研究生課質(zhì)粒dna的提取與酶切鑒定

1、汪建成汪建成 生物化學與分子生物學教研室生物化學與分子生物學教研室干細胞與組織工程中心干細胞與組織工程中心實驗內(nèi)容質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA提取提取質(zhì)粒的酶切與鑒定質(zhì)粒的酶切與鑒定（電泳檢測下次進行）（電泳檢測下次進行）實驗目的掌握質(zhì)粒提純的原理和方法掌握質(zhì)粒提純的原理和方法; ;掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學會運用內(nèi)切酶并學會運用內(nèi)切酶. .DNADNA克隆技術操作過程：克隆技術操作過程： 重組重組DNADNA技術技術/ /分子克隆分子克隆/DNA/DNA克隆技術克隆技術/ /基因工程基因工程DNA克隆技術示意圖克隆技術示意圖 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)目的基因宿

2、主細胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細胞陽性克隆株繁殖表達重組重組DNADNA技術的一般過程技術的一般過程2. 2.目的基因目的基因 和質(zhì)粒載體和質(zhì)粒載體 的連接的連接 3. 3.將重組將重組DNADNA分子導入受體細胞分子導入受體細胞 4. 4.選擇選擇5. 5.目的基因表達目的基因表達 1. 1.目的基因的獲取目的基因的獲取基因載體（gene vector）(1)質(zhì)粒的定義 質(zhì)粒是存在于細菌體內(nèi)、獨立于染色體的、可以自主復制的一類雙鏈環(huán)狀DNA，在細胞內(nèi)它們常以共價閉環(huán)的超螺旋(supercoiled)形式存在。 1-200kb(2)(2)質(zhì)粒的三種構(gòu)型質(zhì)粒的三種構(gòu)型 超螺旋超螺旋DNA(SC DNA

3、)DNA(SC DNA) 開環(huán)開環(huán)DNA(OC DNA) 線狀線狀DNA(L DNA)(3)(3)質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)高拷貝數(shù)的質(zhì)粒稱為松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)，獨立于細菌細胞而自主復制；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒一般是嚴緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)，它們的復制隨細菌染色體的復制同步進行。第第1 1個字母：（小寫）個字母：（小寫）p p代表代表plasmidplasmid；第第2 2，3 3個字母：（大寫）代表人名、實驗室名、表型性狀或其他特征的個字母：（大寫）代表人名、實驗室名、表型性狀或其他特征的英文縮寫；英文縮寫；編號：（阿拉伯數(shù)字）區(qū)別同一類型的不同質(zhì)粒編

4、號：（阿拉伯數(shù)字）區(qū)別同一類型的不同質(zhì)粒(4)(4)質(zhì)粒的命名質(zhì)粒的命名(5)(5)質(zhì)粒的發(fā)展質(zhì)粒的發(fā)展分離純化質(zhì)粒DNA 的三個主要步驟培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增（DNA的擴增與選擇）細菌的收集與裂解 收集高速離心的方法質(zhì)粒DNA的提取純化 （SDS-堿裂解法） 所有提取純化方法都是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉合環(huán)狀的性質(zhì)。實驗原理在有在有EDTAEDTA及去污劑（及去污劑（SDSSDS）存在的條件下，用堿處理細菌，可以使細菌的）存在的條件下，用堿處理細菌，可以使細菌的細胞壁破裂，釋放出細胞內(nèi)容物（染色體細胞壁破裂，釋放出細胞內(nèi)容物（染色體DNADNA、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA、蛋白質(zhì)和、蛋白質(zhì)和

5、RNARNA等）；等）；處理過程中，染色體處理過程中，染色體DNADNA斷裂成不同長度的雙鏈斷裂成不同長度的雙鏈DNADNA。強堿環(huán)境（強堿環(huán)境（pH12.0-12.5）時：宿主菌的線性雙鏈）時：宿主菌的線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質(zhì)粒雙鏈解離變性，而質(zhì)粒DNA共價閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；共價閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；當加入高濃度酸性鹽，當加入高濃度酸性鹽，pH值恢復至中性時：變性的染色體值恢復至中性時：變性的染色體DNA與變性與變性的蛋白質(zhì)以及細胞碎片凝聚成網(wǎng)絡狀大分子不溶性沉淀物；而質(zhì)粒的蛋白質(zhì)以及細胞碎片凝聚成網(wǎng)絡狀大分子不溶性沉淀物；而質(zhì)粒D

