第五章__單倍體細(xì)胞培養(yǎng)

1、第一節(jié)第一節(jié) 單倍體培養(yǎng)的意義單倍體培養(yǎng)的意義第二節(jié)第二節(jié) 單倍體的起源與遺傳行為單倍體的起源與遺傳行為第三節(jié)第三節(jié) 離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育第四節(jié)第四節(jié) 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)第五節(jié)第五節(jié) 花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)一、單倍體的概念及發(fā)生一、單倍體的概念及發(fā)生（一）概念（一）概念1單倍體單倍體 單倍體指具有配子染色體數(shù)目的個體單倍體指具有配子染色體數(shù)目的個體，即體細(xì)胞染色體數(shù)目為n。單倍體包括一倍單倍體一倍單倍體和多倍多倍單倍體。單倍體。前者起源于二倍體物種，后者起源于多倍體（如（如4x、6x等）等）。2單倍體培養(yǎng)單倍體培養(yǎng) 將單倍體個體接種到人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并獲將單倍體個體接

2、種到人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并獲得再生單倍體植株得再生單倍體植株。包括花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)、小孢子培養(yǎng)小孢子培養(yǎng)、未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng)未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng)等方面。l單倍體植物與它們的二倍體相比較，有三單倍體植物與它們的二倍體相比較，有三個明顯的特點：個明顯的特點：1 1、體細(xì)胞染色體數(shù)減半；、體細(xì)胞染色體數(shù)減半；2 2、生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；、生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；3 3、雌、雄配子嚴(yán)重敗育，有的甚至不能進(jìn)入、雌、雄配子嚴(yán)重敗育，有的甚至不能進(jìn)入有性世代。有性世代。 （二）（二）誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體主要有四種方法：誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體主要有四種方法：1 1、種間和屬間雜交。、

3、種間和屬間雜交。遠(yuǎn)緣花粉的的誘導(dǎo)，卵細(xì)胞在花粉的刺激下遠(yuǎn)緣花粉的的誘導(dǎo)，卵細(xì)胞在花粉的刺激下進(jìn)行孤雌發(fā)育，生成單倍體。進(jìn)行孤雌發(fā)育，生成單倍體。2 2、物理照射和化學(xué)誘變。、物理照射和化學(xué)誘變。花粉用射線處理后失去受精能力，然后花粉用射線處理后失去受精能力，然后與母株授粉，卵細(xì)胞在花粉的刺激下進(jìn)行孤雌發(fā)育，生成單倍體。與母株授粉，卵細(xì)胞在花粉的刺激下進(jìn)行孤雌發(fā)育，生成單倍體。3 3、雙生苗的篩選。、雙生苗的篩選。有些植物可產(chǎn)生多胚的種子，兩個或多個胚有些植物可產(chǎn)生多胚的種子，兩個或多個胚被共同的種皮包著，可產(chǎn)生單倍體被共同的種皮包著，可產(chǎn)生單倍體- -單倍體，二倍體單倍體，二倍體- -二倍體，

4、二倍體，單倍體單倍體- -二倍體植株。二倍體植株。4 4、花藥和花粉培養(yǎng)。、花藥和花粉培養(yǎng)。可產(chǎn)生單倍體胚，或者先誘導(dǎo)單體愈傷組織可產(chǎn)生單倍體胚，或者先誘導(dǎo)單體愈傷組織再經(jīng)適當(dāng)途徑產(chǎn)生單倍體植株。再經(jīng)適當(dāng)途徑產(chǎn)生單倍體植株。第五章第五章 1、在植物育種中使后代迅速純合，縮短育種年限、在植物育種中使后代迅速純合，縮短育種年限母本母本 父本父本 F2F1品系比較試驗品系比較試驗區(qū)域試驗區(qū)域試驗品種品種花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)花粉植株花粉植株加倍加倍選擇鑒定選擇鑒定5-8代代第五章第五章 2、可以提高選擇效率、可以提高選擇效率AAbb(母本）母本）aaBB(父本）父本）Ab(雌配子）雌配子）aB(雄配子）雄

5、配子）AaBb(F1）常規(guī)雜交育種常規(guī)雜交育種不同類型卵不同類型卵ABAbaBab精精子子ABAbaBab單倍體育種單倍體育種AABB AABb AaBB AaBbAABb AAbb AaBb AabbAaBB AaBbaaBbaaBBAaBb Aabb aaBb aabbAABBAAbbAAbbaaBBaabb第五章第五章3、排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾、排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾4、突變體的篩選、突變體的篩選5、消除致死基因、消除致死基因6、選育新型自交系、選育新型自交系7、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料8、基因表達(dá)研究的良好實驗材料、基因表達(dá)研究的良好實驗材料主要有主要有4種方

