免疫金探針離心純化時所用轉(zhuǎn)速膠體金顆粒（nm