結(jié)直腸癌RAS檢測指南

1、結(jié)直腸癌 RAS 檢測指南2015-03-13 15:27來源：丁香園作者：月下荷花字體大小-|+結(jié)直腸癌是英國發(fā)生率最高的癌癥之一，每年新診斷 4 萬例，5 年生存率 55%，只有 23% 轉(zhuǎn)移病人有治療前分期數(shù)據(jù)，15% 的病人雖然接受了手術(shù)治療，但是仍然會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌治療的一個重要發(fā)展步驟是單克隆抗體的出現(xiàn)，它能靶向抑制 EGFR。單克隆抗體治療包括西妥昔單抗、貝伐單抗和帕尼單抗?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)明確表明 KRAS 突變結(jié)直腸癌抗 EGFR 治療無效。早期數(shù)據(jù)限于 KRAS 密碼子 12 和 13，能夠預(yù)測西妥昔單抗治療是否無效，NICE 推薦該研究結(jié)果用于實(shí)際工作中。西妥昔單抗只能用

2、于肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，在確定病人是否適合該治療時應(yīng)進(jìn)行 KRAS 密碼子 12 和 13 突變檢測。本指南里沒有推薦一線化療后進(jìn)展的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌病人使用 EGFR 抑制劑，雖然已有結(jié)果支持這樣使用。KRAS 檢測已成為常規(guī)項(xiàng)目，幫助分層病人是否適合抗 EGFR 治療。英國之外的其它組織也推薦結(jié)直腸癌治療時要進(jìn)行 KRAS 基因的檢測。Wong 醫(yī)生在 JCP 雜志上發(fā)文，文章主要用于指導(dǎo)英國的臨床實(shí)踐工作，文中還涉及結(jié)直腸癌 NRAS 的檢測，對影響結(jié)直腸癌 RAS 檢測的技術(shù)和研究內(nèi)容也進(jìn)行了回顧，文中特別強(qiáng)調(diào)的是檢測的實(shí)用意義。文章內(nèi)容順序按照 RAS 標(biāo)本檢測程序進(jìn)行。病例選擇常規(guī)檢測還

3、是按需檢測結(jié)直腸癌癥 RAS 檢測是常規(guī)檢測還是按需檢測仍有爭議。常規(guī)檢測模式指所有手術(shù)切除標(biāo)本都常規(guī)行基因檢測，在病理報(bào)告上描述結(jié)果。未來某個時候如果病人需要抗 EGFR 治療，這些分子數(shù)據(jù)立刻可以使用。常規(guī)檢查可以很好解決過長的 KRAS 基因檢測時間。檢測時間過長并不是分析方法造成的，大部分時間用于篩選合適的組織。常規(guī)檢測還會避免出現(xiàn)因組織塊丟失、組織塊保存不當(dāng)受損或者因用于其它檢查而不能進(jìn)行 RAS 檢查。常規(guī)檢查缺點(diǎn)是對那些永遠(yuǎn)不發(fā)展為轉(zhuǎn)移的病人，做這種檢查是不必要的。減少不必要檢查的方法就是找出具有高危轉(zhuǎn)移因素的結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行檢測，例如存在血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者是病理 T4 分

4、期。常規(guī)檢查最大缺點(diǎn)是，新數(shù)據(jù)表明 RAS 不只是 KRAS 密碼子 12 和 13 突變。如果病人擬接受抗 EGFR 治療，之前曾經(jīng)接受過 KRAS 密碼子 12 和 13 檢查，那么現(xiàn)在這個病人還要接受 NRAS 突變和附加 KRAS 突變檢測。近期研究表明，更多基因與抗 EGFR 治療耐藥有關(guān)，新靶向治療不斷出現(xiàn)。按需檢查是病例經(jīng)過多學(xué)科組討論后決定接受相關(guān)治療時才會進(jìn)行的檢查。撰寫本文時，英國的實(shí)驗(yàn)室給結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移病人做 RAS 檢測保險(xiǎn)才給予賠付，這意味著在英國按需檢測已經(jīng)成為主流實(shí)踐方式。為了在英國能夠更好地實(shí)現(xiàn) RAS 檢測，應(yīng)該對現(xiàn)有資源進(jìn)行合理分布，建立更合理的檢測系統(tǒng)，改善

