化療對乳腺癌患者外周血淋巴細胞亞群及CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞的影響

1、化療對乳腺癌患者外周血淋巴細胞亞群及CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞的影響康文喜 樊 靜 河北省秦皇島市第四醫(yī)院 郵編：066001摘要： 目的 探討化療對乳腺癌患者外周血CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞及T、B、NK淋巴細胞亞群的動態(tài)變化及其臨床意義。方法 采用流式細胞儀術(shù)分析129例乳腺癌患者CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞水平及CD3、CD4、CD8、NK、B細胞和CD4/CD8比值的動態(tài)變化，并進行化療前后、組織類型和TNM分期的對比分析。結(jié)果 化療后乳腺癌患者CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞比率降低，CD3、CD4、CD4/CD8值增高，CD8

2、、NK和B細胞亞群降低 ；調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量與臨床分期和組織分化程度有關(guān)。 結(jié)論 乳腺癌患者化療后的免疫調(diào)節(jié)抑制功能下降，免疫功能得到提高，但體液免疫及NK功能未見提高。關(guān)鍵詞 乳腺癌 化療 CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞 流式細胞術(shù)目前化療是乳腺癌的主要治療手段，也是規(guī)范化治療的重要組成部分。由于化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也會損害正常細胞包括免疫細胞，從而影響患者的免疫功能。CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性T細胞（T regulatory cell，Treg）是體內(nèi)重要的抑制性免疫調(diào)節(jié)T細胞，正常情況下主要參與維持免疫穩(wěn)定，抑制自身免疫疾病的發(fā)生；在腫瘤免疫耐受機制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用

3、1。本文通過檢測乳腺癌患者化療前后外周血CD4+CD25+ CD127-調(diào)節(jié)性T細胞及T淋巴細胞各亞群變化，分析化療對機體免疫功能的影響，探討Treg與腫瘤及臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)性,為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。1.1 研究對象 本組129例均為我院2009年2月-2010年12月經(jīng)病理確診的手術(shù)后乳腺癌患者，年齡2765歲，平均年齡（41.236.71）歲，無自身免疫疾病，治療前未使用過任何免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑等影響免疫功能的藥物。1.2 主要試劑及儀器 流式細胞儀EPICS XL為美國BECKMAN COULTER 公司產(chǎn)品。CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE、CD19-FITC

4、、CD16-FITC、CD56-PE 、CD3-PC5 、CD4-PC5、CD25-FITC CD127-PE熒光標記單克隆抗體、同型對照IgG1或IgG2熒光抗體、紅細胞裂解液等試劑均為美國貝克曼庫爾特（BECKMAN COULTER）公司出品。1.3 實驗方法 所有觀察對象均于化療前1天，化后1周清晨空腹抽取靜脈血2ml，EDTA-2K抗凝，使用直接免疫熒光標記法標記細胞并進行流式細胞儀分析。操作步驟：取不同熒光標記的單克隆抗體各2 0l分別加入100l EDTA-2K抗凝的外周血，室溫下孵育15分鐘，再加入紅細胞裂解液孵育10 分鐘，離心1500轉(zhuǎn)/5分鐘，加入PBS 2ml洗兩次，棄上

5、清后加入適量的PBS，混勻后上機檢測。1.4.化療藥物：采用紫杉類+蒽環(huán)類聯(lián)合化療。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，采用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計學(xué)差異確定為 p0.05。2.結(jié)果2.1 乳腺癌患者化療前后CD4+CD25+CD127-/CD4+T比率變化（見表1）：化療前患者調(diào)節(jié)性T細胞比率為4.651.38,化療后調(diào)節(jié)性T細胞為2.431.06，檢測結(jié)果顯示化療后調(diào)節(jié)性T細胞水平較化療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表1. 化療前后調(diào)節(jié)性T細胞比率變化分析對象 nCD4+CD25+CD127-/CD4+T %化療前患者化療后患者 129 1294.651.382

6、.431.06P 值0.012.2 乳腺癌患者化療前后淋巴細胞亞群數(shù)值的變化（見表2）： 表2 顯示，CD3、CD4、CD4/CD8化療后較化療前測定結(jié)果均增高，CD8、CD16/56 、CD19化療后較化療前均降低。組 別 n CD4 CD8 CD3 CD4/CD8 CD16+56 CD19化療前 129 36.54.9 29.59.0 65.9.7.8 1.200.33 13.97.6 8.15.6化療后 129 40.94.9 27.59.2 79.67.8 1.440.63 10.66.7 7.04.8P值 0.01 0.05 0.05 0.01 0.01 0.05表2 129例乳腺癌

7、患者治療前后淋巴細胞亞群的比較2.3 乳腺癌中CD4+CD25+CD127-/CD4+ T比率在不同組織學(xué)類型的變化（見表3）:結(jié)果顯示，惡性程度高的浸潤性導(dǎo)管癌CD4+CD25+CD127-/CD4+ %比率明顯高于惡性程度低的管內(nèi)癌（見表3）。表3 乳腺癌不同組織學(xué)類型Treg數(shù)值的比較組織類型 CD4+CD25+CD127-/CD4+T %浸潤性導(dǎo)管癌髓樣癌管內(nèi)癌 4.21 1.233.870.852.531.47P 值0.012.4乳腺癌在不同TNM分期中CD4+CD25+CD127-/CD4+ %比率變化 期明顯高于-期（見表4）。表4乳腺癌不同TNM分期中Treg數(shù)值的比較TNM分

