K部分-LRS教案ppt課件

1、 轉錄是以雙鏈DNA為模板，在ATP、UTP 、CTP、GTP四種核苷酸存在的條件下，由RNA聚合酶催化合成單鏈RNA的過程，其合成方向是 ： 53 編碼鏈編碼鏈coding strand:與與mRNA具有一樣的序列，具有一樣的序列，又稱為有義鏈又稱為有義鏈 sense strand.反義鏈反義鏈(antisense strand) ：合成：合成RNA的模版鏈，又稱的模版鏈，又稱為模板鏈為模板鏈 (template strand ). 起始起始 RNA 聚合酶結合到雙鏈聚合酶結合到雙鏈DNA上；上； 聚合酶在聚合酶在DNA 上滑動找到啟動子；上滑動找到啟動子； DNA 螺旋的解開螺旋的解開 從

2、起始位點開場所成從起始位點開場所成, 該位點標為該位點標為1。轉錄單位轉錄單位 ：轉錄為單一：轉錄為單一RNA的一段的一段DNA序列，起始于啟序列，起始于啟動子動子 ，在終止子處終了終止子，在終止子處終了終止子啟動子啟動子 ：是：是RNA聚合酶結合并發(fā)起聚合酶結合并發(fā)起RNA合成起始反響的合成起始反響的一段一段DNA序列序列延伸：延伸： 在在RNA的的3參與參與dNTP; RNA聚合酶沿著聚合酶沿著5 3 延伸新合成的延伸新合成的RNA鏈，鏈， RNA聚合酶本身那么沿著反義聚合酶本身那么沿著反義DNA鏈從鏈從3 5 前進。前進。終止：終止： 轉錄復合物從模板鏈上分別，轉錄復合物從模板鏈上分別，

3、RNA從從DNA上零落下來；上零落下來； 終止發(fā)生在特異的一段終止發(fā)生在特異的一段DNA序列終止子，經(jīng)常發(fā)序列終止子，經(jīng)常發(fā)生在發(fā)夾構造上生在發(fā)夾構造上, 有些終止子需求有些終止子需求rho 蛋白因子作蛋白因子作為輔助因子才干起到終止作用，有些那么不要為輔助因子才干起到終止作用，有些那么不要rho 蛋蛋白因子白因子 的存在。的存在。E. coli 聚合酶聚合酶: a 亞基亞基 中心酶有兩個一樣的中心酶有兩個一樣的a亞基；亞基； a 亞基由亞基由 rpoA 基因編碼；基因編碼； a 亞基對于全酶組裝必需；亞基對于全酶組裝必需； a 亞基尚沒有發(fā)現(xiàn)明確的轉錄功能，亞基尚沒有發(fā)現(xiàn)明確的轉錄功能， 但

4、是對于但是對于啟動子的識別很重要。啟動子的識別很重要。 全酶全酶 =中心酶中心酶+亞基由亞基由 rpoB 基因編碼基因編碼, 為中心酶的成分；為中心酶的成分； 亞基被以為是亞基被以為是RNA聚合酶的催化中心：聚合酶的催化中心：b亞基能夠包含兩個構造域，一個擔任轉錄亞基能夠包含兩個構造域，一個擔任轉錄起始，一個擔任轉錄延伸。起始，一個擔任轉錄延伸。E. coli聚合酶聚合酶: b亞基亞基E. coli 聚合酶聚合酶: b 亞基亞基 1. 由由 rpoC 基因編碼，為中心酶的組分基因編碼，為中心酶的組分.2. 亞基亞基 結合兩個結合兩個 Zn2+,兩個兩個 Zn2+ 能夠參能夠參與了該與了該 酶的