6、法可以誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體：種方法可以誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體： 種間和屬間雜交種間和屬間雜交:遠(yuǎn)緣花粉刺激遠(yuǎn)緣花粉刺激 物理照射和化學(xué)誘變物理照射和化學(xué)誘變:射線、二甲基亞砜、萘乙酸、馬來酰射線、二甲基亞砜、萘乙酸、馬來酰肼、秋水仙素肼、秋水仙素 雙生苗的篩選：雙生苗的篩選： 花藥、花粉及未授粉的子房、胚珠離體培養(yǎng)花藥、花粉及未授粉的子房、胚珠離體培養(yǎng)高等植物生活周期中可以產(chǎn)生單倍體的高等植物生活周期中可以產(chǎn)生單倍體的3條途徑條途徑 通過花粉（花藥）、通過花粉（花藥）、子房、胚珠培養(yǎng)產(chǎn)生子房、胚珠培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體單倍體 通過合子染色體丟通過合子染色體丟失產(chǎn)生單倍體失產(chǎn)生單倍體 通過雌雄配子體的通過雌雄

7、配子體的單倍體孢子體單倍體孢子體一、一、 活體小孢子的正常發(fā)育活體小孢子的正常發(fā)育二、離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育二、離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育離體條件下，改變了花粉原來的生活環(huán)境，花粉第二次分裂不再像花粉發(fā)育離體條件下，改變了花粉原來的生活環(huán)境，花粉第二次分裂不再像花粉發(fā)育那樣由生殖核再分裂一次形成兩個精子核，而是像胚細(xì)胞一樣持續(xù)分裂。那樣由生殖核再分裂一次形成兩個精子核，而是像胚細(xì)胞一樣持續(xù)分裂。離體條件下離體條件下花粉分裂方式有四種類型：花粉分裂方式有四種類型：1 1、營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)展育途徑。、營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)展育途徑?；ǚ鄣谝淮斡薪z分裂形成不等的營養(yǎng)核和生殖核，花粉第一次有絲分裂形成不等的營養(yǎng)核和

8、生殖核，生殖核較小，退化，而較大的營養(yǎng)核多次分裂形成細(xì)胞團(tuán)，形成胚狀體或者生殖核較小，退化，而較大的營養(yǎng)核多次分裂形成細(xì)胞團(tuán)，形成胚狀體或者愈傷組織，最后形成單倍體。愈傷組織，最后形成單倍體。2 2、生殖細(xì)胞發(fā)育途徑。、生殖細(xì)胞發(fā)育途徑。營養(yǎng)核分裂幾次退化，生殖核形成細(xì)胞團(tuán)。營養(yǎng)核分裂幾次退化，生殖核形成細(xì)胞團(tuán)。3 3、營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑。、營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑。一種情況各自形成愈傷組織或者是一種情況各自形成愈傷組織或者是胚狀體，另一種情況為融合后再分裂胚狀體，另一種情況為融合后再分裂4 4、花粉均等分裂途徑。、花粉均等分裂途徑?；ǚ劬确至研纬苫ǚ劬确至研纬? 2個均

9、等子核，以后形成個均等子核，以后形成2 2個子個子細(xì)胞，最后形成胚狀體或者愈傷組織。細(xì)胞，最后形成胚狀體或者愈傷組織。途徑一途徑二小孢子正常發(fā)育途徑和培養(yǎng)條件下胚胎發(fā)育途徑比較小孢子正常發(fā)育途徑和培養(yǎng)條件下胚胎發(fā)育途徑比較l途徑一途徑一 lA A 途徑：途徑：自然下小孢子第二次分裂及萌發(fā)形成花粉自然下小孢子第二次分裂及萌發(fā)形成花粉管。管。lB B 途徑：途徑：營養(yǎng)核重復(fù)分裂生殖核敗育營養(yǎng)核重復(fù)分裂生殖核敗育lC C 途徑：途徑：生殖細(xì)胞重復(fù)分裂，營養(yǎng)細(xì)胞敗育。生殖細(xì)胞重復(fù)分裂，營養(yǎng)細(xì)胞敗育。l途徑二途徑二 D D 途徑：途徑：兩個核共同分裂形成單倍體胚。兩個核共同分裂形成單倍體胚。 E E 途