8、期 CD4+CD25+CD127-/CD4+T %- 3.450.834.561.65 5.821.74P 值0.013.討 論乳腺癌是嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的常見惡性腫瘤之一,占我國各種惡性腫瘤的7% 10%2。研究表明腫瘤的發(fā)生與進展是腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的結(jié)果, 腫瘤通過釋放和誘導(dǎo)免疫抑制因子如IL-10、TGF-、IDO等；誘導(dǎo)抑制性免疫細胞如調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）、抑制性抗原呈遞細胞、抑制性CD4和CD8細胞等；抑制免疫細胞活化和效應(yīng)機制，如抑制CD28和HLA等分子表達，抑制r-干擾素等效應(yīng)分子表達和作用等。因此，免疫學(xué)機制在腫瘤發(fā)生與發(fā)展及抗腫瘤中都具有十分重要的作用

9、3-8。細胞免疫在腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用，而T淋巴細胞是細胞免疫的主要組成部分，具有多樣化的T淋巴細胞與功能亞群成份在免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮重要功能。根據(jù)T 淋巴細胞表面分化抗原(Cluster of differentiation ,CD) 分子的不同,可將T 細胞劃分為Th 細胞(CD3+CD4+)和Ts 細胞(CD3+CD8+) 。Th 細胞不僅可以分泌大量的細胞因子和輔助Ts 細胞殺傷腫瘤細胞,而且具有免疫記憶和直接殺傷腫瘤細胞的功能。Ts 細胞是效應(yīng)階段的免疫細胞,通過釋放效應(yīng)分子如穿孔素、顆粒酶、r-干擾素或促使細胞凋亡等機制殺傷靶細胞（如腫瘤細胞）。NK細胞是非抗原依賴性免疫效應(yīng)細胞,

10、它不經(jīng)致敏可直接殺傷敏感的腫瘤細胞。主要表面標志是CD16和CD56, CD16 表達于未成熟NK細胞表面,CD56 則在成熟NK細胞表面。這些免疫細胞形成了細胞免疫包括腫瘤免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，其數(shù)量和功能的改變將影響腫瘤免疫的發(fā)揮。本研究顯示:乳腺癌患者外周血總T 細胞（CD3）、Th細胞(CD3+CD4+)和CD4/CD8比值在化療后均高于化療前，提示化療明顯改變了體內(nèi)的免疫狀態(tài)，而Th細胞增高提示化療后腫瘤負荷減少，能一定程度恢復(fù)細胞免疫調(diào)控能力。一定比例的病人CD8細胞和NK細胞低于治療前，提示化療后免疫細胞亞群乃至功能有再分布，其免疫學(xué)和臨床意義有待于更深入研究。在諸多的腫瘤免疫逃

11、避相關(guān)機制中，調(diào)節(jié)性T細胞誘導(dǎo)增高和作用增強是最重要因素之一。CD4+CD25+Treg是一類具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細胞亞群 3，于1995年首次分離成功，是CD4+ T細胞的一個重要亞群 9-12。近年來的研究表明，許多腫瘤有Treg誘導(dǎo)增高現(xiàn)象。本研究顯示，乳腺癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞也有明顯增高現(xiàn)象，其增高程度與文獻報道結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌不同組織學(xué)類型中，Treg調(diào)節(jié)性T細胞的表達亦有所不同，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細為4.21 1.23，而在乳腺管內(nèi)癌CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞為2.531.47。兩

12、者相比，惡性程度高者其CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞水平明顯高于惡性程度低的管內(nèi)癌。在乳腺癌不同TNM分期中，CD4+CD25+CD127- 調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)值亦有不同：-期 Treg調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)值為3.450.83，期Treg調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)值為4.561.65， 期Treg調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)值為5.821.74。結(jié)果顯示Treg調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)值與TNM分期成正相關(guān)，與轉(zhuǎn)移及預(yù)后呈負相關(guān)。乳腺癌的惡性程度與Treg細胞數(shù)目之間存在著密切關(guān)系。引起Treg細胞數(shù)目增高可能的機制是，腫瘤細胞和腫瘤浸潤，刺激周圍的巨噬細胞釋放CCR4和H-鐵蛋白，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中CCR4+天然Tr

13、eg細胞數(shù)目增高。CCR4+天然Treg與PGE2的致耐受的DC接觸后，外周血中天然Treg轉(zhuǎn)化為記憶性Treg，導(dǎo)致外周血中Treg細胞數(shù)目增高。當Treg細胞增高后，聯(lián)合致耐受的DC，從而抑制效應(yīng)T細胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致機體抗腫瘤耐受13?；煂reg調(diào)節(jié)性T細胞的表達有顯著影響，129例中化療前患者CD4+CD25+CD127- Treg調(diào)節(jié)性T細胞的表達為 4.61.4，化療后患者Treg調(diào)節(jié)性T細胞的表達為3.41.3， P值0.01。上述結(jié)果提示，Treg細胞誘導(dǎo)增高也是乳腺癌誘導(dǎo)免疫耐受的機制之一，而動態(tài)觀察乳腺癌患者外周血CD4+CD25+Treg細胞水平，能一定程度預(yù)測腫瘤免疫耐

14、受作用。同樣，通過各種治療手段下調(diào)CD4+CD25+ Treg比例和抑制其作用將有利于機體腫瘤免疫功能的發(fā)揮，或許是一種有效地治療乳腺癌的新方法?？傊? 化療對腫瘤患者細胞免疫狀態(tài)能產(chǎn)生實際性影響，主要是提高了Th細胞的作用，但其免疫學(xué)和臨床意義有待于進一步研究。乳腺癌患者同樣有調(diào)節(jié)性T細胞的誘導(dǎo)增高，表明Treg也是乳腺癌誘導(dǎo)免疫耐受的機制之一。4.參考文獻1.Stephens LA, Barclay AN, Mason D. Phenotyp ic characterization of regulatory CD4 + CD25 + T cells in rats J . Int Imm

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