5、結(jié)直腸癌組織送檢途徑，確保及時送達(dá)標(biāo)本進(jìn)行按需檢測。原發(fā)還是轉(zhuǎn)移組織很多研究都在探討 KRAS 突變在原發(fā)或是轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中是否一致。一項(xiàng) meta 分析顯示一致性非常高，達(dá) 94.1%。然而也有一些數(shù)據(jù)表明這種一致性與解剖位置有關(guān)，肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶一致性較差。上述的 meta 分析中也表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和原發(fā)結(jié)直腸癌的一致性是 81.3%。由于原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶缺少絕對的遺傳學(xué)一致性，如果可以獲取轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織，并能將組織盡快送達(dá)檢測實(shí)驗(yàn)室，那么對轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行檢測是優(yōu)先的。如果轉(zhuǎn)移組織很不容易獲取，就送檢原發(fā)位置的組織，因?yàn)榻刂聊壳盀橹箾]有充足證據(jù)說明轉(zhuǎn)移灶組織 RAS 基因檢測更具

6、特異性。標(biāo)本類型組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本都可以用作 RAS 檢測，包括使用 HE 染色或是免疫組化染色的切片標(biāo)本。一些標(biāo)本例如內(nèi)鏡或粗針活檢標(biāo)本，由于標(biāo)本獲取技術(shù)導(dǎo)致標(biāo)本有限，如果是切除標(biāo)本就可以有多個腫瘤組織標(biāo)本可用，但通常只選擇一個具有代表性的組織標(biāo)本進(jìn)行檢查。有限的標(biāo)本引發(fā)了一些需要思考的內(nèi)容。只含有腺瘤的活檢標(biāo)本第一種是如果病人臨床和影像學(xué)證據(jù)清楚顯示患有結(jié)直腸癌，但內(nèi)鏡活檢標(biāo)本卻只有腺瘤，而且該標(biāo)本是唯一可用于 RAS 檢測標(biāo)本。這時應(yīng)怎么做？有人認(rèn)為不應(yīng)檢測腺瘤標(biāo)本，應(yīng)對原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶重新活檢；另一些人認(rèn)為應(yīng)檢測腺瘤，一旦鑒定突變應(yīng)報(bào)告，若沒有突變，也不能證明腫瘤沒有突變，仍需重新活檢

7、。第二種方法是基于 RAS 基因突變通常發(fā)生在腫瘤形成早期階段，且是關(guān)鍵驅(qū)動突變，證明腺瘤中存在 RAS 突變，表明從腺瘤發(fā)展來的結(jié)直腸癌也可能有該突變。然而 RAS 突變也可能是結(jié)直腸癌發(fā)生晚期事件，也就是說腺瘤可能是 RAS 野生型，而腺癌則可能是 RAS 突變型。第三種方法與第二種相似，對具有高級別異型增生的腺瘤進(jìn)行檢測，高級別異型增生是更接近癌癥的一種狀態(tài)。腫瘤內(nèi)突變的異質(zhì)性另一個問題是若有多個切除標(biāo)本供選擇，究竟選哪一個？這個主題涉及腫瘤突變異質(zhì)性，即同一結(jié)直腸癌中不同克隆的基因表型可能不一致。內(nèi)鏡標(biāo)本通常是有限和表淺標(biāo)本，若突變克隆位于腫瘤深部，可能檢測不到；如果是切除標(biāo)本，突變克

