藥殘檢測原理ppt課件

1、藥物殘留檢測的根本原理藥物殘留檢測的根本原理王玉峰王玉峰2019.042019.04:藥物殘留藥物殘留 主要包括農(nóng)藥殘留和獸藥殘留、真菌毒素。主要包括農(nóng)藥殘留和獸藥殘留、真菌毒素。農(nóng)藥殘留農(nóng)藥殘留 在農(nóng)業(yè)消費(fèi)中施用農(nóng)藥后一部分農(nóng)藥直接或間接殘在農(nóng)業(yè)消費(fèi)中施用農(nóng)藥后一部分農(nóng)藥直接或間接殘存于谷物、蔬菜、果品存于谷物、蔬菜、果品 、畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品以及土壤和、畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品以及土壤和水體中的景象。如滴滴涕，毒死蜱，馬拉硫磷等。水體中的景象。如滴滴涕，毒死蜱，馬拉硫磷等。獸藥殘留獸藥殘留 是指用藥后蓄積或存留于畜禽機(jī)體或產(chǎn)品是指用藥后蓄積或存留于畜禽機(jī)體或產(chǎn)品( (如雞蛋、如雞蛋、奶品、肉品等奶品、肉

2、品等) )中原型藥物或其代謝產(chǎn)物。如氯霉素，中原型藥物或其代謝產(chǎn)物。如氯霉素，克倫特羅，硝基呋喃等。克倫特羅，硝基呋喃等。:真菌毒素真菌毒素黃曲霉素：黃曲霉素：B1、M1、B2、M2、G1、G2桔霉素：桔霉素：展青霉素：展青霉素：玉米赤霉類：玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇、玉米赤霉類：玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇、-玉米赤霉醇、玉米赤霉烷酮玉米赤霉醇、玉米赤霉烷酮其它其它孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫糖皮質(zhì)激素：潑尼松龍、甲基潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、可糖皮質(zhì)激素：潑尼松龍、甲基潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、可的松、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、

3、醋酸氟氫可的松的松、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氫可的松雌激素類：己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚雌激素類：己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚:獸藥殘留檢測方法獸藥殘留檢測方法 酶聯(lián)免疫法：各種試劑盒酶聯(lián)免疫法：各種試劑盒 液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀：液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀：LC-MS/MS，三重四級桿質(zhì)譜儀、雜合，三重四級桿質(zhì)譜儀、雜合三重四級桿三重四級桿(QTRAP) 試紙條：試紙條： 微流控芯片：微流控芯片： 微生物抑制法：微生物抑制法： 高效液相色譜高效液相色譜:第一部分第一部分 酶聯(lián)免疫技術(shù)在藥殘檢測和酶聯(lián)免疫技術(shù)在藥殘檢測和 病毒抗體檢測中的運(yùn)用病毒抗體檢測中的運(yùn)用:酶聯(lián)免疫檢測的原理酶聯(lián)免疫檢測的原理使抗

4、原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并堅持其免疫活性。使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并堅持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶銜接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體使抗原或抗體與某種酶銜接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保管其免疫活性，又保管酶的活性。既保管其免疫活性，又保管酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本測定其中的抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體在測定時，把受檢標(biāo)本測定其中的抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗滌的方法使固按不同的步驟與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗滌的方法使固相載體上構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體相載體上構(gòu)

5、成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。參與酶反響的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本參與酶反響的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反響的深淺定性或定量分析。中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反響的深淺定性或定量分析。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高(ppb) 操作步驟易掌握；操作步驟易掌握；缺乏：有些試劑盒價錢昂貴缺乏：有些試劑盒價錢昂貴 易出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)反復(fù)易出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)反復(fù):酶聯(lián)免疫檢測獸藥殘留的方法類型酶聯(lián)免疫檢測獸

