表面等離子體共振儀器講解

1、表面等離子體共振表面等離子體共振 儀器介紹儀器介紹表面等離子體共振儀就是應(yīng)用表面等離子體共振儀就是應(yīng)用 SPR SPR 原理檢測生物傳感芯片原理檢測生物傳感芯片（biosensor chipbiosensor chip）上配位體與分析物之間的相互作用情況）上配位體與分析物之間的相互作用情況. .下面以瑞典的Biacore3000 型 SPR 儀（右圖所示）為例，簡要介紹這種儀器的構(gòu)成及工作原理。儀器的主要構(gòu)造uBiacore3000由工作單元和一臺(tái)安裝有 Biacore Control 軟件的電腦組成。u工作單元的核心部件包括光學(xué)系統(tǒng)、傳感器芯片、液體處理系統(tǒng)三個(gè)主要部分。u其他的組成部分包括

2、LED狀態(tài)指示器及溫度控制系統(tǒng)等。u其中，傳感器芯片是最為核心的組件：傳感器芯片提供了產(chǎn)生SPR信號(hào)的必需物理?xiàng)l件，并且分子相互作用的研究是在傳感器芯片表面進(jìn)行的。一、光學(xué)系統(tǒng)u 其所利用的生物大分子相互作用分析（Biomolecular Interaction Anaylysis） 技術(shù)是基于表面等離子共振(SPR)的物理光學(xué)現(xiàn)象的新型生物傳感分析技術(shù).u由于其不必使用熒光標(biāo)記和同位素標(biāo)記，從而保持了生物分子的天然活性。u SPR共振角會(huì)隨金屬薄膜表面通過的液相的折射率的改變而改變，折射率的變化（RU）又與結(jié)合在金屬表面的生物大分子質(zhì)量成正比。（具體 1000RU 的變化表示傳感片表1ng/

3、mm的質(zhì)量變化）u 因此，BlA 技術(shù)可以通過對(duì)反應(yīng)全過程中各種分子反射光的吸收獲得初始數(shù)據(jù)，并經(jīng)相關(guān)處理獲得結(jié)果。u用 SPR 檢測器所得的信息可直接來自表面的樣品，也可間接來自能與樣品特異結(jié)合的相關(guān)試劑，還可以從粗樣品的嘈雜信號(hào)中獲得微量待測樣品的特異性信號(hào)。 其最低檢測下線為 pg 級(jí) (10-12g)。二、傳感器芯片（sensor chip）u在 BIA 技術(shù)中必須首先有一個(gè)生物分子偶聯(lián)在傳感片上，然后用它去捕獲可與之進(jìn)行特異反應(yīng)的生物分子。u將 50nm 至 100nm 厚的金膜固定在一塊玻璃片上，將此玻璃片嵌在一個(gè)塑料平板夾里，用一種折射率與棱鏡匹配的聚合物將芯片耦合到玻璃棱鏡上，

4、在芯片表面固定一層較容易與其它生物大分子偶聯(lián)的葡聚糖分子層（使用者也可以根據(jù)需要選擇非葡聚糖分子層的芯片）而成。（該偶聯(lián)過程可由儀器全自動(dòng)控制。） 最為核心的部件傳感器芯片光波導(dǎo)耦合器件金屬膜分子敏感膜1 1、光波導(dǎo)耦合器件、光波導(dǎo)耦合器件u產(chǎn)生SPR現(xiàn)象必須將光波（消逝波部分）與表面等離子體波耦合并使其發(fā)生共振，因此需要使用耦合器件。耦合器件棱鏡型光柵型光纖型光波導(dǎo)型1.1、棱鏡型u用于產(chǎn)生衰減全反射的棱鏡型裝置有Otto結(jié)構(gòu)和Kretschmann結(jié)構(gòu)，二者在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別主要是棱鏡底面與金屬膜之間是否存在間隙。Otto型結(jié)構(gòu)對(duì)此間隙的取值有嚴(yán)格要求，在制作和使用上都有一定難度，因此應(yīng)用的比

5、較少；Kretschmann型結(jié)構(gòu)簡單，制作容易實(shí)現(xiàn)且使用方便，較容易達(dá)到很高的靈敏度，因此應(yīng)用也最為廣泛，是SPR傳感裝置最常用的結(jié)構(gòu)。對(duì)于Kretschmann結(jié)構(gòu)來說，由于漸逝波需要穿透金屬層，在與被測物接觸的表面激發(fā)才能產(chǎn)生表面等離子體波，因此對(duì)金屬膜的厚度有嚴(yán)格的限制。1.2、光柵型u在光柵的表面覆蓋一層金屬膜，金屬膜與分析溶液接觸，當(dāng)入射光照射在光柵表面時(shí)，反射光將出現(xiàn)散射，如上圖，當(dāng)某一階(m=0，1，2，)的動(dòng)量與表面等離子體波的動(dòng)量相等時(shí)，二者發(fā)生共振。1.3、光纖型u光纖型SPR傳感器采用光纖作為光的傳輸媒介，主要有兩種形式：終端反射式和在線傳輸式，其結(jié)構(gòu)如下圖所示。由于光