6、NA又恢復天然構(gòu)型，能溶解在上清液中，這樣通過離心可以把染色體又恢復天然構(gòu)型，能溶解在上清液中，這樣通過離心可以把染色體DNA、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起除去。復合物等一起除去。如果要提高如果要提高DNA的純度，則可以用的純度，則可以用RNA酶消化除去酶消化除去RNA，并用酚抽提法，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)。除去殘留的蛋白質(zhì)。實驗主要試劑3.Tris3.TrisClCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適能使溶菌液維持溶菌作用的最適PHPH范圍范圍( (緩沖作用緩沖作用) )實驗主要試劑實驗主要試劑變性的蛋白質(zhì)與變性的蛋白質(zhì)與SDSSDS和和K+K+形成的復合物也形形成的復合物也形成沉淀；成

7、沉淀；小分子的質(zhì)粒小分子的質(zhì)粒DNADNA卻呈天然構(gòu)型，能溶解在卻呈天然構(gòu)型，能溶解在bufferbuffer中；中； 通過離心可以把線粒體通過離心可以把線粒體DNADNA、不穩(wěn)定的大分子、不穩(wěn)定的大分子RNARNA、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS復合物等一起除去復合物等一起除去實驗步驟：加加1ml1ml培養(yǎng)物于培養(yǎng)物于EPEP管，管，12000rpm12000rpm30s30s（重復一次）（重復一次） 去上清（除凈），加入去上清（除凈），加入100ul 100ul 溶液溶液I I，充分重懸，充分重懸加入加入200ul 200ul 溶液溶液IIII，立即、輕柔振蕩數(shù)次，立即、輕柔振蕩數(shù)次加入加入

8、150ul 150ul 冰溶液冰溶液IIIIII，震蕩，震蕩10s10s，冰浴，冰浴35min35min，12000rpm12000rpm10min10min注意事項：注意事項： 1、加樣槍正確使用；、加樣槍正確使用； 2、廢液倒在水池中，槍頭、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；扔到垃圾桶中； 3、加不同溶液要換槍頭；、加不同溶液要換槍頭； 4、離心前把管擦干；、離心前把管擦干； 5、轉(zhuǎn)移上清時不要吸到沉、轉(zhuǎn)移上清時不要吸到沉淀；淀； 6、吸取酚時槍頭伸到下層、吸取酚時槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到溶液中，注意不要沾到 皮膚。皮膚。實驗二限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒（雙酶切）限制性核酸內(nèi)切酶定義

9、能在特異位點（酶切位點）上催化雙鏈DNA分子的磷酸二酯鍵斷裂,產(chǎn)生相應的限制性DNA片段。主要存在于細菌體內(nèi)。分類、（基因工程技術中常用（基因工程技術中常用型）型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫斜體；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫斜體；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫斜體；第四個字母代表細菌的特定菌株，用大寫或小寫；第四個字母代表細菌的特定菌株，用大寫或小寫；（有時無）（有時無）用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin d 屬屬 種種 株株 序序Haemophilus influenzae d株

10、株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶型限制性內(nèi)切酶的共性與特性型限制性內(nèi)切酶的共性與特性類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口、粘端切口：平端切口、粘端切口反向重復序列Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口實驗原理利用限制性內(nèi)切酶特異的識別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,產(chǎn)生一定長度的DNA片段，通過電泳對酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因（重組質(zhì)粒DNA） 重組質(zhì)粒; BamHI 、H

11、ind 限制性內(nèi)切酶;反應緩沖液;瓊脂糖凝膠電泳所需試劑和設備實驗材料重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒BamHIHind III雙酶切雙酶切電泳檢測電泳檢測5-GAATTC-33-CTTAAG-5BamHI5-AAGCTT-33-TTCGAA-5Hind III 質(zhì)粒DNA 10l 10M buffer 2l BamH 1l Hind 1l ddH2O 6l 合計合計20l準備室準備室老師已老師已加好加好同學自同學自己加己加加完輕吹數(shù)次混勻，加完輕吹數(shù)次混勻，37，1-3h雙酶切反應體系實驗操作酶切反應液（包含酶切反應液（包含BamH I, Hind III, Buffer, BamH I, Hind III

