實驗一動物肝臟組織中基因組DNA提取和鑒定

1、1實驗一實驗一 動物肝臟組織基因組動物肝臟組織基因組DNADNA的提取的提?。ǜ啕}法）（高鹽法）2核酸的分類核酸的分類l DNADNA ( (脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸) ) 主要存在于細胞核的染色體中。主要存在于細胞核的染色體中。 核外也有少量核外也有少量DNADNA，如線粒體，如線粒體DNADNA（mtDNAmtDNA），葉），葉綠體綠體DNADNA（cpDNAcpDNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNADNA。l RNARNA（核糖核酸）（核糖核酸） 存在于細胞質(zhì)中，如存在于細胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外

2、，還有非細胞形式存在的病毒和外，還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含噬菌體，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。3核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)l在細胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復合物形式存在。在細胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復合物形式存在。l溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑。溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑。l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。l在強大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來。在強大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來。4l 濃鹽法濃鹽法：利用：利用RNARNA和和DNADNA在不同鹽濃度溶液中的

3、溶解在不同鹽濃度溶液中的溶解度不同將二者分離。度不同將二者分離。l離子去污劑法離子去污劑法：利用：利用SDSSDS、CTABCTAB（十六烷基三甲基溴化（十六烷基三甲基溴化銨）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，直接從生物材料中提取銨）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，直接從生物材料中提取DNADNA。l 苯酚抽提法苯酚抽提法：苯酚既是蛋白變性劑，又能抑制：苯酚既是蛋白變性劑，又能抑制DNaseDNase的的降解。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與降解。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNADNA連接鍵已連接鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚

4、相，而蛋白分子溶于酚相，而DNADNA溶于水相。溶于水相?；蚪M基因組DNA的提取方法的提取方法5核酸提取的主要步驟核酸提取的主要步驟 破碎細胞破碎細胞：研磨、組織勻漿、超聲、凍融；異硫氰酸胍、：研磨、組織勻漿、超聲、凍融；異硫氰酸胍、堿裂解；酶解（溶菌酶）堿裂解；酶解（溶菌酶） 除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子：酚酚/ /氯仿抽提、蛋白變性劑（氯仿抽提、蛋白變性劑（SDSSDS、異硫氰酸胍等）、蛋、異硫氰酸胍等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌白酶處理、高鹽洗滌 除去其它不需要的核酸分子除去其它不需要的核酸分子 沉淀核酸沉淀核酸，去除鹽類

5、，有機溶劑等雜質(zhì)，去除鹽類，有機溶劑等雜質(zhì)6注意事項注意事項 避免過酸、過堿及高溫避免過酸、過堿及高溫 加入加入DNADNA酶抑制劑：檸檬酸、氰化物、砷酸鹽、酶抑制劑：檸檬酸、氰化物、砷酸鹽、EDTAEDTA、SDSSDS、苯酚等、苯酚等 蛋白變性劑反應(yīng)不宜過于劇烈蛋白變性劑反應(yīng)不宜過于劇烈 加入加入RNARNA降解酶除降解酶除RNARNA7 學習并掌握用學習并掌握用高高鹽法從動物肝臟組織中的提鹽法從動物肝臟組織中的提取基因組取基因組DNA方法及其原理。方法及其原理。一、實驗一、實驗?zāi)康哪康?二、實驗原理二、實驗原理 核酸在真核細胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存核酸在真核細胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合

6、的狀態(tài)存在，用在，用DNPDNP和和RNPRNP表示。表示。 DNA-ProDNA-Pro（DNPDNP） ( (存在于細胞核存在于細胞核) ) RNA-Pro(RNP)RNA-Pro(RNP) ( (存在于核仁及細胞質(zhì)存在于核仁及細胞質(zhì)) )l溶于高鹽溶液（溶于高鹽溶液（1mol/L1mol/L）, , 微溶于低鹽溶液（微溶于低鹽溶液（0.14mol/L0.14mol/L）l溶于低鹽溶液（溶于低鹽溶液（0.14mol/L0.14mol/L） 微溶于高鹽溶液（微溶于高鹽溶液（1mol/L1mol/L）9三、儀器和試劑三、儀器和試劑1、儀器、儀器： 低速離心機、落地式高速冷凍離心機、搖床、穩(wěn)低速

7、離心機、落地式高速冷凍離心機、搖床、穩(wěn)壓電源、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)。壓電源、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)。2、試劑、試劑： 0.14mol/L NaCl0.15mol/L EDTA(pH=8.0)；2.5mol/L NaCl；25% SDS；氯仿；氯仿/異戊醇異戊醇=24:1（V/V）；）；95%乙醇；乙醇；1TAE；瓊脂糖；上樣緩沖液。；瓊脂糖；上樣緩沖液。10四、實驗步驟四、實驗步驟1 1、DNADNA的提取的提取 （1 1）稱?。┓Q取5g5g雞肝，置于預冷的研缽中，在冰浴中剪碎，加雞肝，置于預冷的研缽中，在冰浴中剪碎，加入入10mL10mL預冷的預冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol

8、/L EDTA0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，研溶液，研磨成勻漿液。磨成勻漿液。 （2 2）將勻漿液加入到）將勻漿液加入到15mL15mL刻度離心管中，刻度離心管中，2000r/min2000r/min離心離心10min10min，棄去上清液。，棄去上清液。 （3 3）將將沉淀沉淀轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至50mL50mL離心管中，離心管中，加入加入10mL10mL預冷的預冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，溶液，充分搖勻充分搖勻后，于后，于4 4 2000r/min2000r/min離

9、心離心10min10min，棄去上清液。，棄去上清液。11四、實驗步驟四、實驗步驟1 1、DNADNA的提取的提取 （4 4）將上述沉淀轉(zhuǎn)移至）將上述沉淀轉(zhuǎn)移至100mL100mL錐形瓶中，加入錐形瓶中，加入10mL10mL預冷的預冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，緩慢攪拌，同時加溶液，緩慢攪拌，同時加入入750uL 25%SDS750uL 25%SDS溶液，用封口膜封口，置于搖床中，溶液，用封口膜封口，置于搖床中，3 30 0 150r/min150r/min震蕩震蕩30min30min。 （5 5）

10、加入）加入7 7mL mL 2. 2.5mol/L NaCl5mol/L NaCl，用封口膜封口，置于搖床中，用封口膜封口，置于搖床中，3 30 150r/min0 150r/min震蕩震蕩10min10min。 。 （6 6）再加入）再加入1 17 7mL mL 氯仿氯仿: :異戊醇溶液，用封口膜封口，置于異戊醇溶液，用封口膜封口，置于搖床中，搖床中，30 130 150r/min50r/min震蕩震蕩20min20min。 。12四、實驗步驟四、實驗步驟1 1、DNADNA的提取的提取 （7 7）將混合液轉(zhuǎn)移至）將混合液轉(zhuǎn)移至50mL50mL刻度離心管中，刻度離心管中， 3500r/min

11、 3500r/min離心離心10min 10min ，取上清至一個新的，取上清至一個新的50mL50mL刻度離心管?？潭入x心管。 （8 8）加入）加入20mL95%20mL95%乙醇溶液，上下顛倒混勻后，乙醇溶液，上下顛倒混勻后，出現(xiàn)絲狀出現(xiàn)絲狀物，用槍頭挑取絲狀物，或者物，用槍頭挑取絲狀物，或者3500r/min3500r/min離心離心5min 5min 。 （9 9）棄去上清液（）棄去上清液（注意：緩慢倒去上清液注意：緩慢倒去上清液），沉淀物質(zhì)即），沉淀物質(zhì)即為為DNADNA，空氣干燥后即可加入適量的，空氣干燥后即可加入適量的TETE緩沖液。緩沖液。13四、實驗步驟四、實驗步驟2 2、D

12、NADNA電泳檢測電泳檢測 （1 1）1%1%瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠：稱?。悍Q取0.3g0.3g瓊脂糖，加入瓊脂糖，加入30mL 130mL 1TAETAE緩沖液，在微波爐中加熱，反復加熱、振蕩緩沖液，在微波爐中加熱，反復加熱、振蕩2-32-3次，使瓊次，使瓊脂糖充分融化。待凝膠冷卻至脂糖充分融化。待凝膠冷卻至6060左右，倒入插入梳子的左右，倒入插入梳子的凝膠板中（避免產(chǎn)生氣泡），讓凝膠自然凝固。凝膠板中（避免產(chǎn)生氣泡），讓凝膠自然凝固。 （2 2）待凝膠凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右搖晃，）待凝膠凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右搖晃，以免破壞膠面及加樣孔，小心將凝膠和膠床放入電泳槽中，

13、以免破壞膠面及加樣孔，小心將凝膠和膠床放入電泳槽中，加樣孔靠近陰極的一端。加樣孔靠近陰極的一端。 （3 3）上樣電泳上樣電泳：將適量：將適量DNADNA樣品溶液和上樣緩沖液混勻后，樣品溶液和上樣緩沖液混勻后，上樣，上樣，100V100V電泳檢查，根據(jù)指示劑遷移的位置，電泳檢查，根據(jù)指示劑遷移的位置，14四、實驗步驟四、實驗步驟2 2、DNADNA電泳檢測電泳檢測 （3 3）上樣電泳上樣電泳：將適量：將適量DNADNA樣品溶液和上樣緩沖液混勻后，樣品溶液和上樣緩沖液混勻后，上樣，上樣，6 60V0V穩(wěn)壓電泳檢查，根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷穩(wěn)壓電泳檢查，根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否中止電泳。切斷電源后，再取出凝膠。是否中止電泳。切斷電源后，再取出凝膠。 （4 4）照膠、拍照照膠、拍照：將凝膠泡在：將凝膠泡在EBEB溶液（溶液（注意：注意：EBEB溶液為溶液