高三生物一輪復習選修D(zhuǎn)NA重組技術(shù)的基本工具基因工程的基本操作程序

1、 選修3 現(xiàn)代生物科技專題(1)基因工程的誕生(2)基因工程的原理和技術(shù)(3)基因工程的應用(4)蛋白質(zhì)工程(1)基因工程中三種基本工具的作用及特點(2)基因工程原理及基本操作程序(3)設計某一轉(zhuǎn)基因生物的培育過程(4)基因工程的應用及取得成果的典型實例(5)蛋白質(zhì)工程原理及其與基因工程的區(qū)別和聯(lián)系11、1.2DNA重組技術(shù)的基本重組技術(shù)的基本工具基因工程的基本操作程序工具基因工程的基本操作程序一、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)1基因拼接的理論基礎(chǔ)(1)DNA是生物的主要遺傳物質(zhì)。(2)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。(3)雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。2外源基因在受體內(nèi)表達的

2、理論基礎(chǔ)(1)基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則闡述的信息流動方向。(3)生物界共用一套遺傳密碼。二、基因工程的操作工具1限制性核酸內(nèi)切酶能夠特異性地識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并能在特定部位將兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，使其形成黏性末端或平末端。2DNA連接酶(1)常用的DNA連接酶(2)DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶作用實質(zhì)作用實質(zhì)都是催化兩個脫氧核苷酸都是催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵之間形成磷酸二酯鍵是否需模是否需模板板不需要不需要需要需要連接連接DNA鏈鏈雙鏈雙鏈單鏈單鏈DNA連接酶連接酶

3、DNA聚合酶聚合酶作用過作用過程程在兩個在兩個DNA片段片段之間形成磷酸二之間形成磷酸二酯鍵酯鍵將單個脫氧核苷酸將單個脫氧核苷酸加到已存在的核酸加到已存在的核酸片段的片段的3端的羥端的羥基上，形成磷酸二基上，形成磷酸二酯鍵酯鍵作用結(jié)作用結(jié)果果將存在的將存在的DNA片片段連接成重組段連接成重組DNA分子分子合成新的合成新的DNA分子分子3.載體(1)作用：作為運載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)。利用它在宿主細胞內(nèi)對目的基因進行大量復制。(2)種類：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物和動植物病毒等。(3)一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對某些天然的載體進行人工改造。

4、三、基因工程操作的基本程序1目的基因的獲取途徑(1)直接分離：從自然界已有的物種中分離，如從基因文庫中獲取。(2)人工合成目的基因常用的方法有：已知核苷酸序列的較小基因，直接利用DNA合成儀用化學方法合成，不需要模板。以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下人工合成。(3)PCR技術(shù)與DNA復制的比較PCR技術(shù)DNA復制相同點原理DNA雙鏈復制(堿基互補配對)原料四種游離的脫氧核苷酸條件模板、ATP、酶等PCR技術(shù)DNA復制不同點解旋解旋方式方式DNA在高溫下變在高溫下變性解旋性解旋解旋酶催化解旋酶催化場所場所體外復制體外復制主要在細胞核內(nèi)主要在細胞核內(nèi)酶酶熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚聚合酶合酶(Taq酶

5、酶)細胞內(nèi)含有的細胞內(nèi)含有的DNA聚合酶聚合酶結(jié)果結(jié)果在短時間內(nèi)形成在短時間內(nèi)形成大量的大量的DNA片段片段形成整個形成整個DNA分分子子2.基因表達載體的構(gòu)建(1)基因表達載體的組成：啟動子、目的基因、終止子以及標記基因等。(2)基因表達載體的構(gòu)建方法導入的目的基因的表達需要調(diào)控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有啟動子，之后需有終止子。3將目的基因?qū)胧荏w細胞生物生物種類種類植物細胞植物細胞動物細胞動物細胞微生物細胞微生物細胞常用常用方法方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)Ca2處理法處理法受體受體細胞細胞體細胞體細胞受精卵受精卵原核細胞原核細胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化過程過程將目的基因

6、插入到將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的TDNA上上農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌導入植導入植物細胞物細胞整合到受整合到受體細胞的體細胞的DNA表表達達將含有目的基因的將含有目的基因的表達載體提純表達載體提純?nèi)∪÷崖?受精卵受精卵)顯微顯微注射注射受精卵發(fā)育受精卵發(fā)育獲得具有新性狀獲得具有新性狀的動物的動物Ca2處理細胞處理細胞感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞重組重組表達載體與感受態(tài)表達載體與感受態(tài)細胞混合細胞混合感受態(tài)感受態(tài)細胞吸收細胞吸收DNA分分子子4.目的基因的檢測與鑒定(1)分子水平檢測導入檢測：DNA分子雜交技術(shù)，即使用放射性同位素標記的含目的基因的DNA片段作探針檢測。(2)個體生物學水平鑒定：對轉(zhuǎn)基因生物進行