10、徑：途徑：兩個核融合后分裂形成純合的二倍體。兩個核融合后分裂形成純合的二倍體。l花藥花藥(anther)(anther)：植物植物花的雄性生殖器官，花的雄性生殖器官，包括二倍體的花藥壁、包括二倍體的花藥壁、藥隔和單倍體的雄性藥隔和單倍體的雄性性細(xì)胞（花粉粒）培性細(xì)胞（花粉粒）培養(yǎng)前要用醋酸洋紅壓養(yǎng)前要用醋酸洋紅壓片鏡檢確定發(fā)育時期。片鏡檢確定發(fā)育時期?；ㄋ幣囵B(yǎng)花藥培養(yǎng): :將花粉發(fā)育至一定階段的花藥培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，將花粉發(fā)育至一定階段的花藥培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，( (先先暗培養(yǎng)，愈傷形成后移到光下促進(jìn)分化暗培養(yǎng)，愈傷形成后移到光下促進(jìn)分化) )誘導(dǎo)其花粉粒改變發(fā)育進(jìn)誘導(dǎo)其花粉粒改變發(fā)育進(jìn)程，

11、形成花粉胚或愈傷組織，進(jìn)而分化成苗的過程。（器官培養(yǎng)）程，形成花粉胚或愈傷組織，進(jìn)而分化成苗的過程。（器官培養(yǎng)）A：從裂開的花藥中長出胚狀體：從裂開的花藥中長出胚狀體; B、C：從藥室中直接長出的幼苗：從藥室中直接長出的幼苗;D、E：具有根、莖、葉的小苗：具有根、莖、葉的小苗; F：小苗發(fā)達(dá)的根系：小苗發(fā)達(dá)的根系l花藥和花粉培養(yǎng)實質(zhì)：花藥和花粉培養(yǎng)實質(zhì)：把發(fā)育到一定階段的花藥（或花把發(fā)育到一定階段的花藥（或花粉）接種在人工培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其粉）接種在人工培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化，最終發(fā)不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化，最

12、終發(fā)育成完整植株的過程。育成完整植株的過程。l 廣義的花粉培養(yǎng)，孤雄生殖。廣義的花粉培養(yǎng)，孤雄生殖。l 培養(yǎng)類型：花藥培養(yǎng)類型：花藥-器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)l 培養(yǎng)類型：花粉培養(yǎng)類型：花粉-單細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)l兩者目的一致：誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體植株兩者目的一致：誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體植株。再生植株途徑有再生植株途徑有2種：種：1、經(jīng)由成愈傷組織再生植株、經(jīng)由成愈傷組織再生植株2、經(jīng)由胚狀體再生植株、經(jīng)由胚狀體再生植株 花藥培養(yǎng)的步驟花藥培養(yǎng)的步驟1. 取材取材 供體植株最好栽種在溫光可控條件下，以保證花的發(fā)育條件穩(wěn)定，試驗具有可重復(fù)性?；ㄋ帒?yīng)取自幼年植株，多數(shù)植物以單核中央期單核中央期或單核

13、靠邊期單核靠邊期為宜。以花的外觀形狀來確定采花標(biāo)準(zhǔn)，用醋酸洋紅壓片法或者碘-碘化鉀壓片法四分體時期單核靠邊期花藥切片顯微觀察2. 滅菌及預(yù)處理滅菌及預(yù)處理 未開放的花蕾，常規(guī)滅菌后直接取出花藥在45條件下冷處理24d，易產(chǎn)生胚狀體。3. 接種接種 盡量不使花藥損傷并去除花絲，排除二倍體組織對單倍體植株再生的影響。4. 培養(yǎng)培養(yǎng) 常用培養(yǎng)基有MS、B5、White等，38周后花粉中形成了胚狀體或愈傷組織。先暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，再轉(zhuǎn)至25，光照2000lx/14h條件下促進(jìn)分化。影響花藥培養(yǎng)的因素：影響花藥培養(yǎng)的因素：1 1、供體植株的生長條件：不同的生長季節(jié)、環(huán)境、供體植株的生長條件：不同的生長

14、季節(jié)、環(huán)境、不同部位的花蕾，其花粉的生理狀態(tài)也不同，培養(yǎng)不同部位的花蕾，其花粉的生理狀態(tài)也不同，培養(yǎng)效果也會有明顯的差異效果也會有明顯的差異2 2、供體植株的年齡：多數(shù)情況下幼年的植株好于老、供體植株的年齡：多數(shù)情況下幼年的植株好于老年的植株，但是甘藍(lán)型油菜相反。年的植株，但是甘藍(lán)型油菜相反。3 3、花粉的發(fā)育時期：煙草中處于第一次有絲分裂期、花粉的發(fā)育時期：煙草中處于第一次有絲分裂期的花粉最好；而在禾本科和蕓苔屬中，單核早期最的花粉最好；而在禾本科和蕓苔屬中，單核早期最好。好。4 4、花蕾、花藥的預(yù)處理：低溫、花蕾、花藥的預(yù)處理：低溫5 5、供體植株的基因型、供體植株的基因型6 6、培養(yǎng)基、

