水中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定

1、水中的細(xì)菌總數(shù)測(cè)定 1.培養(yǎng)基的配制2.消毒與滅菌3.水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定4.菌落計(jì)數(shù)法（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄒ唬?shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ?shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)器材（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）實(shí)驗(yàn)方法（四）實(shí)驗(yàn)方法（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄒ唬?shí)驗(yàn)?zāi)康? 1、明確培養(yǎng)基的配制原則；、明確培養(yǎng)基的配制原則；2 2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；3 3、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍；、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍；4 4、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾種常用滅菌、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾種常用滅菌方法。方法。（二）實(shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)

2、基培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物是按照微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的一所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的一種基質(zhì)。它包括碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、種基質(zhì)。它包括碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和水六類營(yíng)養(yǎng)要素。由于不同微生物細(xì)胞無(wú)機(jī)鹽和水六類營(yíng)養(yǎng)要素。由于不同微生物細(xì)胞組成不同，因而所需營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)不同，為了分離、組成不同，因而所需營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)不同，為了分離、培養(yǎng)和鑒定不同的微生物，必須根據(jù)其需要，配培養(yǎng)和鑒定不同的微生物，必須根據(jù)其需要，配制合適的培養(yǎng)基制合適的培養(yǎng)基. . 培養(yǎng)基的種類繁多，根據(jù)培養(yǎng)基的成分、物培養(yǎng)基的種類繁多，根據(jù)培養(yǎng)基的

3、成分、物理性狀不同，可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、理性狀不同，可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液半合成培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。體培養(yǎng)基。常用加熱滅菌法常用加熱滅菌法：1 1、干熱滅菌：、干熱滅菌： 用火焰燒灼或電熱干燥箱內(nèi)高溫?zé)峥諝鉁缇没鹧鏌苹螂姛岣稍锵鋬?nèi)高溫?zé)峥諝鉁缇? 2、濕熱滅菌、濕熱滅菌 高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法 間歇滅菌法間歇滅菌法 煮沸消毒法煮沸消毒法 滅菌滅菌是指應(yīng)用物理或化學(xué)的方法，殺滅物是指應(yīng)用物理或化學(xué)的方法，殺滅物體表面和內(nèi)部一切微生物營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢體表面和內(nèi)部一切微生物營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢子。滅菌方法很多

4、，可分為加熱、過(guò)濾、照子。滅菌方法很多，可分為加熱、過(guò)濾、照射和化學(xué)藥品法等。射和化學(xué)藥品法等。（三）實(shí)驗(yàn)器材（三）實(shí)驗(yàn)器材1.藥品和試劑：藥品和試劑：牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、NaClNaCl、1010NaOHNaOH溶液、溶液、1010鹽酸溶液。鹽酸溶液。2.器材：器材：天平、藥匙、瓷缸、玻璃棒、電爐、天平、藥匙、瓷缸、玻璃棒、電爐、 PHPH試紙、試管、三角瓶、分裝漏斗、牛皮紙、試紙、試管、三角瓶、分裝漏斗、牛皮紙、棉花、線繩、干燥箱、高壓鍋。棉花、線繩、干燥箱、高壓鍋。1.1.稱量稱量按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱量各成份放于瓷缸中。按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱量各成份放于瓷缸中。配方：牛肉膏

5、配方：牛肉膏5.0g,5.0g,蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g，NaCl5.0g,NaCl5.0g,瓊脂瓊脂20.0g,20.0g,蒸餾水蒸餾水1000ml,pH7.01000ml,pH7.0。（四）實(shí)驗(yàn)方法（四）實(shí)驗(yàn)方法 培養(yǎng)基的制備過(guò)程培養(yǎng)基的制備過(guò)程稱量稱量-溶解溶解-調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值值-過(guò)濾過(guò)濾- -分裝及包扎分裝及包扎-滅菌滅菌-滅菌后試管滅菌后試管擺放斜面擺放斜面2.2.溶解溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，攪拌，加熱使向上述瓷缸中加入所需要的水量，攪拌，加熱使其溶解。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂的熔化過(guò)其溶解。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂的熔化過(guò)程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使