7、抗蟲或抗病的接種實驗。 (2010年北京海淀區(qū)抽查)下圖是含某目的基因的DNA片段，據(jù)圖回答下列問題。(1)根據(jù)圖示可知，若用EcoR和Sma限制酶切割，則此DNA片段可有_個限制酶切割位點，切割后共有_種_個切割末端。(2)EcoR限制酶切割后形成的末端是末端，在圖中用筆標出切割部位。(3)如果要將用EcoR限制酶切割形成的目的基因片段導入受體細胞，一般需要_作載體。其應具備的特點有：_、_、_。(4)Ecoli DNA連接酶連接目的基因和載體時連接的是圖中_(填字母)部位的化學鍵?！敬鸢浮?1)326(不計算原有的)(2)黏性(3)質(zhì)粒至少有一個切割位點能自我復制含標記基因(4)X (20

8、09年江蘇高考題)蘇云金桿菌(Bt)能產(chǎn)生具有殺蟲能力的毒素蛋白。下圖是轉(zhuǎn)Bt毒素蛋白基因植物的培育過程示意圖(ampr為抗氨芐青霉素基因)，據(jù)圖回答下列問題。(1)將圖中的DNA用Hind、BamH完全酶切后，反應管中有_種DNA片段。(2)圖中表示Hind與BamH酶切、DNA連接酶連接的過程，此過程可獲得_種重組質(zhì)粒；如果換用Bst與BamH酶切，目的基因與質(zhì)粒連接后可獲得_種重組質(zhì)粒。(3)目的基因插入質(zhì)粒后，不能影響質(zhì)粒的_。(4)圖中的Ti質(zhì)粒調(diào)控合成的vir蛋白，可以協(xié)助帶有目的基因的TDNA導入植物細胞，并防止植物細胞中_對TDNA的降解。(5)已知轉(zhuǎn)基因植物中毒素蛋白只結(jié)合某

9、些昆蟲腸上皮細胞表面的特異受體，使細胞膜穿孔，腸細胞裂解，昆蟲死亡。而該毒素蛋白對人類的風險相對較小，原因是人類腸上皮細胞_。(6)生產(chǎn)上常將上述轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物混合播種，其目的是降低害蟲種群中的_基因頻率的增長速率?！窘馕觥勘绢}重點考查轉(zhuǎn)基因技術(shù)的相關(guān)知識，需特別注意基因工程的步驟、DNA的復制、基因工程的操作工具等知識。本題需特別注意圖示過程，從中獲取有效信息，然后結(jié)合課本知識即可正確解答。【答案】(1)4(2)21(3)復制(4)DNA水解酶(5)表面無相應的特異性受體(6)抗性1(2009年浙江高考題)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是()A目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微

10、生物B限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性D載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達【解析】基因工程中目的基因來源于自然界中的含有目的性狀的一切生物，可以是動物、植物，也可以是真菌、細菌，還可以是人等；在基因工程中獲取目的基因以及將目的基因和載體結(jié)合構(gòu)成基因表達載體必須使用同一種限制酶進行切割，以獲得相同的黏性末端，再在DNA連接酶的作用下，將目的基因和載體連接，構(gòu)成基因表達載體；人的胰島素原基因可以在大腸桿菌體內(nèi)得以表達，但是由于大腸桿菌是原核生物，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器的加工，合成的胰島素原不具有

11、胰島素的功能，即沒有生物活性；作為標記基因，有利于重組基因在細胞內(nèi)表達的鑒定篩選，但對于目的基因的表達沒有促進等調(diào)控作用?！敬鸢浮緿2(2007年高考北京卷)利用外源基因在受體細胞中表達，可生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品。下列選項中能說明目的基因完成了在受體細胞中表達的是()A棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因B大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNAC山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列D酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白【解析】該題考查了目的基因的檢測和目的基因的表達兩個概念之間的區(qū)別?；虮磉_的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，因此，只有在受體細胞中檢測或提取到了相應蛋白質(zhì)才能證明目的基因在受體細胞中完成了表達，A

12、、C只能說明完成了目的基因的導入，B只能說明完成了目的基因的導入和目的基因的轉(zhuǎn)錄過程?！敬鸢浮緿3(2009年上海高考題)人體細胞內(nèi)含有抑制癌癥發(fā)生的P53基因，生物技術(shù)可對此類基因的變化進行檢測。(1)目的基因的獲取方法通常包括_和_。(2)上圖表示從正常人和患者體內(nèi)獲取的P53基因的部分區(qū)域。與正常人正比，患者在該區(qū)域的堿基會發(fā)生改變，在上圖中用方框圈出發(fā)生改變的堿基對；這種變異被稱為_。(3)已知限制酶E識別序列為CCGG，若用限制酶E分別完全切割正常人和患者的P53基因部分區(qū)域(見上圖)，那么正常人的會被切成個片段；而患者的則被切割成長度為_對堿基和_對堿基的兩種片段。(4)如果某人的

