microRNAmiRNA引物設(shè)計及過程原理說明

1、microRNA(miRNA引物設(shè)計及過程原理說明microRNAs的平均長度23nt左右，所以miRNA!H物設(shè)計與常規(guī)引物設(shè)計存在很大差別，以下講解一下整個miRNA引物設(shè)計的過程加上實驗流程，以幫助大家對各方面的學習。首先，引物設(shè)計之前先介紹miRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程。我們拿經(jīng)典頸環(huán)序列g(shù)tcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactGGATaCgac開DNAstar軟件的PrimerSelect；file打開下拉菜單；打開EnterNewPrimer；粘貼頸環(huán)序列；點擊OK頸環(huán)結(jié)構(gòu)已經(jīng)輸入，下面查看頸環(huán)結(jié)構(gòu)同形成的那些發(fā)夾結(jié)構(gòu)。選擇頸環(huán)結(jié)構(gòu)(鼠標點一下)；

2、點擊Report下拉菜單；選擇PrimerHairpins。=PrimerSelect-PrimerCatalogNet Search WindowQFileEditConditionsLocateLog|Report|OptionsHelp/£NameLenglPrimerSelfDimersPrimerPairDimersCtd+DUntitled44PrimerHafrpfnsAmplrficationSummaryCompositionSummaryCtrl* Ctrl+ Ctrl+;Located Primer PrrsDocument WindowLocatedPrime

3、rs&ProbesPrinnerSlect-HairpinFormationMFileEdrtConditionsLocateLogReportOptionsNetSearchWindowHelpPrimer:UnQtle824hairpins11isbd.Untitled,14bp(Loop=4),dG=-20.4kc/m(bad!)5GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGxIIIIIIIIIIIIIII31CAGCATAGGTCACGCTTATGGAUntitled.3bp(Loop=6)1dG=-0.9kc/rm5GTCGTATCCAGTx31CAGCATAGGTCACGC

4、TTATGGAGCCTGGGACGUntitled,3bp(Loop=5)tdG=48kc/m51GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGxIIIIIIIT31CAGCATAGGTCACGCTTA第一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)是實驗所需的結(jié)構(gòu)(dG=-20.4kc/m)。下面結(jié)合has-miR-122-5P合成cDNA的具體過程講解has-miR-122-5P:UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU將U轉(zhuǎn)T,方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTmiRNAs的頸環(huán)結(jié)構(gòu)引物：是將miRNAs的3'端后6位堿基反向互補添加到經(jīng)典頸環(huán)結(jié)構(gòu)的3'端形成的結(jié)構(gòu)。（

5、自己根據(jù)后面圖片想一下原因，加6個堿基為經(jīng)驗所授）has-miR-122-5P的后6位：GTTTGThas-miR-122-5P的后6位的反向互補序列：ACAAAC頸環(huán)引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3查看形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（方法前面有講）MPrEmer&eiect-HairpinFormationm=i，LbJ。FileEditConditionsLocateLogReportOptionsNetSearchWindowHeip_fiUntitled, 20 bp (Loop=4), dG =

6、-30.9 kc/m (ba叫TGGAGTGTGAQAATGGTGTTTGTGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG I H I Pl I I I I I I I I I I I I I I3' CAAACACAGCATAGGTCACGCTTATGGA在含反轉(zhuǎn)錄酶及適當?shù)臈l件下，miRN府口其頸環(huán)引物將會合成cDNA:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCTGTCACACTCCAPrirngr:Untitled.36hairpins,1冶b己cLUntstled,14bp(Loop=4)FdG=-20.4kc/m(

7、bad!)二5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGIIIIIIIIIHIIII3fCAAACACAGCATAGGTCACGCTTATGGA看一下miRN"口頸環(huán)引物在一起會是怎么樣子:MPrimc<Select-HairpinFormatlaiHFrleEditConditionsLocateLogReportOptionsNetSeardiWindowHelpPHm自r:Untitled,78hairpins,2armb自d.查看cDNA吉構(gòu):Prime*Premil:diLYi朗內(nèi)u門匚Uw什白r»ad性畏。白內(nèi)j-kp.而ec百eIeW-Mji

8、rpinFanTia:iankfileEditCofidicion&LocateLoiR.epo*lOptionsM耐52“hWWowHdpPrimer：Untitled,64hairpiinsii28呂bad.Untitled.14bp(Loop=4),dG=-20.4kc；m(bad!5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGIlli11111III3,ACCTCACACTGTTACCACAAACACAGCATAGGTGACGCTTATGGA我們知道了cDNA勺合成過程和序列，同時學習了miRNA勺反轉(zhuǎn)錄過程。下面進入重頭戲，教大家如何進行miRNA引物設(shè)計。首先如果

9、你的前面實驗是芯片的就在miRbase上再查看核對一遍，如果是測序?qū)嶒灥男枰獙iRNA的名字3P或5P及之前的部分復制到miRAN±查找完整序歹Jo將得到的miRNAlg整序列復制到一個excel表中，然后使用查找替換將U改為T（一定要記住改換，要不然primer5.0是不認U的）。為了后面引物設(shè)計方便，需要以miRNA序列構(gòu)建引物，所以需要將miRNA的cDNA勺反向互補序歹J找出。使用primer5.0。打開File下拉菜單；NewDNASequence由于正規(guī)設(shè)計過程中不會先把cDNA列找出來，所以直接操作過程為先將miRNA歹J（U改T）輸入，再輸入頸環(huán)結(jié)構(gòu)序列的反向互補序