8、隆只存在于某個特定組織塊內(nèi)，也可能檢測不到。根據(jù)最新 KRAS 和 NRAS 數(shù)據(jù)，通常認(rèn)為只要存在任何一種 RAS 突變，就足以預(yù)測抗 EGFR 治療耐藥。如果超過一種以上 RAS 突變共存于同一結(jié)直腸癌內(nèi)，也不會有更多的臨床意義。更具臨床意義的是同一腫瘤內(nèi)既有 RAS 突變型克隆又有野生型克隆，特別是突變克隆比例很低的時候。后者指的是一種低水平突變，原因可能是結(jié)直腸癌 DNA 抽提物中只有一小部分 RAS 突變基因，這需要與組織塊中惡性腫瘤細(xì)胞含量低導(dǎo)致非惡性腫瘤細(xì)胞 DNA 稀釋突變基因這種情況鑒別。一些數(shù)據(jù)顯示，同一結(jié)直腸癌組織內(nèi)還存在 KRAS 基因型變化。小部分結(jié)直腸癌是野生型和

9、KRAS 外顯子 2 和 3 突變克隆的混合，這種基因型的變化很小：10/13 標(biāo)本中，某一特定 KRAS 突變克隆超過腫瘤 80%。最近一項(xiàng)研究使用高分辨率溶解曲線分析檢查 30 例配對內(nèi)鏡標(biāo)本和切除標(biāo)本的 KRAS 突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每對標(biāo)本基因型完全一致。更敏感方法回顧分析野生型結(jié)直腸癌是否有更低水平 KRAS 突變，此水平突變對抗 EGFR 治療是否有影響。Sanger 測序或 real time-PCR 鑒定的野生型結(jié)直腸癌，7%-20% 病例經(jīng)焦磷酸測序、Therascreen 檢查包、鎖定核酸 PCR 或突變擴(kuò)增 PCR 再次檢查，發(fā)現(xiàn) KRAS 密碼子 12 和 13 突變，此種水

10、平 KRAS 突變結(jié)直腸癌抗 EGFR 治療是否有效仍需研究。更敏感檢查方法出現(xiàn)后，腫瘤內(nèi)突變異質(zhì)性研究可能會有特別進(jìn)展，目前臨床工作可按指南規(guī)定進(jìn)行。如果既有切除標(biāo)本又有活檢標(biāo)本可用，檢測時應(yīng)優(yōu)選組織塊；如果只有活檢組織可用，結(jié)果是野生型基因型，現(xiàn)在沒有充足證據(jù)支持再次活檢排除低水平突變。突變檢查不僅僅影響治療選擇，更重要的是低水平突變的存在可能是預(yù)測未來抗 EGFR 治療耐藥的標(biāo)志。通常認(rèn)為這些突變克隆開始時量少，但抗 EGFR 治療促使突變克隆過度生長，當(dāng)量足夠充足時表現(xiàn)為對治療耐藥。準(zhǔn)備工作中的影響因素已有綜述文章詳細(xì)描述組織標(biāo)本制備過程中哪些因素會影響后續(xù)的分子檢測結(jié)果，以下內(nèi)容與結(jié)

11、直腸癌的 RAS 檢測關(guān)系特別密切。大部分用作 RAS 突變檢測的結(jié)直腸癌組織來自福爾馬林固定的活檢標(biāo)本或是手術(shù)切除的原發(fā)腫瘤。后者標(biāo)本固定通常會延遲或固定效果不好，主要由于大腸沒有被完全剖開或是沒有沖洗干凈，或是只取材了部分固定的標(biāo)本。延遲或固定效果不好，導(dǎo)致 DNA 因?yàn)榈蛲龌蚴菈乃蓝到猓栺R林浸泡過長也使 DNA 由于過度交聯(lián)而降解。DNA 質(zhì)量不合格，降低了檢測突變敏感性，增加失敗幾率。福爾馬林固定還可以致胞嘧啶脫氨基，導(dǎo)致檢測到人為因素所致的突變。在英國 Bouin 固定液通常不再使用，較早期的組織塊可能由 Bouin 固定。需要小心的信號是組織塊內(nèi)組織完全變成黃色或是組織中含有

