基因工程的工具酶

1、基因工程的工具酶n 限制性核酸內(nèi)切酶n DNA連接酶n DNA聚合酶n 堿性磷酸酶n 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具限制性核酸內(nèi)切酶不僅是DNA重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定防御機(jī)制: n 任何物種都有排除異物、保護(hù)自身的防御機(jī)制 n 人：免疫系統(tǒng) n 細(xì)菌：限制與修飾系統(tǒng) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段, 各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自身的DNA不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)

2、胞還合成了一種修飾酶，對(duì)自身的DNA進(jìn)行了修飾，限制性酶對(duì)修飾過的DNA不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。限制酶 (restriction enzyme)修飾酶 (modifying enzyme)核酸酶切位點(diǎn)：既可以在3,5-磷酸二酯鍵的3酯鍵處（A），也可以在5酯鍵處（B）切斷磷酸二酯鍵1） 核酸限制性內(nèi)切酶的類型2） 核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性3） 同裂酶和同尾酶4） 核酸限制性內(nèi)切酶的命名法5） 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性按照限制酶的組成、與修飾酶活性的關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類： 型 型* 型第一類（I型）限制性內(nèi)切酶： 能

3、識(shí)別專一的核苷酸順序 并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈 但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的 這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因 如：EcoB、EcoK等第二類(II型)限制性內(nèi)切酶： 能識(shí)別專一的核苷酸順序（回文對(duì)稱順序） 并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈 是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一 這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱順序：有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同n 切割后形成具有粘性末端（cohesiv

4、e end）的DNA片段n 切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段限制酶在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，形成的DNA片段沒有突出的單鏈第三類（ III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序,在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端，因此不能應(yīng)用于基因克隆同裂酶和同尾酶n 同裂酶（同切酶或異源同工酶） ： 兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，有時(shí)其差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。 例如： Hpa和Msp的

5、識(shí)別順序都是CCGG 如果其中有5-甲基胞嘧啶，則只有Hpa能夠切割n 同尾酶： 有時(shí)兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶 可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn) 如：Xba1、Nhe1以及Spe1切割的DNA序列不同，但均給出相同的“CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個(gè)新的4核苷酸的酶切位點(diǎn)，即 Bfa1的酶切位點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶的命名法n 取微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成三個(gè)斜體字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后發(fā)現(xiàn)幾個(gè)不同的酶

6、，則用羅馬數(shù)字加以表示n EcoR I E: 表示大腸桿菌屬名第一個(gè)字母 co: 表示種名頭兩個(gè)字母 R: 表示菌株名 I: 表示該菌中第一個(gè)被分離出來的酶影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素n 反應(yīng)的溫度n DNA的純度n 溶液中離子濃度及種類n 緩沖液的pH值n 酶切時(shí)間n DNA的分子結(jié)構(gòu)限制性內(nèi)切酶在保溫過程中的活性變化（圖解）反應(yīng)體系n 10 X Buffern DNAn 酶n H2O注意酶的濃度：并不是加得越多越好！根據(jù)DNA的量選取合適的酶量1個(gè)酶單位：以20L反應(yīng)體系中反應(yīng)1小時(shí)，使1 g DNA完全消化所需要的酶量DNA末端長度對(duì)限制酶切割的影響n 限制酶切割DNA時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端

7、的非識(shí)別序列有長度的要求，也就是說，在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則很難發(fā)揮切割活性n 限制性內(nèi)切酶的Star activity 是指當(dāng)酶的反應(yīng)條件改變時(shí)，其在識(shí)別序列以外的位點(diǎn)進(jìn)行切割修飾酶-甲基化酶又稱甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase)在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶實(shí)驗(yàn)室里大部分大腸桿菌菌株含有3個(gè)位點(diǎn)特異的甲基化酶:n Dam甲基化酶,由dam基因編碼,將S-腺苷甲硫氨酸的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到GATC中A的N6位置上n Dcm甲基化酶,由dcm基因編碼,以前稱Mec甲基化酶,在C5位置修飾CCAGG和CCTGG的胞嘧啶(C)殘基, 位點(diǎn)256-512bp出現(xiàn)一次n

8、 EcoK I甲基化酶,識(shí)別AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中的A的N6位置，位點(diǎn)少,約8 kb出現(xiàn)一次n Sss I甲基化酶 從某種Dam + 或Dcm +的菌株中分離的DNA可能抗從自身分離的限制性內(nèi)切酶的切割 例如: Mbo I 和Sau 3A I識(shí)別序列GATC 從Dam+大腸桿菌中分離到的DNA完全不受 Mbo I 的切割, 但是不抗Sau 3A I來自原核生物螺原體（Spiroplasma sp.），可使CG序列中的C在C5位置上甲基化 Sss I甲基化的DNA受E.coli中mcrA, mcrBC和mrr系統(tǒng)的限制許多酶對(duì)此甲基化酶敏感，如：Aat II, Cl

9、a I, Xho I, Sal I如果將外源DNA引入一個(gè)大腸桿菌的宿主,它可能會(huì)受宿主細(xì)胞中的限制系統(tǒng)的襲擊因此, 消除大腸桿菌重組分子宿主菌株中的限制系統(tǒng)具有重要意義（大腸桿菌的所有限制系統(tǒng)都集中在一個(gè)長約14 kb的遷移控制區(qū)內(nèi)）某些菌株在這些基因中的某個(gè)上攜帶突變 如: DH5菌株在hsdS基因內(nèi)有突變, 因此是EcoK I內(nèi)切酶缺陷型的 普遍應(yīng)用的菌株HB101是整個(gè)遷移控制區(qū)都缺失,因此缺乏所有的限制活性DNA連接酶：在體外將目的基因和載體共價(jià)連接構(gòu)成重組DNA分子T4 DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶反應(yīng)體系n 5 X Buffer (10 X Buffer )n Vectorn

10、 DNA Fragmentn T4 DNA Ligasen H2O連接反應(yīng)的溫度n 平末端 16 4-16 hourn 粘性末端 16 3 hour or 4 16 hourDNA聚合酶不同種類的DNA聚合酶在DNA的復(fù)制和修復(fù)中起到重要的作用n 大腸桿菌DNA聚合酶In Klenow 大片段n 耐熱 DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I的酶活性： 1） 53 DNA聚合酶活性 2） 53 DNA外切酶活性（ 5端降解） 3） 3 5 DNA外切酶活性（糾錯(cuò)）Klenow 大片段： 大腸桿菌DNA聚合酶I 經(jīng)蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段活性： 1）53 DNA聚合酶活性 2）3 5 DNA外切酶活性（糾錯(cuò)）耐熱 DNA聚合酶 來自于嗜高溫的細(xì)菌， 主要用于PCR反應(yīng) 如：TaqDNA聚合酶 Vent DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶 Pwo DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶堿性磷酸酶n 去除5磷酸基團(tuán)n 底物: DNA、RNA、脫氧核糖核苷三磷酸n 應(yīng)用： a. 5端標(biāo)記之前的處理b. 處理克隆載體防止載體自連 c. 外源DNA片段的末端處理防止片段間的連接目前常用的有兩種：細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP），耐高溫，不易失活，要終止和滅活它很困難小牛腸道堿性磷酸酶（CIP），可在65加熱45min滅活，活性高，因此更為常用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）n 從小牛胸腺中分離純化出來的特點(diǎn)