15、培養(yǎng)條件及活性碳、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及活性碳 定義：定義：將發(fā)育至一定階段花粉從花藥中將發(fā)育至一定階段花粉從花藥中分離出來成為分散或游離狀態(tài)，花粉脫分離出來成為分散或游離狀態(tài)，花粉脫分化后再生成苗。（類似單細(xì)胞培養(yǎng)）分化后再生成苗。（類似單細(xì)胞培養(yǎng)） l小孢子：處于四分體到單核早期的花粉小孢子：處于四分體到單核早期的花粉l習(xí)慣上，把處于四分體到單核早期的花粉稱小孢子。進(jìn)入單核以習(xí)慣上，把處于四分體到單核早期的花粉稱小孢子。進(jìn)入單核以后則稱為花粉。后則稱為花粉。l四分體四分體單核早期單核早期單核晚期單核晚期雙核早期雙核早期雙核晚期雙核晚期三核期三核期小孢子小孢子花粉?；ǚ哿；ǚ郯l(fā)育時期：花粉發(fā)育時

16、期：1、適宜時期：、適宜時期：單核期單核期,尤其是單核中、晚期尤其是單核中、晚期(單核單核靠邊期靠邊期)營養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞精子精子 1 1）花粉漂浮自然釋放法）花粉漂浮自然釋放法: :將花藥接種于液體培養(yǎng)中，使花將花藥接種于液體培養(yǎng)中，使花粉自然釋放。粉自然釋放。 2 2）人工擠壓法）人工擠壓法: :用玻璃棒搗碎花藥使花粉釋放。用玻璃棒搗碎花藥使花粉釋放。 3 3）機(jī)械法）機(jī)械法: :用磁力攪拌器打碎花藥釋放花粉。用磁力攪拌器打碎花藥釋放花粉。 釋放的花粉粒釋放的花粉粒 尼龍網(wǎng)（孔徑尼龍網(wǎng)（孔徑202060um60um）過濾，除）過濾，除去藥壁等組織去藥壁等組織 500-1000

17、 500-1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分離心分離心1-51-5分鐘，收集花分鐘，收集花粉。粉?；ǚ叟囵B(yǎng)方法花粉培養(yǎng)方法1. 1.平板培養(yǎng)：平板培養(yǎng)：直接取新鮮花藥的花粉粒在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的方法直接取新鮮花藥的花粉粒在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的方法2. 2. 液體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)：比固體培養(yǎng)法效果好。將花藥接種到液體培養(yǎng)基內(nèi)，在搖床上比固體培養(yǎng)法效果好。將花藥接種到液體培養(yǎng)基內(nèi)，在搖床上振蕩（振蕩（100100轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分鐘），誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。需要定期更換分鐘），誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。需要定期更換培養(yǎng)基（在超凈工作臺上靜置沉淀，去上清，然后加入新培養(yǎng)基）。培養(yǎng)基（在超凈工作臺上靜置沉

18、淀，去上清，然后加入新培養(yǎng)基）。3. 3. 雙層培養(yǎng)雙層培養(yǎng)( (固固- -液培養(yǎng)）液培養(yǎng)）固相和液相雙層培養(yǎng)。固相和液相雙層培養(yǎng)。4. 4. 看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)：將花藥水平放于固體培養(yǎng)基上，在其上覆蓋小圓形濾紙，在濾將花藥水平放于固體培養(yǎng)基上，在其上覆蓋小圓形濾紙，在濾紙滴加紙滴加0.5ml0.5ml含含1010個花粉粒的懸浮液滴的培養(yǎng)方法。個花粉粒的懸浮液滴的培養(yǎng)方法。5. 5. 微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)：將一滴花粉懸液滴在蓋玻片上，在翻過來放在凹穴載玻片上，將一滴花粉懸液滴在蓋玻片上，在翻過來放在凹穴載玻片上，蓋玻片四周用石蠟密封。蓋玻片四周用石蠟密封。6.6.預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)：將花藥先懸浮培養(yǎng)：將花藥先懸浮培養(yǎng)2-42-4天（天（5050個花藥個花藥/5 ml/5 ml），再擠出花粉，經(jīng)離），再擠出花粉，經(jīng)離心洗滌純化后懸浮培養(yǎng)。心洗滌純化后懸浮培養(yǎng)。7.7.哺育培養(yǎng)哺育培養(yǎng)：將在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)裂開的花藥作為哺：將在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)裂開的花藥作為哺 育組織