6、培養(yǎng)基溢程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補(bǔ)足所失水分。出或燒焦。待完全熔化后，補(bǔ)足所失水分。 3.3.調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值值用玻璃棒沾少許液體，測(cè)量用玻璃棒沾少許液體，測(cè)量PHPH值。用氫氧化鈉和值。用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)鹽酸調(diào)節(jié)PHPH。4.4.過(guò)濾過(guò)濾用濾紙或多層紗布過(guò)濾，一般無(wú)特殊要求可省用濾紙或多層紗布過(guò)濾，一般無(wú)特殊要求可省去。去。5.5.分裝及包扎分裝及包扎根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)（用分裝漏斗）或三角瓶?jī)?nèi)，管（瓶）口管內(nèi)（用分裝漏斗）或三角瓶?jī)?nèi)，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮紙將棉塞部分包好。

7、塞上棉塞。最后用牛皮紙將棉塞部分包好。6.6.滅菌：滅菌：高壓蒸汽滅菌，高壓蒸汽滅菌，1211210 0C C滅菌滅菌2020分鐘。分鐘。7. 滅菌后試管擺放斜面滅菌后試管擺放斜面注注 意意 事事 項(xiàng)項(xiàng)1 1、稱取藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；、稱取藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；2 2、蛋白胨極易吸濕，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速；、蛋白胨極易吸濕，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速；2 2、配制固體培養(yǎng)基時(shí)，先將其他藥品加熱溶解到快沸時(shí)，再將稱好、配制固體培養(yǎng)基時(shí)，先將其他藥品加熱溶解到快沸時(shí)，再將稱好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱至瓊脂完全熔化，此過(guò)程要不斷攪拌，以免瓊的瓊脂加入，繼續(xù)加熱至瓊脂完全熔化，

8、此過(guò)程要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢；脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢； 4 4、分裝量根據(jù)試管大小和實(shí)際需要而定，固體培養(yǎng)基裝量約為管高、分裝量根據(jù)試管大小和實(shí)際需要而定，固體培養(yǎng)基裝量約為管高的的1/51/5，液體培養(yǎng)基的裝量約為管高的，液體培養(yǎng)基的裝量約為管高的1/41/4，三角瓶的裝量不超過(guò)瓶體，三角瓶的裝量不超過(guò)瓶體的的1/2 1/2 ； 5 5、分裝過(guò)程中注意不要將培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞、分裝過(guò)程中注意不要將培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。而引起污染。返返 回回（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)為什么濕熱滅菌比干熱滅菌法更有效？為什么濕熱

9、滅菌比干熱滅菌法更有效？消毒與滅菌消毒與滅菌 1干熱滅菌法干熱滅菌法 2高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 3紫外線滅菌法紫外線滅菌法（二）（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 1、原理、原理 利用加熱一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋，使滅菌利用加熱一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。由于蒸氣不能鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。 一般培養(yǎng)基用一般培養(yǎng)基用0.1Mpa，121.5,1530

10、min 2、步驟、步驟加水加水裝待滅裝待滅菌物品菌物品加蓋加蓋加熱加熱滅菌時(shí)間到后滅菌時(shí)間到后斷電源斷電源壓力降為零壓力降為零開(kāi)箱取物開(kāi)箱取物（三）紫外線滅菌法（三）紫外線滅菌法1 1、原理、原理 紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和腺嘧啶二聚體的形成和DNA DNA 鏈的交聯(lián)，從而鏈的交聯(lián)，從而抑制了抑制了DNA DNA 的復(fù)制。另一方面，由于輻射能的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成使空氣中的氧電離成OO，再使，再使O O2 2 氧化生成氧化生成臭氧或使水氧化生成臭氧或使水氧化生成H H2 2O O2 2。O O3 3 和和H

11、H2 2O O2 2 均有均有殺菌作用。殺菌作用。 適用于無(wú)菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空適用于無(wú)菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。氣及物體表面的滅菌。2 2、步驟、步驟 1 1）單用紫外燈）單用紫外燈 在無(wú)菌室內(nèi)或在接種箱內(nèi)打開(kāi)紫外線在無(wú)菌室內(nèi)或在接種箱內(nèi)打開(kāi)紫外線燈開(kāi)關(guān)，照射燈開(kāi)關(guān)，照射30min30min，將開(kāi)關(guān)關(guān)閉。，將開(kāi)關(guān)關(guān)閉。 2 2）化學(xué)消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用）化學(xué)消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用 在無(wú)菌室內(nèi)，先噴灑化學(xué)消毒劑溶液，在無(wú)菌室內(nèi)，先噴灑化學(xué)消毒劑溶液，再用紫外線燈照射再用紫外線燈照射15imn15imn水中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定一、水樣的采集一、水樣的采

