蛋白質(zhì)純化方法ppt課件

1、l在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中挪動(dòng)的速度粒在電場中挪動(dòng)的速度v v取決于取決于電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度(E)(E)，所帶的凈電荷，所帶的凈電荷(q)(q)，蛋，蛋白質(zhì)的分子量、分子外形以及與介質(zhì)白質(zhì)的分子量、分子外形以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)的摩擦系數(shù)(f)(f)。l紙電泳紙電泳l醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳l聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE)l (可分為圓盤電泳和垂直平板電泳可分為圓盤電泳和垂直平板電泳l瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳lSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳l等電聚焦等電聚焦(IEF)l雙向電泳雙向電泳l聚丙烯酰胺凝膠電泳聚

2、丙烯酰胺凝膠電泳PAGE)PAGE)是利用是利用聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的電泳法，聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的電泳法，聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙稀酰胺和聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙稀酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)而成的多交聯(lián)劑甲叉雙丙稀酰胺交聯(lián)而成的多孔網(wǎng)狀凝膠。孔網(wǎng)狀凝膠。l不延續(xù)不延續(xù)PAGEPAGE有分別膠、濃縮膠和樣品有分別膠、濃縮膠和樣品膠。膠。lPAGEPAGE分辨率很高。分辨率很高。lSDSSDS十二烷基磺酸鈉是一種陰離子十二烷基磺酸鈉是一種陰離子型外表活性劑，它可以與蛋白質(zhì)多肽型外表活性劑，它可以與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約鏈中的氨基酸殘基按大約1 1 1.4 1.4比比例結(jié)合。

3、例結(jié)合。l每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都由于結(jié)合了許多每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都由于結(jié)合了許多的的SDSSDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷那么可以忽略。該法分子原有的電荷那么可以忽略。該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分別蛋白質(zhì)。分別蛋白質(zhì)。l用知分子量的蛋白質(zhì)作為規(guī)范，那么用知分子量的蛋白質(zhì)作為規(guī)范，那么可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。l將兩性電解質(zhì)將兩性電解質(zhì)(eg:pH3-9(eg:pH3-9，pH5-7)pH5-7)同同蛋白質(zhì)樣品一同參與到曾經(jīng)灌好的蛋白質(zhì)樣品一同參與到曾經(jīng)灌好的凝膠中，在電場下，兩性電

4、解質(zhì)首凝膠中，在電場下，兩性電解質(zhì)首先到達(dá)它的等電點(diǎn)而平衡，蛋白質(zhì)先到達(dá)它的等電點(diǎn)而平衡，蛋白質(zhì)樣品根據(jù)它本身的等電點(diǎn)分別向兩樣品根據(jù)它本身的等電點(diǎn)分別向兩極挪動(dòng)，最后也到達(dá)平衡。極挪動(dòng)，最后也到達(dá)平衡。l等電聚焦：這種按等電點(diǎn)的大小，等電聚焦：這種按等電點(diǎn)的大小，生物分子在生物分子在pHpH梯度的某一相應(yīng)位置梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)展聚焦的行為稱等電聚焦。上進(jìn)展聚焦的行為稱等電聚焦。l等電聚焦的特點(diǎn)就在于它利用了一種稱為兩性電解質(zhì)載體的物質(zhì)在電場中構(gòu)成延續(xù)的pH梯度，使蛋白質(zhì)或其他具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)的樣品進(jìn)展聚焦，從而到達(dá)分別、測定和鑒定的目的。 銀染結(jié)果銀染結(jié)果考馬斯亮染色為藍(lán)色考馬斯亮染色

5、為藍(lán)色l此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)展分別的方法。將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)展分別的方法。l離子交換樹脂可以分為陽離子交換纖維素離子交換樹脂可以分為陽離子交換纖維素, ,如羧甲基纖維素如羧甲基纖維素(CM(CM纖維素等，陰離子交纖維素等，陰離子交換纖維素?fù)Q纖維素, ,如二乙基氨基乙基纖維素如二乙基氨基乙基纖維素DEAEDEAE纖維素等。纖維素等。l帶正電荷多的蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷多的蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷少的蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合那么較弱。帶正電荷少的蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合那么較弱。用不同濃度的陽離子洗

6、脫液，如用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaClNaCl溶液進(jìn)溶液進(jìn)展梯度洗脫，經(jīng)過展梯度洗脫，經(jīng)過Na+Na+的離子交換作用，可的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)展分別。以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)展分別。離子交換層析法離子交換層析法離子交換層析法離子交換層析法l此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺構(gòu)成的凝膠珠。凝膠珠的聚丙烯酰胺構(gòu)成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀構(gòu)造。內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀構(gòu)造。lSephadex G10-G200(Sephadex G10-G200(葡聚糖凝膠葡聚糖

7、凝膠) )lSepharose2B,4B,6B(Sepharose2B,4B,6B(瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠) )lSephacryl S100,S200,S300,S400Sephacryl S100,S200,S300,S400l ( (聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠) )l這是一種高效分別純化蛋白的方法。其原理這是一種高效分別純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識(shí)別和結(jié)合才干。特殊配基具有不同的識(shí)別和結(jié)合才干。l選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識(shí)別和結(jié)協(xié)作選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識(shí)別和結(jié)協(xié)作用的配基，然后運(yùn)

8、用化學(xué)方法將該配基與載用的配基，然后運(yùn)用化學(xué)方法將該配基與載體共價(jià)銜接。將這種銜接有配基的載體裝入體共價(jià)銜接。將這種銜接有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)那么合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)那么流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。l 常用的配基有抗體、抗原、激素常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等?；蚴荏w蛋白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。l純度和分子量的測定：采用電泳純度和分子量的測定：采用電泳如聚丙烯酰胺凝膠電泳、分子如聚丙烯酰胺凝膠電泳、分子篩層析、高速離心、高效液相色譜篩層析、高速離心、高效液相色譜等技