6、藥殘留的方法類型三種必要的試劑：三種必要的試劑： 固相的抗原或抗體，酶標(biāo)志的抗原或抗體，酶作固相的抗原或抗體，酶標(biāo)志的抗原或抗體，酶作用的底物。用的底物。實(shí)例實(shí)例1.瘦肉精，磺胺類藥殘瘦肉精，磺胺類藥殘-間接競爭間接競爭ELISA法法(北京勤邦北京勤邦) 在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，標(biāo)品或樣本中殘留的在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，標(biāo)品或樣本中殘留的克倫特羅和預(yù)包被抗原競爭抗克倫特羅的抗體，參與酶標(biāo)二抗克倫特羅和預(yù)包被抗原競爭抗克倫特羅的抗體，參與酶標(biāo)二抗后，用后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物克倫特羅負(fù)相關(guān)，底物顯色，樣本吸光值與殘留物克倫特羅負(fù)相關(guān)，根據(jù)規(guī)范曲線，得出克倫特羅殘留

7、量。根據(jù)規(guī)范曲線，得出克倫特羅殘留量。 :抗原抗原抗體抗體二抗二抗酶標(biāo)二抗酶標(biāo)二抗TMB 底物底物瘦肉精瘦肉精-間接競爭間接競爭ELISA法法孵育孵育+ Substance+ Substance+ Substance加底物加底物顯色顯色:3,3，5,5-四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)TMB 氧化產(chǎn)物氧化產(chǎn)物加硫酸終止液后加硫酸終止液后ELISA顯色機(jī)理顯色機(jī)理:實(shí)例實(shí)例2.氯霉素氯霉素-直接競爭直接競爭ELISA法法(杭州迪恩杭州迪恩) 標(biāo)品或樣品中的游離氯霉素與酶標(biāo)志的氯霉素競爭結(jié)合酶標(biāo)品或樣品中的游離氯霉素與酶標(biāo)志的氯霉素競爭結(jié)合酶標(biāo)板微孔中固相化的抗氯霉素抗體，經(jīng)過清洗洗掉未結(jié)合的酶

8、標(biāo)板微孔中固相化的抗氯霉素抗體，經(jīng)過清洗洗掉未結(jié)合的酶標(biāo)志氯霉素，經(jīng)過添加底物顯色。樣品的吸光值與濃度成負(fù)相標(biāo)志氯霉素，經(jīng)過添加底物顯色。樣品的吸光值與濃度成負(fù)相關(guān)，根據(jù)規(guī)范曲線，得出氯霉素的殘留量。關(guān)，根據(jù)規(guī)范曲線，得出氯霉素的殘留量?；前菲吆喜粩嘟痈偁幓前菲吆喜粩嘟痈偁嶦LISA法法(天津九鼎天津九鼎)酶聯(lián)免疫檢測獸藥殘留的方法類型酶聯(lián)免疫檢測獸藥殘留的方法類型:抗體抗體氯霉素氯霉素酶標(biāo)酶標(biāo)-氯霉素氯霉素孵育孵育+ Substance+ Substance+ Substance加底物加底物顯色顯色氯霉素氯霉素-直接競爭直接競爭ELISA法法:酶聯(lián)免疫檢測獸藥殘留的方法類型酶聯(lián)免疫檢測獸藥殘

9、留的方法類型實(shí)例實(shí)例3.硝基呋喃硝基呋喃-間接競爭間接競爭ELISA法法(無錫同昕無錫同昕) ELISA原理類似于瘦肉精的檢測，不同之處是硝基呋喃需求衍生。原理類似于瘦肉精的檢測，不同之處是硝基呋喃需求衍生。 硝基呋喃類藥物在體內(nèi)很快就能被代謝，代謝物在組織中那么能存留硝基呋喃類藥物在體內(nèi)很快就能被代謝，代謝物在組織中那么能存留較長的一段時間，所以我們檢測的實(shí)為硝基呋喃的代謝物。由于代謝物較長的一段時間，所以我們檢測的實(shí)為硝基呋喃的代謝物。由于代謝物均為較小分子，屬于半抗原，因此制備其抗體時，需求進(jìn)展衍生后，免均為較小分子，屬于半抗原，因此制備其抗體時，需求進(jìn)展衍生后，免疫動物獲得抗體疫動物獲