5、催化中酶的催化中 心：心： b 亞基能夠擔任亞基能夠擔任酶與模板酶與模板DNA的結合的結合 . s s 因子因子 經(jīng)過將中心酶對非特意性序列的親和經(jīng)過將中心酶對非特意性序列的親和力的降低力的降低(104(104倍倍) )，同時添加其對啟動子的親，同時添加其對啟動子的親和力來協(xié)助啟動子的識別和力來協(xié)助啟動子的識別. . 2. s 2. s 因子的結合將中心酶轉變?yōu)槿?，因子的結合將中心酶轉變?yōu)槿福?s s 因因子在起始后當子在起始后當RNARNA鏈延伸到鏈延伸到 8-9 nt 8-9 nt時，時， s s 因因子會從全酶上釋放下來。子會從全酶上釋放下來。 3. 3. 細胞內細胞內s s 因子的

6、數(shù)量只需中心酶的因子的數(shù)量只需中心酶的3030。E. coli 聚合酶聚合酶: s 因子因子 2. 需求需求DNA模板的激活，尤其是雙鏈模板的激活，尤其是雙鏈DNA模板，其合成方向是模板，其合成方向是 5 3；RNA 聚合酶聚合酶: 以以DNA為模板合成為模板合成RNA.1. 合成合成RNA不需求引物；不需求引物；3. RNA 的生物合成需求的生物合成需求 Mg2+ 存在存在4. 一切的一切的RNA 聚合酶短少聚合酶短少 3 5 內切核內切核酸酶活性酸酶活性, 合成插入堿基發(fā)生錯誤的頻率普合成插入堿基發(fā)生錯誤的頻率普通是通是1/104 to 105 個核苷酸；個核苷酸； 細菌噬菌體細菌噬菌體T

7、3 和和 T7 RNA聚合酶就是單聚合酶就是單鏈的多肽鏈的多肽5. RNA 聚合酶普通是多亞基的酶，但是也聚合酶普通是多亞基的酶，但是也不是一概而論不是一概而論. 6. RNA聚合酶隨著不同的生物種類的不同聚合酶隨著不同的生物種類的不同有所區(qū)別有所區(qū)別7. E. coli 還有依賴于單鏈還有依賴于單鏈DNA的的RNA聚合聚合酶，可以合成各種方式的酶，可以合成各種方式的 RNA. 啟動子效率啟動子效率 : 是是RNA聚合酶結合并起始轉錄的一聚合酶結合并起始轉錄的一段保守的段保守的DNA序列序列1.轉錄起始位點為轉錄起始位點為1 (position +1), 因因此轉錄啟動子的位置數(shù)為副值；此轉錄

8、啟動子的位置數(shù)為副值；2.包含有對包含有對RNA聚合酶結合和起始轉錄聚合酶結合和起始轉錄的一段短的序列；的一段短的序列；3.突變分析闡明，只需很短的幾個保守突變分析闡明，只需很短的幾個保守序列是啟動子行使功能所必需的。序列是啟動子行使功能所必需的。K3 The E. coli 70 啟動子啟動子啟動子大?。簡幼哟笮。?.70 啟動子由啟動子由 4060 bp的序列組成的序列組成, -55 to +20 被被聚合酶結合聚合酶結合;2.-20+20 區(qū)域在區(qū)域在DNaseI消化時被劇烈維護；消化時被劇烈維護；3.突變分析闡明，直至突變分析闡明，直至 40 的區(qū)域對啟動子的功能是的區(qū)域對啟動子的功

9、能是必需的；必需的；4. 在在-10 到到 -35 區(qū)域間的的兩個區(qū)域間的的兩個 6 bp 序列在序列在E.coli啟啟動子中尤為重要。動子中尤為重要。-10 序列序列1.6 bp 的保守序列大約在的保守序列大約在 10 位置位置 (Pribnow, 1975)；2. 共有的一致序列是：共有的一致序列是： TATAAT；3. 起始的兩個堿基起始的兩個堿基(TA) 和最后的堿基和最后的堿基 T 在在E.coli啟動子中最保守；啟動子中最保守；4. 這個六堿基序列到轉錄起始點的堿基數(shù)為這個六堿基序列到轉錄起始點的堿基數(shù)為5 到到 8 bp ，雖然其間隔序列不重要但是堿基，雖然其間隔序列不重要但是堿