12、 DNA 抽提過程中的洗脫液。以 Bouin 固定的組織行分子檢測時失敗幾率較高，部分由于組織保存時間過長，還有就是 Bouin 固定液中一些成分能加速核酸降解。一些醫(yī)院固定內(nèi)鏡活檢標(biāo)本前習(xí)慣先將標(biāo)本錨定在醋酸帶上，如果不去除醋酸帶會導(dǎo)致 DNA 產(chǎn)量更低。記錄腫瘤細(xì)胞含量對分子學(xué)分析來說是恰當(dāng)?shù)?。組織被做成切片或是直接切取用于 DNA 抽提，沒有技術(shù)差別，切取后組織應(yīng)盡快 DNA 提取以減少 DNA 氧化。惡性腫瘤細(xì)胞含量當(dāng)體突變組織中既包含有惡性細(xì)胞又含有非惡性細(xì)胞時，精確定量惡性腫瘤細(xì)胞含量很關(guān)鍵。在最后的 DNA 提取物中惡性腫瘤細(xì)胞 DNA 所占的比例能很好地反應(yīng)組織病理學(xué)惡性核酸占

13、所有核酸的比例，優(yōu)于用腫瘤所占面積的比例進(jìn)行衡量。這一點(diǎn)對結(jié)直腸癌特別重要，壞死和無細(xì)胞區(qū)域不應(yīng)該被計(jì)算在內(nèi)，應(yīng)當(dāng)將其盡可能去除。腫瘤中非整倍染色體很常見，可能潛在增加或減少檢測敏感性。本文推薦，用于檢測突變的最少腫瘤細(xì)胞含量應(yīng)是檢測最低腫瘤細(xì)胞含量的二倍。例如某種方法檢測要求腫瘤細(xì)胞最低含量 5%，突變檢查時最少需要組織中含有 10% 的惡性細(xì)胞比較合適。觀察者評估結(jié)直腸癌中腫瘤細(xì)胞含量時會有變化，所以實(shí)驗(yàn)室希望使用一個安全的最小腫瘤細(xì)胞含量進(jìn)行分析，但這個比例仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。分析方面分析方法選擇在英國很多分析方法用于 KRAS 檢測，NHS 實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的分析包括 house 焦磷酸分析

14、法、COBAS、Therascreen 焦磷酸法或 RGQ 包、Sanger 測序和 HRM 分析，已有研究比較不同分析方法的特點(diǎn)。各種分析方法已做詳細(xì)闡述，NICE 診斷評估程序中也進(jìn)行了分析，相關(guān)文章即將發(fā)表（表 1）表 1. 較常應(yīng)用的 RAS 檢查方法特征比較分析方法的選擇也許會受最新研究結(jié)果影響，即任何 RAS 突變足以預(yù)測抗 EGFR 治療耐藥。所以未來檢測方法的重點(diǎn)要放在 RAS 檢測上，而不僅僅只是 KRAS。分析方法的確認(rèn)RAS 分析方法中的幾個方面在真正用于臨床前應(yīng)進(jìn)一步確證。首先要明確，檢查突變時所需最少腫瘤細(xì)胞含量。另外分析的準(zhǔn)確性和精確性也需要進(jìn)行評估和記錄。第三，確

15、證所需要的臨床標(biāo)本數(shù)量依賴于統(tǒng)計(jì)功效。目前推薦序列分析法用作金標(biāo)準(zhǔn)方法。檢測失敗大多數(shù)結(jié)直腸癌 RAS 檢測失敗都是由分析前因素所致，如 DNA 模板數(shù)量不足或質(zhì)量較差。影響模板數(shù)量原因包括標(biāo)本大小、大體切除程度、惡性組織比例。如果蠟塊中惡性組織不充足，就需要進(jìn)一步獲取。矛盾的是如果有太多的模板也可能導(dǎo)致失敗，這時只需稀釋就可以獲得成功。影響模板質(zhì)量因素包括固定相關(guān)的降解，是檢查失敗的主要原因，尤其是當(dāng)擴(kuò)增片段較大時。當(dāng)檢測失敗時應(yīng)當(dāng)對分析技術(shù)進(jìn)行評估，如果有可能應(yīng)對標(biāo)本采用其它方法進(jìn)行分析。報(bào)告與解釋指導(dǎo)靶向治療的最小 KRAS 含量已有明確推薦（表 2）。最近的爭論是否 KRAS 密碼子