12、, Buffer, H2O H2O ）已由準備實驗的老師配好）已由準備實驗的老師配好每人一份，每份每人一份，每份10ul10ul將酶切底物（質(zhì)粒）與反應液混合將酶切底物（質(zhì)粒）與反應液混合充分混勻，瞬時離心充分混勻，瞬時離心3737C C，1-31-3小時小時電泳檢測（下次進行，請回收酶切前后的質(zhì)粒）電泳檢測（下次進行，請回收酶切前后的質(zhì)粒）載體構(gòu)建總論 載體構(gòu)建的基本流程 載體的特征、分類與選擇 酶切連接 同源重組 重組質(zhì)粒的表達1.載體構(gòu)建的基本流程目的基因片段的獲取重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒的篩選與驗證重組質(zhì)粒的表達酶切連接同源重組目的片段獲取前先根據(jù)實驗目的選擇相應的載體類型，構(gòu)建方法、篩

13、選方法等2.載體的四個主要特征多克隆位點 復制起始位點遺傳標記基因載體大小3.載體的分類（一）按來源：1.質(zhì)粒載體：多使用大腸桿菌質(zhì)粒為載體。2.噬菌體載體：多是感染大腸桿菌的噬菌體。3.病毒載體：多用于真核生物。（二）按功能：1.克隆載體：可插入外源基因，酶切位點多。2.表達載體：用于外源基因的表達（原核和真核）。（三）按進入受體細胞類型：1.原核載體。2.真核載體。3.穿梭載體：穿梭往返兩種生物之間。4.質(zhì)粒載體選擇的三點思考【1】構(gòu)建DNA重組體的目的克隆擴增/基因表達？【2】質(zhì)粒載體的類型真核/原核？【3】質(zhì)粒載體的具體圖譜信息大小/啟動子/MCS/抗性特征?質(zhì)?；咎卣鞯恼J識酶切位點

14、酶切位點酶切位點酶切位點啟動子啟動子質(zhì)粒大小質(zhì)粒大小原核抗性原核抗性多克隆位點多克隆位點復制起始點復制起始點閱讀質(zhì)粒圖譜的四步法第一步：首先看Ori的位置及類型，了解質(zhì)粒的類型。（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。（Amp水解內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。）第三步：看多克隆位點（MCS），決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。（1）應具有多個限制酶的單一切點。（2）便于外源基因的插入。（3）如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。（抗性篩選、藍白斑篩選）PS：看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DN

15、A片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第四步：是否含有其他元件：標簽蛋白元件、表達系統(tǒng)元件，即啟動子核糖體結(jié)合位點克隆位點轉(zhuǎn)錄終止信號。復制起點（Origin of replication）質(zhì)粒的篩選標記抗性基因的篩選1、菌的篩選標記Amp(氨芐霉素)Kana(卡那霉素)Tet (四環(huán)素)Cm (氯霉素) 2、真核表達的篩選標記Neo (新霉素，G418)Puro（嘌呤霉素）Hygro(潮霉素)Zeo(博來霉素)案例分析標記蛋白的篩選是否是融合蛋白是否會影響蛋白構(gòu)象 紅色熒光和綠色熒光質(zhì)粒的多克隆位點克隆位點的篩選1）：基因片段與片段連接片段A片段B2）：基因

16、片段與載體連接載體片段A1、A/B上都沒有2、A沒有，載體上有真核生物的基因結(jié)構(gòu)啟動子核糖體結(jié)合位點克隆位點轉(zhuǎn)錄終止信號(1)啟動子:促進DNA 轉(zhuǎn)錄的DNA 序列,這個DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游,是DNA 分子上可以與RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位,但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。（lac、trp、T7）(2)核糖體結(jié)合位點:mRNA 有核糖體的兩個結(jié)合位點,對于原核而言是AUG(起始密碼)和SD 序列。(3)轉(zhuǎn)錄終止序列:轉(zhuǎn)錄終止序列有助于使RNApol重點轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，控制所轉(zhuǎn)錄RNA的長度，提高RNA的穩(wěn)定性。重點思考題1：基因工程中有克隆載體和表達載體，克隆