10、得抗體(也有能夠是單克隆抗體也有能夠是單克隆抗體)。 此處的衍生試劑還沒有確定能否和此處的衍生試劑還沒有確定能否和GB中的衍生化試劑類似？中的衍生化試劑類似？:抗原抗原抗體抗體二抗二抗酶標(biāo)二抗酶標(biāo)二抗硝基呋喃硝基呋喃-間接競爭間接競爭ELISA法法孵育孵育+ Substance+ Substance+ Substance加底物加底物顯色顯色:實(shí)例實(shí)例4.偽狂犬病病毒偽狂犬病病毒(PRV)直接競爭直接競爭ELISA法法 在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被PRV的抗原的抗原PRV gB，陽性對照或樣本中的抗體，陽性對照或樣本中的抗體在第一次孵育時和包被抗原特異性結(jié)合；清洗微孔后參與酶標(biāo)志

11、的抗在第一次孵育時和包被抗原特異性結(jié)合；清洗微孔后參與酶標(biāo)志的抗PRV gB的單克隆抗體，第二次孵育時酶標(biāo)單抗和樣本中的抗體競爭吸附微孔條的單克隆抗體，第二次孵育時酶標(biāo)單抗和樣本中的抗體競爭吸附微孔條中的抗原。再次清洗微孔后參與底物中的抗原。再次清洗微孔后參與底物TMB顯色，參與酶標(biāo)二抗后，用顯色，參與酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與抗體濃度負(fù)相關(guān)。即免疫勝利，產(chǎn)生了抗體，顯底物顯色，樣本吸光值與抗體濃度負(fù)相關(guān)。即免疫勝利，產(chǎn)生了抗體，顯色的色的OD630值小于陰性對照。值小于陰性對照。抗典型性豬流感病毒血清，抗口蹄疫病毒血清的檢測均采用直接競爭抗典型性豬流感病毒血清，抗口蹄疫病毒血

12、清的檢測均采用直接競爭ELISA法。法。 酶聯(lián)免疫檢測病毒抗體的方法類型酶聯(lián)免疫檢測病毒抗體的方法類型:抗原抗原抗體抗體酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體(PRV)疫苗直接競爭疫苗直接競爭ELISA法法加底物加底物加底物加底物加底物加底物陰性陰性陽性陽性孵育孵育(1)顯色顯色孵育孵育(2):實(shí)例實(shí)例5.豬繁衍與呼吸道綜合癥豬繁衍與呼吸道綜合癥(藍(lán)耳病，藍(lán)耳病，PRRS/US)的間接的間接ELISA法法 在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被PRRS/US的抗原，陽性對照或樣本中的抗的抗原，陽性對照或樣本中的抗體在第一次孵育時和包被抗原特異性結(jié)合；清洗微孔后參與酶標(biāo)志的抗豬體在第一次孵育時和包被抗原特異性結(jié)

13、合；清洗微孔后參與酶標(biāo)志的抗豬的二抗，第二次孵育時酶標(biāo)二抗和抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。再次清洗微孔后的二抗，第二次孵育時酶標(biāo)二抗和抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。再次清洗微孔后參與底物參與底物TMB顯色，樣本吸光值與抗體濃度正相關(guān)。即免疫勝利，產(chǎn)生顯色，樣本吸光值與抗體濃度正相關(guān)。即免疫勝利，產(chǎn)生了抗體，顯色的了抗體，顯色的OD450值大于陰性對照。值大于陰性對照。酶聯(lián)免疫檢測病毒抗體的方法類型酶聯(lián)免疫檢測病毒抗體的方法類型:抗原抗原抗體抗體二抗二抗酶標(biāo)二抗酶標(biāo)二抗PRRS/US疫苗的間接疫苗的間接ELISA法法陰性陰性陽性陽性孵育孵育(1)孵育孵育(2)加底物加底物加底物加底物加底物加底物顯色顯色:第二部分：