10、基數(shù)間隔重要；數(shù)間隔重要；5. 10序列是聚合酶啟動序列是聚合酶啟動DNA解旋的序列；解旋的序列； -35 序列序列提高提高RNA聚合酶識別和與聚合酶識別和與s 因子因子的相互作用的才干的相互作用的才干1.35 位置附近的一段保守的六位置附近的一段保守的六詳細序列；詳細序列；2. 一致序列為：一致序列為： TTGACA；3.起始三個堿基起始三個堿基 (TTG) 在在 E. coli 啟動子中最保守；啟動子中最保守；4. 在在90%的的E. coli 啟動子中，與啟動子中，與 10 序列間的間隔為序列間的間隔為 16-18nt。轉錄起始點轉錄起始點 1. 在在90%的基因中轉錄起始點為的基因中轉

11、錄起始點為 嘌呤；嘌呤；2.G 在轉錄起始點比在轉錄起始點比 A更加常見；更加常見；3.通常通常, 在轉錄起始點的兩側是在轉錄起始點的兩側是C 和和 T 堿基堿基 (i.e. CGT 或或 CAT)轉錄起始點周圍的序列影響轉錄的起始：啟動子效率啟動子效率 (1)主要影響要素主要影響要素:不同啟動子間的序列差別很大，轉錄不同啟動子間的序列差別很大，轉錄的效率相差可以到達的效率相差可以到達1000倍倍; -35序列組成加強與聚合酶序列組成加強與聚合酶因子相因子相互識別和相互作用的識別區(qū)；互識別和相互作用的識別區(qū)； -10 序列對于序列對于DNA的解旋很重要；的解旋很重要； 起始位點附近的序列可以影

12、響轉錄起始位點附近的序列可以影響轉錄的起始的起始.啟動子效率啟動子效率 (2)：同時留意同時留意:最初轉錄的最初轉錄的30個堿基序列也影響轉錄：個堿基序列也影響轉錄：該序列控制該序列控制RNA聚合酶分開啟動子，可以使聚合酶分開啟動子，可以使另外一個聚合酶復合物重新起始轉錄，由此另外一個聚合酶復合物重新起始轉錄，由此影響轉錄的速率甚至整個啟動子的強度影響轉錄的速率甚至整個啟動子的強度. DNA的負超螺旋可以加強轉錄的起始；的負超螺旋可以加強轉錄的起始；某些啟動子的啟動強度不夠，需求輔助因子某些啟動子的啟動強度不夠，需求輔助因子的激活：的激活： 如如 Lac 啟動子啟動子 Plac 需求需求 cA

13、MP 受體蛋白受體蛋白 (CRP )的的 結合以加強轉錄的起始。結合以加強轉錄的起始。K4 轉錄的起始、延伸和終轉錄的起始、延伸和終止止 與啟動子與啟動子的結合的結合 DNA鏈鏈 的解旋的解旋RNA 鏈鏈的起始的起始 RNA 鏈鏈的延伸的延伸 RNA 鏈鏈的終止的終止 Rho因子依因子依賴的終止賴的終止 Promoter binding 中心酶中心酶 (2 ) 對對 DNA具有具有非特異性的結合才干非特異性的結合才干 (松散結合但松散結合但是穩(wěn)定是穩(wěn)定, 因子的參與，中心酶對因子的參與，中心酶對非特異非特異DNA的親和力降低的親和力降低20000 倍倍 ). 因子使全酶結合到特異性啟動因子使全

14、酶結合到特異性啟動子的才干加強子的才干加強100倍倍 RNA聚合酶經(jīng)過滑動找到啟動子聚合酶經(jīng)過滑動找到啟動子序列，識別雙鏈的序列，識別雙鏈的35 和和 10 序序列，聚合酶和配對形狀的啟動子列，聚合酶和配對形狀的啟動子DNA構成閉合的復合物。構成閉合的復合物。DNA 解旋：解旋： 為使反義鏈實現(xiàn)堿基配對，為使反義鏈實現(xiàn)堿基配對，DNA雙螺旋必需被聚合酶解旋；雙螺旋必需被聚合酶解旋；負超螺旋可以加強許多基因的負超螺旋可以加強許多基因的轉錄轉錄 ，但是也有例外的，如：，但是也有例外的，如：促旋酶那么被負超螺旋抑制促旋酶那么被負超螺旋抑制 ； DNA 的初始解螺旋導致的初始解螺旋導致DNA與聚合酶構