13、P53基因部分區(qū)域經(jīng)限制酶E完全切割后，共出現(xiàn)170、220、290和460堿基對的四種片段，那么該人的基因型是_(以P+表示正?；颍琍-表示異?；??！窘馕觥?1)目的基因既可以從供體細胞中直接提取，也可人工合成。(2)基因內(nèi)部個別堿基對的替換為基因突變。(3)據(jù)圖分析可知，正常人會被切成三個片段。(4)由正常人被限制酶E切出來的具體片段可知，該人的基因型是P+P-?！敬鸢浮?1)從細胞中分離通過化學方法人工合成(2)見下圖基因堿基對的替換(基因突變)(3)3460220(4)P+P-4(2008年山東高考題)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學

14、家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。(1)獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的_處，DNA連接酶作用于_處。(填“a或“b”)(2)將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和_法。(3)由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用_技術(shù)，該技術(shù)的核心是_和_。(4)為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的_作探針進行分子雜交檢測，又要用_方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?！窘馕觥肯拗菩詢?nèi)切酶的切點選擇很嚴格，只會切斷某段特定DNA序列中的某個特定位點磷酸二酯鍵，而DNA連接酶可以將該鍵連接起來。重組DNA分子導入水稻受體細胞的常

15、用方法除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法外，還有基因槍法和花粉管通道法。導入外源基因的細胞需要利用植物組織培養(yǎng)導入外源基因的細胞需要利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)將其培養(yǎng)為植株，過程為：取材、去分技術(shù)將其培養(yǎng)為植株，過程為：取材、去分化化(或脫分化或脫分化)形成愈傷組織、再分化形成試形成愈傷組織、再分化形成試管苗、移栽培育成完整植物體。轉(zhuǎn)基因是否管苗、移栽培育成完整植物體。轉(zhuǎn)基因是否成功，可測定是否有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生，也可成功，可測定是否有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生，也可通過改變條件觀察植物性狀的變化來加以確通過改變條件觀察植物性狀的變化來加以確定。定?！敬鸢浮?1)aa(2)基因槍(花粉管通道)(3)植物組織培養(yǎng)脫分化(去分化)再分

16、化(4)耐鹽基因(目的基因)一定濃度鹽水澆灌的(移栽到鹽堿地中)5(2008年江蘇高考)將動物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關(guān)的圖和表。圖1轉(zhuǎn)基因操作流程圖圖2引物對與模板結(jié)合示意圖表1引物對序列表引物引物對對AP1AACTGAAATGTAGCTATCP2TTAAGTCCATTACTCTAG引物引物對對BS1GTCCGACTAGTGGCTGTGS2AGCTGGCGTTTAGCCTCG表2幾種限制酶識別序列及切割位點表限制酶限制酶AluEcoRPstSma切割切割位點位點AGCTGAATTCCTGCAGCCCGGGTCGAC

17、TTAAGGACGTCGGGCCC請根據(jù)以上圖表回答下列問題。(1)在采用常規(guī)PCR方法擴增目的基因的過程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要的特點是_。(2)PCR過程中退火(復性)溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設定。表1為根據(jù)模板設計的兩對引物序列，圖2為引物對與模板結(jié)合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？_。(3)圖1步驟所用的DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列是否有專一性要求？_。(4)為將外源基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，圖1步驟轉(zhuǎn)基因所用的細菌B通常為_。(5)對符合設計要求的重組質(zhì)粒T進行酶切。假設所用的酶均可將識別位點完全切開，請根據(jù)圖1中標示

18、的酶切位點和表2所列的識別序列，對以下酶切結(jié)果作出判斷。采用EcoR和Pst酶切，得到_種DNA片段。采用EcoR和Sma酶切，得到_種DNA片段。【答案】(1)耐高溫(2)引物對B(3)否(4)農(nóng)桿菌(5)21闖關(guān)訓練點擊進入鏈接11、1.2DNA重組技術(shù)的基本重組技術(shù)的基本工具基因工程的基本操作程序工具基因工程的基本操作程序2外源基因在受體內(nèi)表達的理論基礎(chǔ)(1)基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則闡述的信息流動方向。(3)生物界共用一套遺傳密碼。2DNA連接酶(1)常用的DNA連接酶導入的目的基因的表達需要調(diào)控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有啟動子，之后需有終止子。導入的目的基因的表達需要調(diào)控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有啟動子，之后需有終止子。(3)已知限制酶E識別序列為CCGG，若用限制酶E分別完全切割正常人和患者的P53基因部分區(qū)域(見上圖)，那么正常人的會被切成個片段；而患者的則被切割成長度為_對堿基和_對堿基的兩種片段。(4)如果某人的P53基因部分區(qū)域經(jīng)限制酶E完全切割后，共出現(xiàn)170、220、290和460堿基對的四種片段，那么該人