12、集 1. 采水容器采水容器 采樣瓶：具磨口玻塞的采樣瓶：具磨口玻塞的500mL廣口瓶廣口瓶 采樣瓶的洗滌采樣瓶的洗滌 采樣瓶的滅菌采樣瓶的滅菌: 160170干熱滅菌干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽，或用高壓蒸汽滅菌器，滅菌器，121滅菌滅菌15min一、水樣的采集一、水樣的采集2. 采樣步驟及注意事項(xiàng)采樣步驟及注意事項(xiàng) (1)去氯和高濃度重金屬：滅菌前按去氯和高濃度重金屬：滅菌前按500mL采樣瓶加入采樣瓶加入0.3mL10%Na2S2O3溶液溶液 (2) 采集江、河、湖、庫(kù)等地表水樣時(shí)，可握住瓶子下部直接采集江、河、湖、庫(kù)等地表水樣時(shí)，可握住瓶子下部直接將已滅菌的帶塞采樣瓶插入水中，約距水面將已

13、滅菌的帶塞采樣瓶插入水中，約距水面1015cm處采集處采集 （3）采集一定深度的水樣時(shí)，可使用單層采水器或深層采水器）采集一定深度的水樣時(shí)，可使用單層采水器或深層采水器 （4）從自來(lái)水龍頭采集樣品時(shí)，采水前可先將水龍頭打開(kāi)至最）從自來(lái)水龍頭采集樣品時(shí)，采水前可先將水龍頭打開(kāi)至最大，放水大，放水35min，用酒精燈火焰灼燒約，用酒精燈火焰灼燒約3min滅菌滅菌 （5）在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免）在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾；同一采樣點(diǎn)與理化監(jiān)測(cè)項(xiàng)目同時(shí)采樣時(shí)，應(yīng)不同層次的攪擾；同一采樣點(diǎn)與理化監(jiān)測(cè)項(xiàng)目同時(shí)采樣時(shí)，應(yīng)先采集細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)樣品先采集

14、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)樣品 （6）采樣完畢，做好記錄）采樣完畢，做好記錄 二、樣品保存二、樣品保存 采好的水樣，應(yīng)迅速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)采好的水樣，應(yīng)迅速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)。一般從取樣到檢驗(yàn)不宜超過(guò)檢驗(yàn)。一般從取樣到檢驗(yàn)不宜超過(guò)2h，否則應(yīng)，否則應(yīng)使用使用10以下的冷藏設(shè)備保存樣品，但不得超以下的冷藏設(shè)備保存樣品，但不得超過(guò)過(guò)6h 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定 細(xì)菌總數(shù)：指細(xì)菌總數(shù)：指lmL水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)培養(yǎng)24h后，所生長(zhǎng)細(xì)菌菌落的總數(shù)后，所生長(zhǎng)細(xì)菌菌落的總數(shù)。 一、細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的意義一、細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的意義 可以反映水體有機(jī)污染的程度可以反映水體有機(jī)污染的程度 生活飲用水的細(xì)菌總數(shù)生活飲用水的細(xì)菌總數(shù)lmL不得超過(guò)不得超過(guò)100個(gè)個(gè) 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定二、培養(yǎng)基的制作二、培養(yǎng)基的制作 三、測(cè)定方法及步驟三、測(cè)定方法及步驟 1.稀釋水樣稀釋水樣2.接種水樣接種水樣3.培養(yǎng)：培養(yǎng)：37下倒置培養(yǎng)下倒置培養(yǎng)24h24h 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定水樣225mL無(wú)菌水25mL1mL1mLckck10-110-110-210-210-310-31mL1mL1mL1mL1mL1mL三、菌落計(jì)數(shù)三、菌落計(jì)數(shù) 3724h 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總