15、成開放的復合物，這與聚合酶構成開放的復合物，這一過程稱為嚴密結合；一過程稱為嚴密結合；RNA 鏈的延伸：鏈的延伸： 不需求引物不需求引物 ； 鏈以鏈以 GTP (more common) 或或 ATP開場；開場； 聚合酶最先摻入最初兩個核苷聚合酶最先摻入最初兩個核苷酸；酸； 最先的九個堿基依次加上，酶最先的九個堿基依次加上，酶并不沿并不沿DNA挪動，在這九個核苷挪動，在這九個核苷酸的參與過程中，該鏈隨時有流酸的參與過程中，該鏈隨時有流產(chǎn)的能夠；產(chǎn)的能夠；啟動子去除的最短時間為啟動子去除的最短時間為1-2 秒秒 (a relatively long event)RNA 鏈的延伸：鏈的延伸： RN

16、A聚合酶釋放出聚合酶釋放出因子，構因子，構成聚合酶成聚合酶DNA新生新生RNA的三的三聚復合物聚復合物 轉錄泡轉錄泡 (DNA的解鏈區(qū)的解鏈區(qū), 17 bp) 能夠和能夠和RNA聚合酶一同沿著聚合酶一同沿著DNA鏈向前挪動，前端解旋，后鏈向前挪動，前端解旋，后端重新構成超螺旋；端重新構成超螺旋； RNA的的3 與反義的與反義的DNA構成雜構成雜交的雙鏈交的雙鏈 (約約. 12bp) ； E. coli RNA聚合酶向前挪動的聚合酶向前挪動的速率普通約為每秒速率普通約為每秒 40 nt.RNA 鏈的終止：鏈的終止： 終止終止: RNA 鏈的分別鏈的分別 DNA的重新超螺旋的重新超螺旋 RNA聚合

17、酶的釋放；聚合酶的釋放； 終止序列：終止信號，終止序列：終止信號，RNA發(fā)夾構造是常見發(fā)夾構造是常見的終止信號；的終止信號； 不是一切的發(fā)夾構造都可以有效終止轉錄不是一切的發(fā)夾構造都可以有效終止轉錄, 此時需求輔助因子此時需求輔助因子rho() 蛋白介導轉錄的終蛋白介導轉錄的終止。止。RNA RNA 發(fā)夾構造：發(fā)夾構造： 1. RNA 轉錄后自我配對構成的構造；轉錄后自我配對構成的構造； 通常莖部富含通常莖部富含G-C，利于堿基配對的穩(wěn)定，利于堿基配對的穩(wěn)定，進而使進而使RNA聚合酶停頓下來；聚合酶停頓下來；在發(fā)夾的后面通常有在發(fā)夾的后面通常有4個或一連串的個或一連串的U，使之，使之與反義與反

18、義DNA鏈的配對作用減弱；鏈的配對作用減弱；依賴于依賴于Rho-Rho-蛋白的終止：蛋白的終止： 雖然雖然RNA聚合酶可以在一連串的聚合酶可以在一連串的U殘基的發(fā)夾處終止，但是有的終殘基的發(fā)夾處終止，但是有的終止位點不構成強的發(fā)夾構造，必需止位點不構成強的發(fā)夾構造，必需有一種輔助因子即有一種輔助因子即Rho 蛋白蛋白協(xié)助終止；協(xié)助終止； Rho 蛋白可結合到單鏈蛋白可結合到單鏈RNA的一的一段序列上；段序列上； Rho 蛋白蛋白(六聚體六聚體)然后水解然后水解 ATP并沿著新生的并沿著新生的RNA朝轉錄復合物的朝轉錄復合物的方向前進，促使方向前進，促使RNA聚合酶終止轉聚合酶終止轉錄。錄。終止子：終止子： 轉錄復合物發(fā)生分別的一轉錄復