人參單體皂苷Rh2抑制缺氧條件下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖及整

1、人參單體皂苷人參單體皂苷 Rh2Rh2 抑制缺氧條件下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)抑制缺氧條件下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖及整合素皮細胞增殖及整合素v v3 3 表達的研究表達的研究作者：楊成明 劉偉 趙燕穎 張麗華 吳雅臻 作者單位：吉林大學第二醫(yī)院眼科，吉林 長春 130041【摘要】 目的 探討人參單體皂苷 Rh2 對缺氧條件下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞生長及整合素(integrin)v3 表達的影響。方法 建立人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞缺氧模型，并給予其不同濃度的人參單體皂苷 Rh2，應(yīng)用 MTT 法觀察人參單體皂苷 Rh2 對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖的影響;應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡的情況;用

2、RT-PCR 檢測對 Integrin v 和3 基因的表達。結(jié)果 MTT 結(jié)果顯示，缺氧對照組細胞增殖活性明顯強于正常對照組(P0.05);缺氧細胞加用 Rh2 后的增殖明顯受到抑制，與缺氧對照組比差異具有顯著性(P0.05)。RT-PCR 結(jié)果表明，和正常對照組比,缺氧對照組的細胞 Integrin v 和3 基因的表達明顯增強， Rh2 可顯著下調(diào) Integrin v和3 基因表達。結(jié)論 人參單體皂苷 Rh2 在缺氧條件下能明顯抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的生但無明顯誘導(dǎo)凋亡的作用?！娟P(guān)鍵詞】【關(guān)鍵詞】 人參單體皂苷人參單體皂苷 Rh2;Rh2;整合素整合素v v3;3;增殖增殖; ;凋亡

3、凋亡研究表明，整合素在血管生成中起著關(guān)鍵作用，其中尤以整合素v3 與新生血管生成的關(guān)系最為密切1。整合素v3 選擇性地表達于新生血管內(nèi)皮細胞中，與配體結(jié)合后通過絲裂原激活的蛋白激酶途徑使內(nèi)皮細胞增殖，分化和遷移形成血管2，但在正常細胞中不表達。人參單體皂苷 Rh2 具有提高機體免疫力，抗病毒等功效，主要用于抗腫瘤方面的研究3。近年來，其抗血管生成方面的作用逐漸引起人們的關(guān)注4。實驗表明：人參單體皂苷Rh2 通過抑制內(nèi)皮細胞增生使腫瘤缺乏新生血管網(wǎng)的供應(yīng)而無法生長和轉(zhuǎn)移5。但尚未見人參單體皂苷 Rh2 抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞增生報道。本研究旨在探討人參皂甙對人視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細胞生長的影響。

4、1 材料與方法1.1 材料 人參單體皂苷 Rh2，由本校基礎(chǔ)醫(yī)學院藥物化學教研室提供，系由西洋參中提取，純度 99.5%;噻唑藍(MTT)購自 Sigma 公司。人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞株(human retinal capillary endothelial cells,HRCEC)為本實驗室凍存，細胞在 IMDM 培養(yǎng)基(Gibico 公司)，10%胎牛血清(Hycolon 公司)條件下培養(yǎng)。1.2 HRCEC 缺氧模型的建立及分組 選用第 36 代 HRCEC 進行實驗。待細胞長滿瓶底后，用橡皮塞密封培養(yǎng)瓶口，插入兩個中槍頭作為進氣及排氣孔，將輸液用滴管通過進氣孔向瓶內(nèi)充入 5%CO2 95

5、%N2 混合氣體(0.5 kg/cm2),持續(xù)30 min，使瓶內(nèi)處于相對缺氧狀態(tài)，再放入 5%CO2 孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。HRCEC 來自于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院前列腺研究中心實驗室。實驗共分四組：正常對照組，缺氧對照組，兩個加藥組即缺氧聯(lián)合低劑量人參單體皂苷 Rh2 組(5mg/L)及缺氧聯(lián)合高劑量人參單體皂苷 Rh2 組(10 mg/L)。1.3 細胞生長抑制實驗 用相差顯微鏡觀察比較不同加藥組和對照組細胞的形態(tài)變化。用 MTT 法檢測細胞生長抑制率：細胞缺氧模型建立后，取對數(shù)生長期的后三組細胞以每孔 1104 的濃度接種于 96 孔培養(yǎng)板。培養(yǎng) 24 h 后向兩個加藥組加藥，每組設(shè) 4 復(fù)孔