17、載體可以在受體菌中大量復制，表達載體用于表達目的蛋白，那么實際應用中，我們的最終目的是要得到目的蛋白，克隆載體不能完成表達，有何用呢？參考解釋：參考解釋：克隆的目的比較單一，就是將你感興趣的克隆的目的比較單一，就是將你感興趣的DNADNA片段片段重組進入載體，然后在宿主細胞中大量繁殖，主要重組進入載體，然后在宿主細胞中大量繁殖，主要用于各種文庫的建立，比如人類基因組計劃；同時用于各種文庫的建立，比如人類基因組計劃；同時由于載體所能容納的目的片段的長度是有限的，而由于載體所能容納的目的片段的長度是有限的，而克隆載體沒有表達所需的各種片段，所以可以容納克隆載體沒有表達所需的各種片段，所以可以容納更

18、長的目的片段，即可以克隆足夠長的基因，效率更長的目的片段，即可以克隆足夠長的基因，效率更高。更高。重點思考題2：實際工作中，構(gòu)建兼有克隆和表達雙重功能的載體有何困難？參考解釋：參考解釋： 表達載體的目的是多樣化的，由于實際工作的需要，不同的實表達載體的目的是多樣化的，由于實際工作的需要，不同的實驗目的就需要設計不同的載體，用表達載體克隆基因不是不可以，驗目的就需要設計不同的載體，用表達載體克隆基因不是不可以，實際工作重要考慮許多因素，因此更復雜。實際工作重要考慮許多因素，因此更復雜。 例如：細菌攝取能量的能力是一定的，如果用來合成大量蛋白例如：細菌攝取能量的能力是一定的，如果用來合成大量蛋白質(zhì)

19、，合成核酸就會相應減少。另一方面，細菌承受的工作負荷也質(zhì)，合成核酸就會相應減少。另一方面，細菌承受的工作負荷也是有限的。是有限的。 綜上：完全可以構(gòu)建雙重功能的載體，但是相對效率會低很多。綜上：完全可以構(gòu)建雙重功能的載體，但是相對效率會低很多。因此，我們一般的策略是：將目的片段克隆到非常因此，我們一般的策略是：將目的片段克隆到非常簡單的克隆載體上，按照需要再克隆到可以滿足各簡單的克隆載體上，按照需要再克隆到可以滿足各種要求的表達載體上。種要求的表達載體上。重點思考題3：請回答一下基本信息。載體類別載體類別哺乳動物哺乳動物表達載體表達載體細菌抗性Amp宿主大腸桿菌、哺乳動物細胞真核啟動子CMV、

20、SV40原核啟動子T7、bla細胞篩選標記新霉素原核復制起點f1、pUC真核復制起點SV40高拷貝測序bla重點思考題4：請分析下列質(zhì)粒測序結(jié)果。參考解釋：參考解釋：5.酶切連接TATA克隆克隆重點思考題5：如何理解以下句子：“TA克隆載體可以直接克隆PCR產(chǎn)物，省去了兩端加裝識別位點的設計，PCR效率就更高?！眳⒖冀忉專簠⒖冀忉專篜CRPCR產(chǎn)物可以直接接入產(chǎn)物可以直接接入T T載體，而經(jīng)典的克載體，而經(jīng)典的克隆隆PCRPCR產(chǎn)物需要限制性內(nèi)切酶切割后接入載體，設計產(chǎn)物需要限制性內(nèi)切酶切割后接入載體，設計PCRPCR引物需要兩端加酶切位點，因此這部分序列與模引物需要兩端加酶切位點，因此這部分序列與模版不配對，自然版不配對，自然PCRPCR效率就低了。效率就低了。PSPS：如果：如果PCRPCR產(chǎn)物設計了酶切位點就可以直接克隆進產(chǎn)物設計了酶切位點就可以直接克隆進需要的載體，不必借助需要的載體，不必借助T T載體。因為高保真酶通常不產(chǎn)載體。因為高保真酶通常不產(chǎn)生生A A堿基，所以如果片段較長時，必須使用高保真酶，堿基，所以如果片段較長時，必須使用高保真酶，那么就不能使用那么就不能使用T T載，而需要設計酶切位點。載，而需要設計酶切位點。 轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導入細菌體內(nèi)使之獲得新的遺傳特性。轉(zhuǎn)染：將含有目的gene的載體轉(zhuǎn)到真核cell內(nèi)。傳統(tǒng)