16、13 突變對抗 EGFR 治療耐藥影響較小。表 2. 用于指導(dǎo) EGFR 治療的最小 RAS 含量新數(shù)據(jù)表明 KRAS 密碼子 12 和 13 野生型時，KRAS 密碼子 59、61、117 和 146 或 NRAS 密碼子 12、13、59 和 61 仍可預(yù)測抗 EGFR 治療耐藥。NRAS 密碼子 117 和 146 突變無影響。本文推薦 RAS 檢測至少應(yīng)包括 KRAS 密碼子 12、13、59、61、117、146 和 NRAS 密碼子 12、13、59、61。質(zhì)量控制內(nèi)部因素為了驗(yàn)證分析的精確性，應(yīng)該向?qū)嶒?yàn)室提供是否需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。大多數(shù) RAS 分析精確度高，有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)室使用時不需

17、要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。同樣原因，不需要使用不同方法進(jìn)行驗(yàn)證，當(dāng)然如果一種檢測方法失敗，需要有另一種方法進(jìn)行檢測，該方法和一線方法一樣提供同樣的檢測精確度。應(yīng)當(dāng)記錄檢測失敗的比例，并分析每一次失敗的可能原因。推薦每一批標(biāo)本分析時都應(yīng)設(shè)置最低陽性對照和陰性對照。檢查是為了能夠鑒定最低水平的突變，因此推薦用 DNA 含量已知的標(biāo)本鑒定所需最低標(biāo)本含量。外部因素任何一個提供 RAS 檢測的實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該包括外部質(zhì)量保證程序，實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)當(dāng)有授權(quán)。另外鼓勵實(shí)驗(yàn)室參與標(biāo)本互換程序，允許其它實(shí)驗(yàn)室對同一標(biāo)本進(jìn)行交叉分析，特別是當(dāng)標(biāo)本檢測失敗時。審計(jì)標(biāo)準(zhǔn)審計(jì)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)遵循既往數(shù)據(jù)，如所有結(jié)直腸癌病例中 KRAS 外顯子 2

18、突變應(yīng)在 40%，KRAS 外顯子 3 或 4 突變應(yīng)在 6%，NRAS 外顯子 2 或突變應(yīng)在 3%。上述數(shù)據(jù)來自總?cè)巳悍治鼋Y(jié)果。進(jìn)一步的數(shù)據(jù)如不同病人、不同腫瘤特征是否會影響結(jié)果需進(jìn)一步研究。檢測時間大多數(shù) RAS 檢測都是按需檢測，所以檢測時間很關(guān)鍵，通常對檢測時間有幾個定義，從檢測實(shí)驗(yàn)室收到檢測組織到最后發(fā)出報(bào)告的時間是比較認(rèn)可的檢測時間。本文推薦 KRAS 密碼子 12 和 13 檢測時間是 7 個工作日。但是關(guān)于 RAS 檢測的要求越來越多，所以時間可能也會更長。通常大部分實(shí)驗(yàn)室會先檢測突變發(fā)生率最高的密碼子，如果是野生型再對其它密碼子進(jìn)行檢測。還有一種方法就是對所有 RAS 密碼子同時進(jìn)行檢測。前者通?；ㄙM(fèi)的時間較長，對需要立即決定治療方案的病人可能會延遲治療，因此推薦 90% 以上的標(biāo)本檢測時間應(yīng)小于 7 個工作日。未來的發(fā)展很多研究顯示野生型