6、，分別于加藥 24 h，48 h,72 h 后加 MTT(5 g/L)15 l，繼續(xù)孵育 4 h 后每孔加 150 l DMSO，震蕩 10 min，用酶標儀測定570 nm 時各孔光吸收值(A 值)。計算細胞生長抑制率，抑制率30 %為細胞對該藥敏感。細胞生長抑制率(%)=(1-加藥組 A 值)/缺氧對照組 A 值100%1.4 細胞凋亡及周期檢測 將細胞缺氧模型建立后的后三組細胞經(jīng) 0.25%胰酶消化后傳代接種于培養(yǎng)瓶中,每瓶細胞 1106,24 h 后加藥,Rh2 終濃度為 5mg/L 和 10 mg/L,對照組加等體積 PBS,各瓶終體積為 4 ml,24 h 后,收集三組細胞,用冷

7、PBS(pH 7.2)清洗 2 次,70%的冷乙醇 4 固定 24 h。用 FACStarpous流式細胞儀檢測，計算凋亡率和各期細胞所占比例。G1 峰前出現(xiàn)的亞 2 倍體峰即為凋亡峰,比 G1 期細胞 DNA 含量少的細胞確定為凋亡細胞，同時觀察細胞周期變化。1.5 RT-PCR 建立細胞缺氧模型，24 h 后向后兩組細胞加藥，繼續(xù)培養(yǎng) 24h 后收集全部四組細胞,按 Trizol 操作說明，提取 RNA，紫外分光光度計定量。以 GAPDH 為內(nèi)參，RNA 樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA,然后進行 PCR 擴增。Integrin v 擴增產(chǎn)物為 574 bp，上游引物為：5-CCAAAGCA

8、AACACCACCCAG-3，下游引物為：5-TTGAAATCTCCGACAGCCAC-3。Integrin 3 擴增產(chǎn)物為 250 bp ，上游引物為：5-TGACAATCATTACTCTGCCTCC-3，下游引物為：5-ACGCACTTCCAGCTCTACTTT-3。GAPDH 擴增產(chǎn)物為 309 bp，上游引物為:5-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 下游引物為：5-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴化乙啶),拍照鑒定和分析。1.6 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，使用2 檢驗進行統(tǒng)計分析。2 結(jié)

9、果2.1 對細胞生長狀態(tài)的影響 各組 HRCEC 加藥 24 h 后光鏡下觀察：正常對照組細胞呈梭形貼壁,鋪滿整個瓶壁。缺氧組細胞亦呈梭形貼壁,但生長速度明顯加快，可在 24 h 內(nèi)鋪滿整個瓶壁。加藥組細胞部分呈圓形貼壁，培養(yǎng)液中漂浮有細胞和細胞碎片,細胞數(shù)較對照組明顯減少，且高劑量用藥組的細胞狀態(tài)比低劑量用藥組更差(見圖 1)。2.2 Rh2 對 HRCEC 增殖的影響 MTT 結(jié)果顯示：與缺氧對照組相比，高劑量及低劑量的人參單體皂苷 Rh2 對 HRCEC 均有生長抑制作用,并呈明顯劑量依賴性,二者間差異顯著(P0.05) ，5 mg/L 人參單體皂苷 Rh2 給藥組生長抑制率為34.1%

10、，而 10 mg/L 人參單體皂苷 Rh2 給藥組生長抑制率為 52.3%，二者比較差異具有顯著性 (P0.05)。見圖 2。A 缺氧對照組 B 5 mg/L Rh2 組 C 10 mg/L Rh2 組圖 1 不同濃度 Rh2 處理視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的生長抑制率(略)圖 2 不同濃度 Rh2 處理 HRCEC 的生長抑制率(略)2.3 Rh2 對 HRCEC 凋亡的作用 流式細胞檢測結(jié)果顯示：與缺氧對照組相比，不同劑量的給藥組細胞均被不同程度地阻滯在 G2-M 期，差異顯著(P0.05)，缺氧對照組凋亡率為 1.31%，低劑量給藥組凋亡率為 1.93%，高劑量給藥組凋亡率為 2.36%(見圖

11、3)。2.4 RT-PCR 檢測 Rh2 對 Integrin v 和3 mRNA 表達的影響 電泳結(jié)果顯示：Integrin v、3 及 GAPDH 的擴增片段大小與設(shè)計的完全一致。缺氧對照組與正常對照組相比， Integrin v 和3 mRNA 表達水平有明顯提高,而各用藥組與缺氧對照組比較 Integrin v 和3 mRNA 表達水平明顯降低，差異顯著(P0.05)(見圖 4)。圖 3 Rh2 處理 HRCEC 48 h 后流式細胞儀檢測結(jié)果(略)1：marker 2：正常對照組 3：缺氧對照組 4：5 mg/L Rh2 組 5：10 mg/LRh2 組圖 4 Rh2 對 HRCEC