14、液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥殘第二部分：液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥殘檢測中的運(yùn)用檢測中的運(yùn)用:液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù)液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù) 藥物在體內(nèi)經(jīng)過肝腎等器官的代謝被轉(zhuǎn)化后，經(jīng)尿液和藥物在體內(nèi)經(jīng)過肝腎等器官的代謝被轉(zhuǎn)化后，經(jīng)尿液和糞便排出體外，只需極少部分殘留在肌肉組織，在肝臟和腎糞便排出體外，只需極少部分殘留在肌肉組織，在肝臟和腎臟中的濃度較高，但總體濃度均在臟中的濃度較高，但總體濃度均在ppb級級(g/kg=ng/mL)。痕。痕量檢測最常用的方式是酶聯(lián)免疫試劑盒和液相量檢測最常用的方式是酶聯(lián)免疫試劑盒和液相-質(zhì)譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。用技術(shù)。 液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，顧名思義將液相色譜的高效分別和液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，顧名思義

15、將液相色譜的高效分別和質(zhì)譜的高靈敏度有機(jī)結(jié)合，串聯(lián)質(zhì)譜更提高了檢測結(jié)果的質(zhì)譜的高靈敏度有機(jī)結(jié)合，串聯(lián)質(zhì)譜更提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用是藥殘檢測最常用的檢測方法之一，準(zhǔn)確性。液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用是藥殘檢測最常用的檢測方法之一，在國標(biāo)，歐盟和美國規(guī)范中被廣泛采用。在國標(biāo)，歐盟和美國規(guī)范中被廣泛采用。:液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀簡圖液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀簡圖:離子源離子源離子傳輸離子傳輸離子過濾離子過濾離子碰撞離子碰撞離子過濾離子過濾離子檢測離子檢測三重四級桿三重四級桿(Q1Q2Q3)(Q1Q2Q3)任務(wù)原理任務(wù)原理MS1(母離子選擇母離子選擇)MS2(子離子選擇子離子選擇):質(zhì)量分析器任務(wù)原理質(zhì)量分析器任務(wù)原理:獸藥殘留獸

16、藥殘留氯霉素類：氯霉素氯霉素類：氯霉素(0.1ppb)、甲砜霉素和氟苯尼考、甲砜霉素和氟苯尼考(1ppb)硝基呋喃：呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮硝基呋喃：呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮(0.5ppb)紅霉素類：紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、螺旋霉素、交沙霉素、紅霉素類：紅霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、螺旋霉素、交沙霉素、 吉他霉素、克林霉素和竹桃霉素吉他霉素、克林霉素和竹桃霉素(1ppb)四環(huán)素類：土霉素、金霉素、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素四環(huán)素類：土霉素、金霉素、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素(5ppb)-受體激動劑：沙丁胺醇、特布他林、塞曼特羅、塞布特羅、萊克多巴胺、克倫受體激動劑：沙丁胺醇、特布他林、塞曼特羅、塞布特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、溴布特羅、苯氧丙酚胺、馬布特羅、馬賁特羅、溴代克倫特羅特羅、溴布特羅、苯氧丙酚胺、馬布特羅、馬賁特羅、溴代克倫特羅鎮(zhèn)定劑：乙酰丙嗪、氯丙嗪、異丙嗪、丙酰丙嗪、甲苯噻嗪、地西泮鎮(zhèn)定劑：乙酰丙嗪、氯丙嗪、異丙嗪、丙酰丙嗪、甲苯噻嗪、地西泮喹諾酮類：伊諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、喹諾酮類：伊諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星和司帕沙