6、纖的獨(dú)特性質(zhì)，加上這種SPR傳感器的結(jié)構(gòu)緊湊、小巧，很容易實(shí)現(xiàn)微區(qū)探測、遙測和分布式檢測。目前影響光纖型SPR傳感器的主要問題是制作工藝復(fù)雜，成本高。1.4、光波導(dǎo)型u 光波導(dǎo)型SPR傳感器的原理與棱鏡型十分相似，如下圖所示，不同之處在于光波傳輸?shù)拿浇橛衫忡R變?yōu)楣獠▽?dǎo)，在理論上，它可達(dá)到的檢測精度也與棱鏡型的相仿。所謂的光波導(dǎo)是光波傳導(dǎo)的材料，能把光束縛在一定區(qū)域內(nèi)傳播。光波導(dǎo)型SPR傳感器有其自身的優(yōu)點(diǎn)：光波的傳輸途徑可以人為控制；易于實(shí)現(xiàn)微型化；穩(wěn)定性好等。2 2、金屬膜、金屬膜u金屬元素的性質(zhì)各不相同。因此，選擇不同種類金屬材料作為構(gòu)成表面等離子體共振的基質(zhì)膜，將會(huì)對(duì) SPR 光譜產(chǎn)生很

7、大影響。SPR 研究的是反射光譜，所以需要在可見光范圍內(nèi)考慮反射率較高的金屬，其隨波長變化而改變的幅度較小，穩(wěn)定性要好。故 Au 膜和 Ag 膜是 SPR 中最常使用的兩種金屬薄膜。u從SPRSPR光譜的三個(gè)特征參數(shù)（共振波長，共振寬度，共振深度）來看，在同樣的條件下，銀膜的共振波長的變化明顯比金膜靈敏，共振深度約大于金膜，共振峰寬明顯小于金膜。uAu 膜的穩(wěn)定性最好，在 SPR 中具有重要應(yīng)用價(jià)值，尤其適用于銀膜不能使用的體系。u金屬薄膜的厚度是影響共振深度的重要因素(見右圖)。隨著膜厚度的增加，共振深度變小，最小反射系數(shù)變大；當(dāng)膜厚度超過一定值時(shí)，共振峰將消失。當(dāng)膜厚在某一數(shù)值時(shí)，反射光強(qiáng)

8、度近似為零，共振深度達(dá)到最大。通過實(shí)驗(yàn)，一般選擇膜厚度為 50nm 左右，最多不超過 100nm。3 3、分子敏感膜、分子敏感膜u 為了滿足分析各種生物體系的要求，多種傳感器芯片應(yīng)運(yùn)而生，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞，每一種芯片都必須能提供給科學(xué)工作者穩(wěn)定的基線，高靈敏度，廣泛的再生方法，反復(fù)使用性和特別好的重現(xiàn)性。成膜方法：1.金屬膜直接吸附法2.共價(jià)連接法（生物素-親和素、葡聚糖凝膠、水凝膠、高分子膜、多肽等）3.單分子復(fù)合膜法4.分子印膜技術(shù)三、液體處理系統(tǒng)Biacore 3000的液體流路簡圖的液體流路簡圖 自動(dòng)上樣裝置一體化U型射流器

9、四、溫度控制系統(tǒng)uSPR 信號(hào)對(duì)于溫度變化非常敏感，所以在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持傳感芯片表面的溫度恒定是非常重要的。Biacore 3000 采用 Peltier 元件來控制傳感芯片的表面溫度。如果溫度不穩(wěn)定，儀器前部面板上的黃色 LED會(huì)不停的閃爍。通過預(yù)先設(shè)定，實(shí)驗(yàn)者可以把溫度控制在4-40之間任意一點(diǎn)。 五、LED狀態(tài)指示器 u在儀器前部面板上有 5個(gè) LED 狀態(tài)指示器，LED的最顯著特點(diǎn)是使用壽命長，光電轉(zhuǎn)換效能高，分別能夠顯示儀器不同方面的狀態(tài)。 u 另外，在光源的選擇上，固定波長、改變?nèi)肷浣菧y量方式的 SPR 裝置多采用 He2Ne 激光器(= 63218nm) 作為光源。用激光器作光源，單色性好，強(qiáng)度高。在部分文獻(xiàn)中發(fā)光二極管(LED) 也作為 SPR 的光源，選擇的波長多為 760nm。LED 的單色性也較好，且體積小，價(jià)格低，使