12、 中 Integrin v 和3 mRNA 表達的影響(略)3 討論視網(wǎng)膜新生血管形成是個極其復(fù)雜的過程，通常認為當視網(wǎng)膜缺血缺氧時，在各種生長因子及細胞因子的刺激下，已經(jīng)存在的微血管網(wǎng)內(nèi)皮細胞發(fā)生有絲分裂、遷移，以出芽的方式形成管腔。因此內(nèi)皮細胞增生是其關(guān)鍵步驟。如能有效地打斷這一環(huán)節(jié),新生血管將無法形成67。本實驗結(jié)果表明，人參單體皂苷 Rh2 在體外同樣能有效地抑制 HRCEC 增生，從而為人參單體皂苷Rh2 體內(nèi)抑制視網(wǎng)膜新生血管形成提供了研究基礎(chǔ)。Integrin 是一類細胞表面受體家族,由和兩條鏈通過非共價鍵連接而成的異源二聚體跨膜糖蛋白6。這一類受體參與細胞與基質(zhì)，細胞與細胞之間

13、的黏附,在很多重要的生理過程中起重要作用。迄今為止發(fā)現(xiàn) 23 種 Integrin亞型，其中 Integrin v3 在新生血管內(nèi)皮細胞有高度表達，v3 與配體結(jié)合后通過絲裂原激活的蛋白激酶途徑使內(nèi)皮細胞增殖，分化和遷移形成血管。因此,Integrin v3 逐漸被認為是新生血管組織的標記物。已有實驗證明缺氧可誘導(dǎo) Integrin v3 表達的增高，而缺氧調(diào)節(jié)v3 基因的表達是血管形成的重要調(diào)節(jié)因子。盡管眾多資料顯示 Integrin 與血管生成密切相關(guān)，但其確切機制尚不清楚，可能與生長因子受體激活途徑相整合，與蛋白激酶C(PKC)，Ras 癌基因蛋白/sh2 包含蛋白/促分裂素原活化蛋白激

14、酶(Ras/shc/MAPK)，成簇黏附激酶(FAK)等信號分子相互作用，調(diào)節(jié)細胞骨架和血管生成相關(guān)基因以及血管內(nèi)皮細胞整合素受體的表達，影響內(nèi)皮細胞和細胞外基質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致血管生成的發(fā)生和維持，或血管的消退、凋亡，從而影響血管內(nèi)皮細胞的生長或消退89。本研究結(jié)果表明，通過建立缺氧模型并人為給予不同劑量的人參單體皂苷Rh2，在體外能明顯抑制 HRCEC 的增殖和生長，且呈明顯的劑量依賴性?？赡苁侨藚误w皂苷 Rh2 通過抑制 Integrin v3 在 HRCEC 的表達,使細胞阻滯在G2-M 期，從而達到抑制 HRCEC 增殖的作用。但對凋亡的誘導(dǎo)作用卻并不明顯，可能是我們所研究的細胞并

15、非腫瘤血管內(nèi)皮細胞的緣故，其機制尚待進一步深入研究。綜上所述，本實驗結(jié)果證明了人參單體皂苷 Rh2 具有抑制 HRCEC 增殖和生長的作用，這為其在臨床視網(wǎng)膜靜脈阻塞、眼缺血綜合癥、增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼缺血缺氧性疾病的治療提供了一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。因人參單體皂苷 Rh2 是從人參中提取的天然產(chǎn)物，毒副作用小，更具安全性。【參考文獻】1 Polverini PJ.Cellular adhesion molecules:newly identifiedmediators of angiogenesisJ.Am J Pathol，2006;14(8):1023-9.2 Brooks PC

16、.Roles of integrin in angiogenesisJ.Eur J Cancer，2001;32(11)：2423-9.3 竇德強，靳 玲，陳英杰.人參的化學成分及藥理活性的研究進展與展望J.沈陽藥科大學學報，1999;16(4)：151-6.4 Ruegg C，Domondo O，Marriotti A.Endothelial cell integrins andcox-2 mediators and therapeautic targets of tumor angiogenesisJ.Biochim Biophys Acta，2004;1654(1)：51-67.5 王

17、兵 .王杰軍，徐 鈞，等.人參皂苷 R 對胃癌誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用J.腫瘤防治雜志，2001;8(3)：234-6.6 Capetandes A,Gerrirsen ME.Simplified methods for consistent andselective culture of bovine retinal endothelial cells and pericytesJ.Invest Ophthalmol Vis Sci,2006;31(1):1740-4.7 Stromblad S,Cheresh DA.Integrins angiogenesis and vascular cellsurvivalJ.Chem Biol,2006;3(1):881-5.8 Byzova TV，G