10、列。復制miRNAff列（U改T）;點擊primer5.0序列框，使用組合鍵Ctrl+V”粘貼序列；選擇正向序列復制頸環(huán)結(jié)構(gòu)序列；點擊primer5.0序列框，使用組合鍵Ctrl+V”粘貼序列；選擇反向互補序列輸入ReverseComplemented到這一步cDNA的反向互補序列已經(jīng)輸入完畢，下一步是在primer5.0上進行引物設(shè)計。1.在序列前面輸入9個N（這個是個人習慣，也有人是6個或以上的A,也有人是不輸入就直接設(shè)計引物的），因為miRNAff列太短，很多時候不能設(shè)計出符合實驗需要的miRNA所以在2.3.4.5.設(shè)計正向引物時，一般需要加入3-6個堿基，最多時加入8個堿基，以滿足正

11、向引物的設(shè)計；點擊Function框下的Primer,開始設(shè)計上下游引物；有經(jīng)典頸環(huán)結(jié)構(gòu)自然也就少不了常用的下游引物，一般使用CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC適當?shù)脑陬i環(huán)序列中前后移動堿基設(shè)計下游引物；自動跳出的顯示框中默認選擇的是下游引物，正好符合先將常用下游引物輸入的操作。下游引物相當比較固定，先輸入下游引物對整個引物設(shè)計能夠提高設(shè)計效率。點擊框內(nèi)的EditPrimers;選擇所有引物序列；使用組合鍵Ctrl+V”輸入下游引物，輸入方式為反向輸入Reversed;Primer:由ResultErimersDirect SeLect：斗 Sea

12、rchEdit Primertn nnnn nitr-iA 二 ZTCkCACT g i tacz2Qiniiiiimiiiii& ' NNWHHNm-rrGG A ST ST GAC AAT CG?* * * W s V T M VRatingSeq MoLengthJTm2-y*點擊OK點擊Analyze分析引物基本信息；點擊Prime尋找引物在序列里結(jié)合部位；點擊OK確定下游引物；6 .點擊上下游轉(zhuǎn)換鍵（圖示），開始設(shè)計上游引物；點擊EditPrimers；emier上下游引物轉(zhuǎn)換健Primer:SearchBResults昭既rimersDirect Select:It

13、n的t esIIIIIIIIIIElItlI3,NNKMNKNNNACCTCACACTCTTACCACAAACACAGCArAGGTCACGCTTATGSAGCCT&SGACffTGACCTATGOTG4020RatingSeq NoLengthTm (qGC.AG k&almolActivity 111gg0DegeneracyTa Opt PCJS«nsetoo12S0.05C;0-4S.632.0262144Anti-sense8B532069.760.0-39J31.91ProductQ6SS3.5一33r5WHairpinDimerFatsePrimingC

14、ross DimerNoneNoneNoneNoneAnti sen$&NoneI l-uund |NoneHq Hairpins Found7 .去除前面的9個N；點擊Analyze；點擊prime;查看前面不添加序列時的上游引物狀況如何在這里的主要問題是Tm值太低，第二個問題是長度稍短。8 .絕大多數(shù)情況下在前邊添加的序列已GC為主，且在加GC序列時如果序列中間不以AT隔開則TM值上升比值高，同理加AT序列。不要出現(xiàn)GCGCATATGCCG或連續(xù)4個不同的核甘酸，這些失誤會造成引物評分的降低。個人喜歡加CGGGCGCGGGCA/TGCCC等。9 .例如加入ACGGGC5'端

15、加入，別在3'端）；點擊Analyze;點擊prime；查看引物的長度和TM值差不多了就行。當然不是全行了，還要查看引物的自身頸環(huán)結(jié)構(gòu)，自身引物配對，重要指標為dG（當然還有其他，哈哈）。下游引物不用看了，因為是經(jīng)典嘛，呵呵。點擊OK10 .再查看一下引物對之間的匹對情況，加以對上游引物的修改，或者更換下游引物。有必要點擊比對框下的All查看所以的匹對情況，呵呵，希望你懂的警 Primer PremierDirect Select:三'ACGGGCTGGAGTGT3'3'NNWNMNNMNACC7CACACTGITACCACAAACACAGCATAGGTCACG

16、CTTMGGAGCCT5GGAC57GACCTATGCTG5'j-ir-r十,i-rtjrT"ji-itt-1】一it-i-r11r-r】-r-r】-r-：i-jr-rr.1101201301<01SQ1G170qa*W5VTJ1VF7SyPVBZPSTL.HWiaActivityAGSenseRatingLength59.9Anti sense63MJ55a31,536331.9DegeneracyTa OptWhOProduct6583.652J11 .想做好實驗的同學可以在DNAstar的PrimerSelect中進一步查看引物對的狀況，因為這兩款軟件讓人感覺還是有很大不同的。例如PrimerS